Expozícia výfukových plynov nafty mení výraz sietí podieľajúcich sa na neurodegenerácii v mozgu zebrafish, časť 1

Abstraktné

Neurodegeneratívne ochorenia sú hlavnou príčinou invalidity vo svete, ale ich etiológie zostávajú zväčša nepolapiteľné. Genetické faktory môžu pri väčšine týchto porúch zodpovedať len za menšinové riziko, čo naznačuje, že faktory životného prostredia zohrávajú významnú úlohu pri rozvoji týchto chorôb.

Neurodegeneratívne ochorenia označujú typ ochorenia, ktoré spôsobuje degeneráciu mozgových buniek z rôznych dôvodov. K bežným patrí Alzheimerova choroba, Parkinsonova choroba, Huntingtonova choroba atď. Tieto choroby postihujú neuróny v mozgu, čo má za následok zhoršenú funkciu mozgu a symptómy, ako sú pamäť, myslenie a zmeny správania.

Netreba však kvôli týmto chorobám stratiť náš pozitívny prístup. Existuje mnoho spôsobov, ako pomôcť pacientom zlepšiť pamäť a zmierniť príznaky. Pozrime sa na niektoré z týchto metód:

Najprv si zacvičte. Výskumy ukazujú, že fyzická aktivita zlepšuje krvný obeh v mozgu a zvyšuje uvoľňovanie chemikálií ako dopamín a endorfíny, ktoré pomáhajú chrániť a zlepšovať funkciu neurónov. Cvičenie môže zároveň pomôcť znížiť problémy, ako sú úzkosť, depresia a nespavosť, vďaka čomu budú pacienti príjemnejšie čeliť životu.

Po druhé, udržiavať sociálne vzťahy. Je tiež veľmi dôležité, že naše sociálne siete sú úzko prepojené so súvisiacimi oblasťami mozgu a sociálna interakcia môže nielen znížiť stres, ale aj zlepšiť zdravie mozgu zvýšením šťastia, bojom proti depresii a podobne.

Nakoniec sa dobre najedzte a doprajte si dostatok spánku. Oba tieto aspekty môžu mať významný vplyv na zdravie mozgu. Dobrá strava musí obsahovať nielen dostatok živín, ale tiež sa musí vyhýbať opakovanej konzumácii príliš veľkého množstva cukru, nasýtených tukov a cholesterolu. Navyše dostatok spánku môže pomôcť v boji proti problémom s pamäťou v rôznych štádiách, najmä chorobám, ako je Alzheimerova choroba.

Skrátka, neurodegeneratívne ochorenia neznamenajú vzdať sa očakávaní života. Pri zachovaní pozitívneho postoja je potrebné osvojiť si aj vedecké a účinné metódy na zlepšenie kvality života. Viac smiechu a viac slnka vám pomôže zostať zdravý. Je vidieť, že potrebujeme zlepšiť pamäť a Cistanche deserticola môže výrazne zlepšiť pamäť, pretože Cistanche deserticola je tradičný čínsky liečivý materiál, ktorý má mnoho jedinečných účinkov, jedným z nich je zlepšenie pamäte. Účinnosť Cistanche deserticola pochádza z viacerých aktívnych zložiek, ktoré obsahuje, vrátane kyseliny trieslovej, polysacharidov, flavonoidových glykozidov atď. Tieto zložky môžu podporovať zdravie mozgu rôznymi spôsobmi.

Kliknite na spoznajte 10 spôsobov, ako zlepšiť pamäť

Nedávno sa zistilo, že dlhodobé vystavenie znečisteniu ovzdušia zvyšuje riziko Alzheimerovej a Parkinsonovej choroby, ale molekulárne mechanizmy, ktorými pôsobí, nie sú dobre známe.

Zebrafishembryos vystavené extraktu z naftových výfukových častíc (DEPe) vedie k dysfunkčnej autofágii a strate neurónov. Tu sme vystavili embryá zebrafish DEPe a vykonali sme vysoko výkonné analýzy proteomickej a transkriptomickej expresie z ich mozgu, aby sme identifikovali patogénne dráhy vyvolané znečistením ovzdušia. Liečba DEPe zmenila niekoľko biologických procesov a signálnych dráh relevantných pre neurodegeneratívne procesy, vrátane metabolizmu xenobiotík, dozrievania fagozómov a spracovania amyloidu. Najväčšia indukcia génovej expresie v mozgu bola v Cyp1A (viac ako 30-násobok).

Relevantnosť tejto zmeny expresie bola potvrdená blokovaním indukcie pomocou CRISPR / Cas9, čo viedlo k dramatickému zvýšeniu citlivosti na toxicitu DEPe, čo potvrdzuje, že indukcia Cyp1A bola kompenzačným ochranným mechanizmom.

Tieto štúdie identifikovali narušené molekulárne dráhy, ktoré môžu prispievať k patogenéze neurodegeneratívnych porúch. V konečnom dôsledku určenie molekulárneho základu toho, ako znečistenie ovzdušia zvyšuje riziko neurodegenerácie, pomôže pri vývoji terapií modifikujúcich ochorenie.

Kľúčové slová

Znečistenie ovzdušia · Demencia · Parkinsonova choroba · Alzheimerova choroba · Transkriptomika ·Proteomika.

Úvod

Znečistenie ovzdušia je hlavným prispievateľom k úmrtnosti a spája sa s ochoreniami dýchacích ciest, srdcovými chorobami, mŕtvicou, rakovinou pľúc a cukrovkou. Objavujúce sa epidemiologické dôkazy podporujú súvislosť medzi vystavením znečisteniu ovzdušia a rozvojom neurodegeneratívnych ochorení, vrátane Alzheimerovej a Parkinsonovej choroby (AD a PD) (Fu et al. 2019). Existuje nedostatok výskumu, ktorý by skúmal mechanizmy, ktorými môže znečistenie ovzdušia zvýšiť riziko AD a PD, ale len málo tých, ktoré existujú, podporuje kauzálny vzťah (Fu et al. 2019).

Akumulácia proteínových inklúzií v mozgu je univerzálnym znakom neurodegeneratívnych porúch a je pravdepodobne bežnou cestou vedúcou k neuronálnej dysfunkcii a smrti. Napríklad tvorba štruktúr amyloidu-beta (A-beta) a tau sú patologickými znakmi agregátov AD a -synukleínu (-syn) alebo Lewyho teliesok pri PD (Ross a Poirier 2004; Woulfe 2008).

Zdá sa, že zmeny v proteostáze sú aspoň čiastočne základom tvorby týchto agregátov, ale presné mechanizmy sú stále neznáme a môžu sa u jednotlivcov líšiť v závislosti od genetických a environmentálnych rizikových faktorov. Vieme, že zvýšená expresia alebo znížená degradácia A-betaor -syn môže viesť k AD a PD (Bostancıklıoğlu2019; Johnson et al. 2019).

Ďalšími spoločnými znakmi neurodegeneratívnych porúch sú zápaly a oxidačný stres. Aktivované mikroglie, zápalové bunky v CNS, môžu byť ľahko ocenené pri pitvách mozgu s AD a PD a pravdepodobne prispievajú k patogenéze neurodegenerácie (Kannarkat et al. 2013). Predpokladá sa, že tento zápal a možno aj mitochondriálna dysfunkcia vedie k oxidačnému stresu, ktorý sa oceňuje aj pri pitvených mozgoch (Picca et al. 2020).

Väčšina mechanistických štúdií o znečistení ovzdušia a neurodegenerácii sa doteraz zamerala na zápal (Jayaraj et al. 2017). Zdá sa, že znečistenie ovzdušia zvyšuje zápal CNS aj oxidačný stres v mozgu zvierat a ľudí (Calderón-Garcidueñas a kol. 2004, 2007, 2008a, bac; Levesque a kol. 2011a, b, 2013; Moultonand Yang 2012; Mumaw a kol. 2017; Yokota a kol. 2013a, b).

Mimoriadne zaujímavé sú zistenia, že znečistenie ovzdušia zvyšuje expresiu niektorých zápalových génov v čuchovom bulbe (OB) myší, oblasti mozgu, kde sa patológia PD pozoruje veľmi skoro v priebehu ochorenia (Levesque a kol. 2011a, b; Yokota a kol. 2013a) . Zápal bol tiež pozorovaný u psov žijúcich v mestských oblastiach v porovnaní s tými, ktorí žili vo vidieckych oblastiach, a autori špekulovali, že tieto zmeny boli spôsobené vysokou úrovňou znečistenia ovzdušia (Calderón-Garcidueñas et al. 2003).

Tí istí autori tiež navrhli, že -syn sa nahromadil v mozgoch ľudí žijúcich v mestách v dôsledku znečistenia ovzdušia (Calderón-Garcidueñas et al. 2004, 2008a,b). V nedávnej štúdii na modeli zebrafish bolo hlásené, že vystavenie DEPe spôsobuje neurotoxicitu a významné zníženie počtu neurónov narušením autofágie (Barnhill et al. 2020).

DEPe obsahuje mnoho toxických zložiek znečistenia ovzdušia a bežne sa používa na modelovanie expozície v systémoch bunkových kultúr (Costa a kol. 2014; Hesterberg a kol. 2010; Levesque a kol. 2011b). Autofágia je nevyhnutným intracelulárnym mechanizmom na odstránenie a eradikáciu nesprávne poskladaných proteínov a poškodených organel.

Presná autofagická aktivita je skutočne nevyhnutná pre bunkovú homeostázu a dysfunkčná autofágia v neurónoch vedie k zmenenému prežívaniu a neurodegenerácii (Kesidou et al. 2013). V mnohých z týchto štúdií existujú jasné obmedzenia, ale všetky naznačujú, že vystavenie znečisteniu ovzdušia zvyšuje riziko AD a PD. Naše chápanie mechanizmov, ktorými znečistenie zvyšuje toto riziko, je obmedzené, ale ultrajemné častice a viaceré zložky znečistenia ovzdušia sa môžu dostať do mozgu buď priamo cez čuchový bulbus alebo cez pľúca cez krvný obeh (Kilian a Kitazawa 2018).

Tieto častice sa skladajú z uhlíkového jadra a adsorbovaných zlúčenín, ako sú polycyklické aromatické uhľovodíky, kovy, dusičnany, sírany a ďalšie prvky a tvoria významný podiel látok znečisťujúcich ovzdušie, najmä v mestských oblastiach. Mnohé z týchto zlúčenín sa podieľajú na inoxidačnom strese a bunkovej toxicita pridávajúca vierohodnosť k kauzálnej asociácii znečistenia ovzdušia a neurodegenerácie.

Podrobné multidisciplinárne výskumy, vrátane bunkových a zvieracích modelov, môžu poskytnúť pohľad na príčiny chorôb a priame budúce terapeutické prístupy (Cannon a Greenamyre 2011). Medzi modelovými organizmami používanými na štúdie in vivo je Danio rerio (zebrafish) výkonným modelom na štúdium toxikológie, molekulárnej genetiky, toxikogenomiky a objavovania liekov.

Väčšina biologických dráh je u stavovcov vysoko konzervovaných a väčšina funkčných ľudských génov má homológy u zebričiek (Vaz et al. 2018). Okrem toho sa embryá zebričiek vyvíjajú rýchlo a nezávisle, čo umožňuje analýzu v akomkoľvek požadovanom vývojovom štádiu. Tieto vlastnosti spolu s rýchlou reprodukciou a nízkymi nákladmi na chov robia zebričku vhodným modelom na štúdium toxických účinkov environmentálnych expozícií.

Na lepšie pochopenie molekulárnych mechanizmov, ktoré stoja za patogenézou ochorenia, bola vyvinutá široká škála vysoko výkonných prístupov profilovania génovej expresie. Proteomika založená na hmotnostnej spektrometrii a vysokovýkonné sekvenovanie RNA sú obzvlášť sľubné pri identifikácii záujmových biologických dráh. Tieto techniky sa široko používajú na pochopenie reakcie bunkových a zvieracích modelov na environmentálne stimuly (Duan et al. 2017; García-Estrada et al. 2013; Jamiet al. 2014a, b, 2015; Kosalková et al. 2012).

V tejto štúdii sme sledovali expresné analýzy účinkov liečby DEPe na proteómové aj transkriptómové profily v hlavách zebrafishembryov. Izolácia vzoriek z hlavy, ktorá sa skladá hlavne z mozgového tkaniva, umožnila získať viac tkanivovo špecifických profilov a minimalizovať defekty pochádzajúce z iných tkanív. Opisujeme tu zmenenú génovú expresiu a proteínové profily v niekoľkých dráhach zapojených do neurodegenerácie v hlavách zebričiek vystavených DEPe. Tieto výsledky poskytujú nový pohľad na možné mechanizmy, ktorými znečistenie ovzdušia zvyšuje riziko AD a PD.

materiál a metódy

Ošetrenie rýb a geneknockdown{0}}sprostredkovaný CRISPR/Cas

Všetky štúdie boli schválené Výborom pre práva zvierat UCLA. Zebrafish (AB) boli chované svetelnou stimuláciou počas 1 hodiny a celkový počet 200 vajec bolo inkubovaných počas 24 hodín pri 28 stupňoch. Výsledné embryá boli zbavené pronázy (2 mg/ml) a ošetrené buď DEPe (štandardné referenčné materiály, NIST, Gaithersburg, MD) v konečnej koncentrácii 20 ug/ml alebo vehikulom do 5 dní po oplodnení (DPF).

Táto koncentrácia bola zvolená, pretože viedla k strate neurónov, ako sa uvádzalo predtým, ale bez významnej úmrtnosti (Barnhillet al. 2020). ) bol navrhnutý na základe umiestnenia vhodných miest PAM v prvom exóne génu Cyp1A.

Najlepší dizajn bol zakúpený od IDT DNA (www.idtdna.com) spolu so štandardným CRISPR-Cas9 tracrRNA. crRNA pre Cyp1Agene a tracrRNA boli oddelene resuspendované v 10 mM Tris-EDTA, čím sa získala konečná koncentrácia 100 uM. Potom sa tracrRNA spojila s crRNAin 1x duplexným tlmivým roztokom (100 mM octan draselný; 30 mM HEPES, pH 7,5; IDT DNA), čím sa získala konečná koncentrácia 10 uM. Zmes sa zahrievala na 95 stupňov počas 5 minút vo vriacom vodnom kúpeli a pomaly sa ochladila na teplotu miestnosti, aby sa umožnilo anelovanie komplementárnych nukleotidových sekvencií incrRNA a tracrRNA a tvorba funkčnej vodiacej RNA (gRNA).

Objem 3 μl annealedgRNA sa potom skombinoval s rovnakým objemom donorovej jednovláknovej DNA (ssDNA; 200μM) ako sekvencia šablóny pre mutant Cyp1A. Množstvo 3 ug Cas9 nukleázy (IDT) v 1x injekčnom pufri (5 mM KCl; 0,1 M fosforečnan sodný, pH 6,8) sa pridalo do zmesi, aby sa vytvorili finálne komplexy CRISPR/Cas9ribonukleoproteín (Cyp1A-RNP).

Na prípravu Scramble RNP (SC-RNP) bola špecifická Cyp1A-crRNA nahradená komerčnou Scramble-crRNA bez cieľa na genóme. Táto sekvencia všetkých oligonukleotidov použitých v tejto práci je uvedená v doplnkovej tabuľke 1. Vajcia boli injikované pod stereomikroskopom s približne 3 nL injekčnej zmesi RNP.

Uskutočnilo sa päť biologických replikačných injekcií (každá replikácia zahŕňala 400–600 vajíčok injikovaných Cyp1A-RNP a 100–200 injikovaných SC-RNP) a všetky mikroinjekcie boli dokončené do 60 minút. Vajíčka boli umiestnené do 100 mm plastových Petriho misiek a inkubované pri 28 stupňoch vo vaječnej vode. Miera prežitia embryí bola monitorovaná až 7 dní.

Snímky prežívajúcich rýb boli posúdené na hodnotenie malformácií. Každá larva bola zaslepeným spôsobom hodnotená na prítomnosť 4 vývojových malformácií vrátane malformácie hlavy, malformácie chvosta, srdcového edému a edému žĺtka. Larvy so všetkými 4 malformáciami by boli ohodnotené 4, zatiaľ čo normálne sa vyvíjajúce larvy by dosiahli skóre 0. Na vyhodnotenie signifikantných rozdielov bol použitý štatistický T-test.

For more information:1950477648nn@gmail.com