Expozícia výfukových plynov nafty mení výraz sietí podieľajúcich sa na neurodegenerácii v mozgu zebrafish, časť 2
Mar 04, 2024
Príprava vzorky proteínu
Na prípravu proteínových vzoriek sa hlavy 80 až 100 anestetizovaných lariev (5 pdf) starostlivo izolovali a premyli PBS pred prenesením do lyzačného pufra, ktorý pozostával z 15 % predchladenej TCA/acetón s obsahom 0,07 % beta-merkaptoetanolu (ME )a koktail inhibítora proteázy (potrebuje výrobca) v celkovom objeme 500 ul.
V posledných rokoch sa prejavil značný záujem o účinky vzoriek bielkovín na pamäť. Čoraz viac ľudí si začína uvedomovať dôležitosť stravy pre zdravie, najmä dôležitú úlohu bielkovín v ľudskom tele.
Bielkoviny sú základným stavebným materiálom ľudského tela a zohrávajú v ľudskom tele dôležitú úlohu. Z tohto dôvodu sa vzorky bielkovín stali dôležitým kanálom pre mnohých ľudí pri ich snahe o zdravie a krásu. Okrem budovania svalov a tvarovania tela môžu vzorky bielkovín zlepšiť aj pamäť človeka.
Niektorí vedci skúmali vzťah medzi bielkovinami a pamäťou. Zistili, že dlhodobý príjem dostatočného množstva bielkovín je prospešný pre všetky aspekty fyzického zdravia, najmä pre pamäť. Pribúdajú dôkazy o tom, že príjem bielkovín v strave má dôležitý vplyv na funkciu mozgu a pamäť.
Proteín je dôležitou súčasťou neurónov v ľudskom mozgu, takže denný príjem bielkovín má dôležitý vplyv na ľudskú pamäť a schopnosť myslenia. Dlhodobý príjem bielkovín nielen pokryje bielkovinové potreby tela, ale pomáha aj mozgu zostať aktívnym a zdravým.
Okrem toho bielkoviny môžu tiež pomôcť telu udržiavať rovnováhu krvného cukru a udržiavať stabilnú náladu. To je veľmi dôležité pre udržanie pamäti a myslenia. Preto mierny príjem bielkovín môže pomôcť zlepšiť rôzne kognitívne funkcie a emocionálne stavy ľudského tela.
Celkovo existuje silný vzťah medzi vzorkami bielkovín a pamäťou. Zvýšenie príjmu bielkovín pomáha udržiavať zdravý mozog a telo, zlepšuje myslenie a pamäť. Pre ľudí, ktorí si potrebujú zlepšiť pamäť, je veľmi potrebné konzumovať primerané množstvo bielkovín. Proteínové jedlá by sme mali jesť primerane a dbať na rozumné jedlá, aby sme si udržali zdravé telo a bystrú myseľ. Je vidieť, že potrebujeme zlepšiť pamäť a Cistanche deserticola môže výrazne zlepšiť pamäť, pretože Cistanche deserticola má antioxidačné, protizápalové a anti-aging účinky, ktoré môžu pomôcť znížiť oxidačné a zápalové reakcie v mozgu, čím chránia zdravie nervového systému. Okrem toho môže Cistanche deserticola tiež podporovať rast a opravu nervových buniek, čím zvyšuje konektivitu a funkciu neurónových sietí. Tieto účinky môžu pomôcť zlepšiť pamäť, rýchlosť učenia a myslenia a môžu tiež zabrániť rozvoju kognitívnej dysfunkcie a neurodegeneratívnych ochorení.
Kliknite na vedieť doplnky na zlepšenie pamäte
Po krátkej homogenizácii sa proteíny zrážali počas 12 hodín pri 20 stupňoch, potom nasledovala centrifugácia pri 12,000 otáčkach za minútu počas 5 minút pri 4 stupňoch. Supernatant sa odstránil a proteínová peleta sa dvakrát premyla studeným acetónom (obsahujúcim 0.07 % ME a koktaily inhibítora proteázy). Konečná proteínová peleta sa rozpustila v lyzovacom pufri obsahujúcom 7,0 M močovinu, a 2,0 M tiomočoviny sonikáciou na ľade.
Vzorky rozpusteného proteínu sa centrifugovali pri 15, 000 otáčkach za minútu počas 10 minút pri 4 stupňoch, aby sa vyzrážali nerozpustné častice, a koncentrácia finálnych vzoriek proteínu sa merala pomocou Bradfordovej metódy.
Vysokovýkonná proteomická analýza založená na TMT
Vzorky boli redukované, alkylované a štiepené postupným pridávaním trypsínu a lys-C proteáz. Peptidy sa potom označili pomocou izobarických značiek 10-plexTMT podľa pokynov výrobcu. Označené vzorky sa zmiešali a potom jemne frakcionovali pomocou chromatografie s reverznou fázou s vysokým pH.
Jednotlivé frakcie sa potom analyzovali pomocou LC–MS/MS s použitím online chromatografie s reverznou fázou a tandemovej hmotnostnej spektrometrie na hmotnostnom spektrometri Thermofsher Fusion Lumos. Údaje sa získali pomocou metódy MS3 založenej na synchrónnej selekcii prekurzorov, ako už bolo opísané (McAlister et al. 2014). Vyhľadávanie v databáze a extrakcia informácií o reportérových iónoch TMT sa uskutočnila pomocou softvérovej platformy MaxQuant (Cox a Mann 2008).
Porovnanie údajov TMT naprieč vzorkami sa uskutočnilo pomocou MSStats (Choiet al. 2014). Transkriptomická analýza Z anestetizovaných embryí sa izolovalo približne 80–100 hláv (120 h), premyli sa PBS a podrobili sa celkovej extrakcii RNA pomocou Trizol (Sigma Aldrich, Saint Louis , USA) činidlo podľa pokynov výrobcu.
Kvalita a kvantita RNA boli hodnotené pomocou spektrofotometra NanoDrop2000 (Thermo Scientific, MA) a ďalej pomocou Agilent 2100 Bioanalyzer, aby sa zabezpečila minimálna koncentrácia 50 ng/ul a číslo RNAintegrity (RIN) 8. Potom sa uskutočnila príprava knižnice pomocou Illumina HiSeq4000ac protokol: „Pracovný postup prípravy celkovej knižnice RNA TruSeqStranded s Ribo-Zero Gold“ a vzorky boli sekvenované podľa nasledujúcich podmienok: „Párový koniec cyklu, R1=75 cykly (antisense reťazec), Index=8 cykly, R2=75 cykly (reťazec snímania).“
Analýza dát
Obidva súbory údajov pre proteomické a transkriptomické štúdie boli súčasne nahrané a analyzované pomocou online nástroja Metascape, ktorý umožňuje anotáciu génov pre rôzne druhy vrátane Danio rerio (Zhou et al. 2019). Na vyhodnotenie príspevku zmeny profilu proteómu alebo transkriptómu v špecifických dráhach boli údaje analyzované pomocou softvéru Ingenuity Pathways Analysis (IPA) (Krämer et al. 2014).
Súbory údajov obsahujúce génové alebo proteínové identifikátory a zodpovedajúce hodnoty expresie boli nahrané do aplikácie. Každý identifikátor bol namapovaný na príslušný objekt v databáze znalostí Ingenuity.
Na identifikáciu molekúl, ktorých expresia bola rozdielne regulovaná, bola nastavená hranica zmeny expresie 1.3-násobok. Funkčná analýza identifikovala biologické funkcie a/alebo choroby, ktoré boli najvýznamnejšie v súbore údajov. Na analýzu sa zvážili molekuly zo súboru údajov, ktoré spĺňali hraničnú hodnotu a boli spojené s biologickými funkciami. Na výpočet p-hodnoty určujúcej pravdepodobnosť, že každá biologická funkcia a/alebo choroba priradená k tomuto súboru údajov je spôsobená len náhodou, sa použil presný test Right-tailed Fisher.
Analýza dráhy
Na vyhodnotenie príspevku zmien profilu proteómu alebo transkriptómu v špecifických dráhach sa oba súbory údajov nahrali do softvéru IPA (Krämer et al. 2014). Najdôležitejšie zmenené kanonické dráhy sa potom ďalej hodnotili a interpretovali pomocou PCR a Western blotting, ako je opísané nižšie.
Western blotting
Celkom 25 ug proteínov sa nanieslo na 12 % NuPAGE (Novex, CA) a prenieslo sa na PVDF membrány (Novex, CA), ako je opísané (MahmoudianSani et al. 2017; Rafee et al. 2019). Membrány boli blokované 5 % odstredeným mliekom v Tris-pufrovanom fyziologickom roztoku a 0,01 % Tween 20 (tlmivý roztok TBST) počas 30 minút pri izbovej teplote a potom inkubované cez noc pri 4 stupňoch buď s králičou polyklonálnou anti-Cyp1A1 (Abcam, CA) alebo myšou monoklonálnou anti-GAP Abcam, CA), zriedený v TBST pufri obsahujúcom 1 % odstredeného mlieka.
Po premytí v TBST boli bloty inkubované so sekundárnymi oslími anti-králičími HRP (Abcam, CA) alebo kozími anti-myšími HRP (Santa Cruz, CA) protilátkami počas 2 hodín, po čom nasledovalo vyvinutie s Pierce™ ECL Plus western blotting substrátom ( Thermo Fisher Scientific, USA). Pásy boli vizualizované zobrazovaním pomocou LI-COR skenera a analyzované denzitometriou (LI_COR Biosciences, NE).
PCR v reálnom čase
Celková RNA sa izolovala z hláv pomocou činidla TRIzol (Sigma Aldrich, Saint Louis, USA) podľa pokynov výrobcu a potom sa zmerala pomocou spektrofotometra NanoDrop 2000 (Thermo Scientific, MA). Množstvo 1 ug každej vzorky RNA sa reverzne prepísalo pomocou supermixu reverznej transkripcie iScript™ (Bio-Rad, CA) a PCR v reálnom čase sa uskutočnilo pomocou supermixu SsoAdvancedUniversal SYBR Green (Bio-Rad, CA) a priméry sú uvedené v doplnkovej tabuľke 1. Relatívne hladiny expresie sa vypočítali pomocou metódy 2-ΔACT a na vyhodnotenie významných rozdielov sa použil štatistický T-test.
Výsledky a diskusia
Proteomické a transkriptomické analýzy sú dva hlavné nástroje na pochopenie molekulárnych mechanizmov, ktoré sú základom chorobných procesov a reakcie na environmentálne podnety (Duan a kol. 2017; García-Estrada a kol. 2013; Jami a kol. 2014a, b, 2015; Kosalková a kol. 2012) . Tu sme vykonali hlboké analýzy expresie na transkriptomických aj proteomických úrovniach v hlavách embryí zebričiek vystavených DEPe.
Hlavy, zložené prevažne z mozgového tkaniva, boli izolované, aby sa eliminovali expresné profily iných tkanív, pretože nás zaujíma určenie vnútorných patologických dráh CNS.
Výrazový profil hláv zebrafishembryos
Analýza profilu poskytla 11 172 detegovaných proteínov a 14 748 cieľových mRNA z viac ako 26 000 kódujúcich génov (Howe et al. 2013). Spomedzi 11 172 proteínov identifikovaných zo vzoriek označených TMT (doplnková tabuľka 2) bolo 141 proteínov významne upregulovaných a 607 bolo downregulovaných (doplnková tabuľka 3 a obr. 1a). Podobne bolo 367 transkriptov upregulovaných a 149 bolo downregulovaných spomedzi 14 748 transkriptov (doplnková tabuľka 4) detegovaných v analýze RNA-seq (obr. 1b a doplnková tabuľka 5).
Vo väčšine prípadov boli zistenia z upregulovaných proteomických a transkriptomických analýz konzistentné. Napríklad špičkové vysoko regulované proteíny zahŕňajú cytochróm P450 Cyp1a, Cyp1c1, proteínovú podjednotku gama viažucu guanínnukleotid, Annexin, krátku izoformu plexínu B2b, člen dehydrogenázy/reduktázy (rodina SDR) 13-ako 1, S-antigén sietnice/šišinky (arestín) b a sulfotransferáza6B1.
Podobne gény s najvyššou transkriptomickou reguláciou zahŕňajú cytochróm P450 (Cyp1a), chemokín (C-C motív) ligand 27a, aryl-uhľovodíkový receptorový represor A, cytochróm P450 (Cyp1b) a glykoproteín Rh rodiny C. Na druhej strane downregulované proteíny a transkripty neboli vždy vysoko korelované.
Napríklad komplex 2, spektrín alfa, ľahký reťazec srdcového myozínu-1, proteín interagujúci so SEC23, membránová podjednotka ATPsyntázy EA, cytochróm b a proteín deacetyláza závislá od NAD patria medzi top vysoko downregulované proteíny, zatiaľ čo membránový proteín 1a segmentu sietnice. , rodina nosičov rozpustených látok 5 (jodidový transportér), homológ B vírusového onkogénu vírusového osteosarkómu FBJ, komplexín 4c, antigén podobný FOS 1a, opsín 1 a v-fos vykazujú najvyššiu downreguláciu transkripcie (tabuľky 1 a 2).
Protilátky rozpoznávajúce proteíny zebrafish sú obmedzené, ale potvrdili sme vzorku týchto zmien pomocou analýzy Western blot. Upregulácia Cyp1A proteínu a downregulácia komplexínu 2 (CPLX2) boli potvrdené použitím GAPDH ako kontroly zaťaženia (obr. 2a). Vyššie hladiny TAT a transkripcie UGT1B1 a nižšie hladiny CHNRB a TH2 boli tiež potvrdené qPCR s použitím Elf-alfa ako vnútornej kontroly (obr. 2b).
Génová anotácia
Existuje niekoľko online bioinformatických nástrojov a softvéru, ktoré môžu poskytnúť užitočné informácie o anotácii génov. Medzi nimi bol v tejto práci použitý Metascape so schopnosťou anotácie génu pre Danio rerio (Zhouet al. 2019).
Oba súbory údajov pre proteomické a transkriptomické štúdie boli súčasne nahrané a analyzované pomocou tohto online nástroja. Po skombinovaní výstupu proteomických a transkriptomických zmien v softvéri, niekoľko procesov, ako je reakcia na xenobiotický stimul, metabolizmus xenobiotík cytochrómom P450 a cirkadiánna regulácia génovej expresie sa zistilo, že sú indukované po liečbe DEPe (obr. 3a).
Táto analýza tiež naznačila potlačené úrovne biologických procesov, ako je „vizuálne vnímanie“, „fototransdukcia“ a „internalizácia receptora spojeného s G proteínom“. Zmeny v profiloch expresie súvisiacich s videním neboli neočakávané, pretože liečba DEPe počas skorého vývoja viedla k menším očiam (údaje nie sú uvedené).
Signalizácia metabolizmu xenobiotík
Xenobiotiká, ktoré sú cudzorodými prírodnými alebo syntetickými chemickými zlúčeninami, môžu spustiť bunkovú stresovú reakciu, ktorá vedie k diferenciácii, proliferácii, apoptóze alebo nekróze. Telo sa totiž potrebuje aktívne chrániť pred xenobiotikami, ale aj toxickými endogénnymi zlúčeninami a ich metabolitmi prostredníctvom expresie enzýmov a transportérov podieľajúcich sa na ich eliminácii a detoxikácii.
Tieto enzýmy sú klasifikované do troch skupín: enzýmy fázy I (CYP, ALDH, FMO), ktoré zavádzajú polaritu do xenobiotík; Enzýmy fázy II (UGT, GST, SULT), ktoré zavádzajú hydrofilitu prostredníctvom konjugácie hydrofilných molekúl, ako je sulfát, kyselina glukurónová a glutatión s xenobiotikami; a enzýmy fázy III (MDR1, OATP2, MRP), ktoré transportujú xenobiotiká alebo konjugáty vytvorené počas fázy II do extracelulárnej oblasti.
Tieto enzýmy sú indukované prostredníctvom signálnych kaskád zahŕňajúcich špecifické receptory (CAR, PXR, AHR) a aktiváciu transkripčných faktorov sprostredkovanú MAPK (NRF2, MAF) (Omiecinski et al. 2011).
V neprítomnosti aktivátorov sa konštitutívne aktívny receptor (CAR) nachádza v komplexe cytoplazmy asa s CCRP a HSP90. Ale keď je prítomný aktivátor, CAR sa translokuje do jadra a viaže sa na RXR za vzniku heterodiméru a ďalej sa viaže na niekoľko variantov opakujúceho sa motívu, ako je DR3, DR4, ER6 a ER8, a prispieva k regulácii génovej expresie (doplnková tabuľka 2).
Naša proteomická analýza odhalila aktiváciu metabolizmu xenobiotík. Jasná upregulácia CYP1A1, CYP3A7, HMOX1 (hémová oxygenáza 1), CAT (kataláza) a CES1 (karboxylesteráza 1) skutočne ukazuje indukciu metabolizmu fázy I, zatiaľ čo zvýšená expresia UGT1A1 (UDP glukuronozyltransferáza člen A1 rodiny 1) a GSTP1 ( glutatiónS-transferáza pi 1) indikuje aktiváciu metabolizmu fázy II.
Je zaujímavé, že downregulácia sulfotransferáz, ako je SULT1A1 (člen 1 sulfotransferázovej rodiny), SULT1C2 (člen 2 sulfotransferázovej rodiny 1C) a SULT2B1 (člen 1 sulfotransferázovej rodiny 2B), naznačuje, že zvýšenie hydrofility v metabolizme fázy II má tendenciu prednostne prebiehať prostredníctvom konjugácie s kyselinou glukutánthiovou , ale nie sulfátová konjugácia (obr. 4).
Výsledky transkriptomickej štúdie sú celkom konzistentné, pretože CYP1A, CYP1B, CYP3A7, GSTO1, GSTP1 a UGT1A1 sú všetky upregulované na úrovni RNA. SULT2B1 však vykazuje upreguláciu na úrovni RNA (zatiaľ čo je nedostatočne zastúpená na úrovni proteínov).
Môže to byť spôsobené zapojením iných mechanizmov, ktoré vyvolávajú degradáciu alebo inaktiváciu enzýmov sulfát transferázy po liečbe DEPe. Obzvlášť prekvapujúce je, že tieto zmeny v metabolizme xenobiotík sa vyskytli v hlavách (pravdepodobne mozgoch) rýb. Expresia xenobiotických génov bola opísaná v nervovom systéme cicavcov, ale toto je prvá správa o nich v mozgoch zebričiek (McMillan a Tyndale 2018).
Tieto zistenia sú v súlade s podobnou štúdiou vykonanou Shankarom a spolupracovníkmi, ktorí testovali účinky rôznych skupín environmentálnych polycyklických aromatických uhľovodíkov (PAH) na vývoj embryí a ďalej hodnotili vplyv každého liečebného režimu na profil transkriptómu.
Na celom tele 48 hpost-fertilizačných (hpf) embryí ukázali, že upregulácia Cyp1a na úrovni transkripcie aj proteínu je skorým spoľahlivým biomarkerom aktivácie xenobiotickej AHR a následných transkriptomických zmien (Shankar et al. 2019).
NRF2-sprostredkovaná reakcia na oxidačný stres
Oxidačný stres môže spustiť apoptózu a nekrózu a predpokladá sa, že sa podieľa na neurodegenerácii (Ahmadinejad a kol. 2017; Jami a kol. 2014b, 2015). Hlavnou bunkovou obrannou reakciou na oxidačný stres je indukcia antioxidačných a detoxikačných enzýmov.
Nukleárny faktor-erytroidný 2-faktor 2 (Nrf2) sa viaže na promótorové antioxidačné prvky (ARE) a aktivuje ich transkripciu. Neaktívny Nrf2 je spojený s proteínom viažucim aktínKeap1 a je zadržiavaný v cytoplazme.
Nrf2, vyvolaný oxidačným stresom, je fosforylovaný v reakcii na dráhy proteínkinázy C, fosfatidylinozitol 3-kinázy a MAP kinázy. Fosforylovaný Nrf2 sa potom môže premiestniť do jadra a viazať ARE na transaktiváciu detoxikačných a antioxidačných enzýmov (doplnková tabuľka 3) (Ma 2013).
For more information:1950477648nn@gmail.com
