Modelovanie chorôb pomocou obličkových organoidov

Abstrakt:Ochorenia obličiekčasto nemajú optimálnu liečbu, čo spôsobuje milióny úmrtí každý rok. Teda vývoj vhodných modelových systémov na štúdiumochorenie obličiek človekaje nanajvýš dôležité. Niektoré z najsľubnejších modelov ľudských obličiek sú organoidy alebo tkanivové kolektívy pripomínajúce malé orgány, odvodené z pluripotentných kmeňových buniek vyvolaných človekom (hiPSC). Sú však skôr podobné prvému trimestrufetálna obličkaako dospelá oblička. Preto sú potrebné nové stratégie na predĺženie ich zrelosti. Majú veľký potenciál pre modelovanie chorôb a prípadne pomocnú terapiu, ak môžu dosiahnuť zrelosť andospelá oblička. V tomto prehľade budeme diskutovať o súčasnom stave obličkových organoidov z hľadiska ich podobnosti s ľudskou obličkou a doteraz používaného ako systém modelovania chorôb. Potom budeme diskutovať o možných spôsoboch napredovaniazrelosť obličiekorganoidy, aby zodpovedali dospelej obličke pre presnejšie modelovanie ľudských chorôb.

Kľúčové slová: organoidy;obličky; rozvoj; metanefros; močovodu; tubul; čip; nefrológia; modelovanie chorôb

KLIKNITE SEM A ZÍSKAJTE CISTANCHE PRE LIEČBU CKD

1. Úvod

Až donedávna boli ľudské choroby modelované dvoma nasledujúcimi spôsobmi: pomocou zvierat alebo pomocou dvojrozmernej bunkovej kultúry. Zvieracie modely umožňujú študovať dráhy chorôb a vývoj liečiv v celých organizmoch, ale nezohľadňujú genetickú a anatomickú štruktúru človeka. Na druhej strane kultúra ľudských buniek umožňuje vedcom študovať mechanizmy chorôb špecifických pre človeka a hodnotiť liečbu do veľkej a presnej molekulárnej hĺbky. Bunková kultúra však nerekapituluje zložitú trojrozmernú štruktúru a fyziológiu orgánu.

Ľudské organoidy sú zjednodušené verzie ľudských orgánov s realistickou trojrozmernou mikroanatómiou a funkciami na úrovni orgánov (napr. produkcia sĺz v lakteálnych organoidoch a rast vlasov v organoidoch kože) [1,2]. Prostredníctvom procesov samoorganizácie sa in vitro získavajú z tkanivových buniek alebo pluripotentných kmeňových buniek. Indukované pluripotentné kmeňové bunky (iPSC), ktoré v roku 2008 vynašli Takahashi a Yamanaka, sú najobľúbenejšie bunky na tvorbu organoidov [3]. Je to spôsobené niekoľkými presvedčivými výhodami, ktoré iPSC ponúkajú. Po prvé, poskytujú neobmedzený obnoviteľný bunkový zdroj a môžu sa rozlíšiť na viacero typov buniek. Ešte dôležitejšie je, že predstavujú základné genetické zloženie pacientov. Ľudské iPSC (hiPSC) odvodené od pacienta sa teda môžu použiť na štúdium choroby prostredníctvom organoidov na individuálnej úrovni, čo umožňuje pokrok v personalizovanej medicíne. Doteraz sa na štúdium chorôb používali organoidné modely rôznych ľudských orgánov, ako je srdce a mozog. V tomto prehľade sa zameriame na obličkové organoidy a budeme diskutovať o tom, ako ich možno použiť na modelovanie ľudských obličiek a s nimi spojených chorôb, na skríning toxicity liekov a možno na doplnenie funkcie obličiek.

Ochorenie obličiek postihuje 10 % svetovej populácie [4]. Napriek identifikácii základnej genetickej príčiny mnohých foriem ochorení obličiek nie sú k dispozícii žiadne optimálne terapie na ich zvládnutie. Táto nešťastná situácia odráža nedostatok in vitro modelových systémov, ktoré rekapitulujú ochorenie ľudských obličiek pre cielený terapeutický vývoj. Organoidy obličiek ponúkajú ľudskú, prispôsobiteľnú, 3-D výskumnú platformu na skúmanie genetických ochorení obličiek, poškodenia obličiek a toxicity liekov. Spolu so svojou schopnosťou slúžiť ako modelovací systém má obličkový organoid potenciál na pokrok v transplantačnej medicíne. Aby sa teda maximalizoval svoj potenciál v oboch týchto oblastiach, musí sa obličkový organoid podobať štruktúre a funkcii obličiek dospelého človeka. Tu preskúmame súčasný stav organoidu ľudskej obličky odvodeného z pluripotentných buniek, jeho potenciálne využitie a oblasti na zlepšenie.

2. Ľudská oblička vs. obličkové organoidy

HiPSC slúžia ako proxy pre embryonálne PSC. Vytvorenie obličkového organoidu z hiPSC teda znamená replikáciu ľudského embryonálneho vývoja obličiek. Nižšie preskúmame, ako sa obličkový organoid vyvíja a porovnáme ho s ľudskou obličkou.

2.1. Vývoj ľudských obličiek

Krv sa filtruje v troch odlišných fázach počas embryonálneho vývoja. V prvej fáze sa v 4-týždňovom ľudskom embryu vyvinie štruktúra nazývaná pronephros a spracováva krv v krčnej oblasti približne do 5. týždňa [5]. Ďalej sa v hrudnej oblasti embrya tvorí mezonefros a filtruje krv od začiatku 5. týždňa do približne 10. týždňa embryonálneho vývoja. Zatiaľ čo mezonefros filtruje krv, konečný filtračný systém, ktorý sa nakoniec stanedospelá oblička, sa začína vytvárať (obrázok 1). Tvorí sa v nasledujúcich dvoch častiach: metanefrický mezenchým a ureterický pupen. Metanefrický mezenchým tvorí všetky časti nefrónu okrem zberného kanálika, zatiaľ čo ureterický pupeň tvorí zberný kanál. Tieto štruktúry prechádzajú recipročným indukčným cyklom, v ktorom metanefrický mezenchým a ureterický pupen stimulujú vzájomný rast a spájajú sa a vytvárajú štruktúru nazývanú metanefros. Novovytvorené metanefroi filtrujú krv z iliakálnych vetiev smerom nadol do oblasti panvy. Súčasne sa pupen močovodu rozdvojuje a pokračuje vo vetvení, čím sa v obličke vytvorí množstvo zberných kanálikov [6,7]. Následne tieto fúzované metanefrické štruktúry stúpajú do brušnej oblasti embrya, ako sa vyvíja, a vytvárajú prívod krvi z primitívnej aorty. Tieto procesy sú zhrnuté na obrázku 1. Je dôležité poznamenať, že bunky metanefrického mezenchýmu a ureterických pupenov sú primitívne, a preto si zachovávajú multipotentný potenciál, zatiaľ čo dospelé diferencované obličkové bunky sú viazané na svoju konkrétnu líniu [8].

Obrázok 1. Vývoj ľudského močového systému od 4. do 9. týždňa v maternici.

2.2. Protokoly na generovanie obličkových organoidov

Obličkové organoidy môžu byť vytvorené z diferencovaných buniek derivovaných z tkaniva alebo z pluripotentných kmeňových buniek. Na vývoj obličkového organoidu z buniek získaných z tkaniva je možné usporiadať diferencované dospelé bunky v trojrozmernom priestore ex vivo, aby napodobnili architektúru ľudského orgánu [9]. Organoidové protokoly pre diferencované bunky derivované z tkaniva sú zahrnuté inde. V tomto prehľade sa zameriame na obličkové organoidy pochádzajúce z kmeňových buniek. Na vytvorenie týchto systémov môžu vedci kultivovať pluripotentné kmeňové bunky v prítomnosti endogénnych morfogénov špecifických pre obličky a extracelulárnych zložiek. Kmeňové bunky sa potom môžu samy zostaviť do štruktúr podobných obličkám, čo napodobňuje embryonálny vývoj obličiek. Orgány, ako napríklad črevo, ukrývajú populácie endogénnych kmeňových buniek v dospelom tkanive, pomocou ktorých môžu vedci vytvárať organoidy [10]. Keďže však neexistuje jasný dôkaz, že oblička dospelého človeka obsahuje výklenok kmeňových buniek, organoidy obličiek odvodené od kmeňových buniek sa musia vyrábať z pluripotentných kmeňových buniek (buď embryonálnych alebo hiPSC) [11].

Organoidy obličiek odvodené z kmeňových buniek možno klasifikovať do nasledujúcich dvoch kategórií: organoidy nefrónového progenitoru (NP) a organoidy močovodu (UB). Oba typy organoidov sa dobre osvedčili ako modely chorôb. NP organoidy sa podobajú metanefrickému mezenchýmu, ktorý obsahuje multipotentné NP bunky. V skutočnosti môže jedna metanefrická mezenchymálna bunka viesť k vzniku všetkých epitelových buniek nefrónu, s výnimkou zberného kanálika [8]. Metodológie na generovanie NP organoidov odvodených od hiPSC zahŕňajú 2D kultiváciu s následnou agregáciou v poréznej transwell platni (napr. Takasato et al. (2016), Morizane et al. (2015)) alebo 3D kultúru v hydrogéli (napr. Freedman et al. (2015)) [12 – 14]. Tieto organoidy vyvíjajú glomerulárne a tubulárne štruktúry. NP organoidy odvodené z dvoch najpopulárnejších NP protokolov od Takasato a Morizane boli porovnané v rozsiahlej omickej analýze Wu et al. (2018) [15]. Zistili, že zatiaľ čo protokol Takasato generuje asi 11 % buniek podobných podocytom a 21 % mimocieľových buniek na organoid, protokol Morizan generuje asi 28,5 % buniek podobných podocytom a 14,3 % buniek mimo cieľa [15]. Zdá sa, že Takasatove organoidy tiež vyvíjajú malé množstvo oblastí podobných UB, ale prevažne napodobňujú metanefrický mezenchým, čím sa klasifikujú ako NP organoidy [12]. Ďalej Morizane a kol. (2015) a Takasato a kol. (2016) protokoly postrádajú extracelulárne hydrogélové prostredie, ktoré je prítomné v práci Freedmana et al. (2015) [14]. Garreta a kol. (2019) tvrdia, že prítomnosť hydrogélu pri tvorbe organoidov zlepšuje tvorbu obličkovej štruktúry a zvyšuje produkciu skorých IM markerov, zadných IM markerov a predných IM markerov [16].

Na rozdiel od NP organoidov, UB organoidy napodobňujú ureterický pupeň, ktorý vedie k systému zberných kanálikov. Metódy na generovanie UB organoidov boli vyvinuté nedávno a zahŕňajú kultiváciu embryoidného tela a následnú agregáciu do jamiek s nízkou priľnavosťou [17]. Tieto organoidy majú rúrkové a zberné kanáliky. Nakoniec sa skombinovali aj organoidy NP a UB, aby sa vytvorili kokultúrne štruktúry vyššieho rádu na rekapituláciu dospelých ľudí.obličkové fenotypy[17]. Najpopulárnejšie protokoly preobličkový organoidformácie sú zhrnuté na obrázku 2 nižšie [12–14,17–19].

Obrázok 2. Súhrn najpopulárnejších protokolov tvorby organoidov

2.3. Ako sa hromadia: Organoidy v obličkách verzus ľudské obličky

Vyššie opísané protokoly primárne zahŕňajú samozostavenie hiPSC do organoidov. Napodobňujú stavy plodu, aby indukovali hiPSC, aby sa diferencovali na obličkové špecifické línie a vytvorili obličky špecifické štruktúry. Prvým stavom plodu, ktorý replikujú, je primitívna pruhová signalizácia. Primitívny pruh je časť embrya, ktorá sa vyvíja pred oddelením troch zárodočných vrstiev. Väčšina protokolov to robí pomocou WNT signalizačného agonistu CHIR. Ďalej pre odvodenie NP línie je potrebné indukovať posterior-intermediate mezoderm (PIM) a pre UB líniu je potrebné indukovať anterior-intermediate mezoderm (AIM) [17]. Zaujímavé je, že Takasato a spol. (2015) zistili, že čím dlhšie bolo obdobie podávania CHIR, tým viac sa vyvinul mezoderm zozadu, kým čím kratšie obdobie, tým viac sa vyvinul mezoderm podobný prednej [20]. Zvýšené trvanie signalizácie WNT teda vedie k väčšej tvorbe glomerulárnej a proximálnej štruktúry a znížené trvanie signalizácie WNT vedie k vytváraniu vzdialenejšej štruktúry.

Po dokončení protokolu NP sa vyvinú organoidy s glomerulárnymi aj tubulárnymi oblasťami. Sú však nezrelé. Štúdie ukázali, že organoidy obličiek odvodené od hiPSC napodobňujú plod v prvom trimestri [20]. Jednu z najrozsiahlejších analýz na túto tému vykonali Subramanian et al. (2019), ktorí použili RNA-seq na porovnanie obličkových organoidov s 8-týždňovými, 17-týždňovými a dospelými ľudskými obličkami. Dospeli k záveru, že obličkové organoidy sú viac podobné ľudským obličkám v 8. a 17. týždni u plodu ako u dospelých obličiek [21]. Okrem toho obličkové organoidy vykazujú farbenie primitívnych multipotentných markerov, ako je SIX{10}} v celej obličke, zatiaľ čo dospelá diferencovaná ľudská oblička takéto markery neexprimuje [22]. Preto, aby sa organoid obličky použil ako náhrada za obličku dospelého človeka na štúdium choroby, musí prejsť v gestačnom veku.

Obličkové organoidy môžu nielen viac napodobňovať skoré metanefros než obličky u dospelého človeka, ale môžu sa ešte viac podobať mezonefros ako metanefros, ak je koncentrácia morfogénu nesprávne regulovaná [23]. Pri riešení týchto obáv Tsujimoto a kol. (2020) skúmali in vitro diferenciáciu hiPSC na mezonefrické NP, metanefrické NP a UB bunky [24]. Táto štúdia identifikovala niekoľko faktorov, ktoré tieto tri línie odlišujú, a môžu sa teda použiť pri budúcom štúdiu týchto troch odlišných systémov [24]. Medzi ďalšie kľúčové pokroky v zrení organoidov patria interakcie NP-UB a vaskularizácia. Niektoré z najvýznamnejších štúdií na riešenie týchto problémov vykonali Taguchi a Nishinakamura (2017) a Tsujimoto et al. (2020) [17,24]. Tieto štúdie generovali MM-UB kokultivované organoidy a transplantovali ich do myší, kde boli vaskularizované. Generovanie týchto metanefrických štruktúr vyššieho rádu výrazne zlepšilo podobnosť štruktúry obličiek odvodenej z kmeňových buniek so skutočnými ľudskými obličkami. Ani tieto pokročilé systémy však neboli schopné rekapitulovať rozsiahlejšie rozvetvenie UB, ku ktorému dochádza počas druhého a posledného trimestra in vivo [24]. Tieto zistenia podčiarkujú potrebu replikácie endogénnych zrelých obličkových funkcií a interakcií, ktoré súčasným organoidom chýbajú, ako napríklad prietok tekutín.

3. Obličkové organoidy ako modelové systémy

Podobnosť obličkových organoidov s ľudskými obličkami ich robí vhodnými na modelovanie chorôb a skríning liekov. Môžu byť vyrobené za menej ako mesiac, prispôsobené jednotlivcovi a vyrobené vo veľkom [12–14, 17–19]. Okrem toho môžu byť kultivované in vitro alebo transplantované do myší, potkanov alebo kuracích vajec, aby sa vytvorili kompletné in vivo modely. Nižšie preskúmame analýzu, ktorú možno vykonať s obličkovými organoidmi, ako aj súčasné a budúce využitie obličkových organoidov v biomedicínskom výskume.

3.1. Analýza obličkových organoidov

3.1.1. In vitro testy

Na obličkových organoidoch možno uskutočniť rôzne fyziologické, molekulárne a funkčné testy. Čo sa týka molekulárnych testov, rôzne transkriptomické analýzy boli úspešne vykonané v obličkových organoidoch [25]. Napríklad Takasato a kol. (2015) extrahovali RNA z organoidov a vykonali sekvenovanie RNA a analýzy qRTPCR [20].

Iní, ako Wu a kol. (2018) okrem sekvenovania DropSeg scRNA v obličkových organoidoch vykonali izoláciu jadier a sekvenovanie snRNA. Okrem hladín RNA boli kvantifikované a porovnané rôzne hladiny proteínov z obličkového organoidného lyzátu prostredníctvom imunoblotu (napr. Cruz a kol., 2017; Morais a kol., 2022) [26,27]. Okrem toho sa v obličkových organoidoch rutinne vykonáva imunocytochemická analýza, aby sa preskúmali špecifické štruktúry nefrónov. Toto sa často vykonáva ako farbenie celých organoidov; alternatívne sa na sondovanie použili aj tkanivové rezy (napr. Takasato et al., 2015; Cruz et al., 2017) (20,26).Tieto štúdie odhalili, že organoidy obličiek vykazujú glomeruly, proximálny tubul, distálny tubul, bazálnu membránu a usporiadanie zberných kanálikov (20, 27). Obrázok 3 nižšie ukazuje príklad organoidov ľudskej obličky zaliatych a narezaných na rezy generované pomocou protokolu Takasato et al. (2016) (12) Rez je zafarbená na glomerulárny, proximálny tubul a distálny tubulárnych markerových proteínov a vykazuje kontinuálne glomerulárne až distálne tubulárne nefronické štruktúry. Okrem štruktúr je známe, že obličkové organoidy vykazujú aj vaskulatúru, ktorá je však obmedzená, rýchlo ustupuje a nie je organizovaná ako v typickej obličke (28).

V obličkových organoidoch sa môžu uskutočniť aj viaceré funkčné testy. Napríklad, ako opísali Freedman et al. (2022), organoidy obličiek môžu byť podrobené pulzným testom, kde sa môžu do médií pridať rôzne fluorescenčné molekuly predtým, ako sa nahradia novými médiami bez fluorescencie [29]. Organoidy sa potom môžu analyzovať na príjem týchto molekúl a výsledné informácie sa môžu použiť na odvodenie informácií o akumulácii, opuchu, filtrácii, endokrinnom systéme alebo poranení [29]. Jedným z problémov tohto testu na organoidných platformách je však to, že molekuly môžu byť zavedené zvonka do uzavretých tubulárnych štruktúr namiesto cez apikálny povrch, ako by sa to vyskytlo in vivo. Fluorescenčné molekuly teda môžu byť absorbované z vonkajšej bazolaterálnej membrány, pretože neexistuje spôsob, ako kontrolovať, kam sa tieto molekuly môžu dostať, keď sú hrubo zavedené do média. Okrem toho môže byť transport molekúl obmedzený difúziou v rámci organoidov, čo vytvára rôzne trendy akumulácie v rámci toho istého organoidu.

Okrem toho sa oprava obličiek môže hodnotiť aj na platformách organoidov, čo umožňuje nahliadnuť do mechanizmov zvrátenia poškodenia obličiek a genetického základu, ktorý môže predisponovať pacientov k ochoreniu obličiek. Napríklad štúdie ako Gupta et al. (2022) skúmali génové dráhy, ktoré boli upregulované v prítomnosti jednorazovej alebo viacnásobnej expozície cisplatine, molekule poškodenia obličiek, v obličkových organoidných platformách [30]. Nakoniec, tvorba cýst môže byť analyzovaná v organoidoch na účely štúdia polycystického ochorenia obličiek (PKD) prostredníctvom aktivácie cAMP [26]. Cysty sa potom môžu merať, kvantifikovať a zaobchádzať s nimi ako s proxy cystami ľudských obličiek.

3.1.2. In vivo analýza

Významnou nevýhodou použitia in vitro obličkových organoidov ako modelového systému je ich nedostatok súhry so zvyškom organizmu. Množstvo stavov, ktoré postihujú odľahlé časti tela, môže ovplyvniť obličky a naopak. Napríklad zmeny krvného tlaku môžu drasticky zmeniť glomerulárny tlak, ktorý môžu obličky regulovať. In vitro však organoidné systémy nezodpovedajú za tieto systémové interakcie. Boli teda preskúmané transplantačné prístupy, ktoré zahŕňajú obličkové organoidy získané z človeka u myší, potkanov a slepačích vajec. V takýchto štúdiách sa ľudské a zvieracie tkanivá rozlišujú pomocou imunofarbenia ľudského jadrového antigénu alebo zosúladením čítania chromozómu Y s odkazom na kombinovaný genóm [21]. Okrem toho môžu byť organoidy transplantované cez lešenie (napr. hodváb), aby sa zabezpečila vyššia úroveň štrukturálnej integrity [31]. Tento prístup môže umožniť jednoduchšie analýzy špecifické pre organoidné tkanivá po transplantácii.

Kľúčovou výhodou transplantácie obličkových organoidov je to, že umožňuje organoidom vaskularizovať, dozrieť a dokonca filtrovať moč. Van den Berg a kol. (2018) ukázali, že po subkapsulárnej transplantácii obličky myšiam výrazne dozrievajú obličkové organoidné glomeruly a tubuly [32]. V inej štúdii Subramanian et al. (2019) ukázali, že transplantácia organoidov odvodených od hiPSC myšiam vedie k zvýšenému dozrievaniu proximálneho a distálneho tubulu a zníženiu prítomnosti mimocieľových bunkových populácií v organoide [21]. Ešte dôležitejšie je, že po transplantácii môžu organoidy obličiek vykonávať hlavnú funkciu obličiek, filtrovať krv. Po subkutánnej transplantácii u myší obličkové organoidy vytvorili štruktúry filtrujúce moč, o čom svedčí prenos dextránu značeného FITC [33]. Transplantácia teda nielenže umožňuje študovať účinky mutácie v obličkovom organoide in vivo, ale tiež zlepšuje podobnosť organoidu s ľudskou obličkou a robí z neho do istej miery funkčný systém.

Zatiaľ čo imunodeficientné myši sa často používajú na transplantáciu organoidov obličiek hiPSC, použili sa aj iní hostitelia, ako napríklad chorioalantoické membrány kurčiat (CAM). CAM je prirodzene imunodeficientná a prispieva k vaskularizácii organoidu [16]. Chýbajú mu však typické orgánové systémy cicavcov, vďaka čomu sú organoidy obličiek odpojené od iných systémov, na rozdiel od myší. Napriek neúspechom súvisiacim s hostiteľom umožňuje generovanie chiméry s organoidmi obličiek získanými z človeka rozsiahlu in vivo štúdiu ochorenia ľudských obličiek na vysoko pôsobivej platforme.

3.2. Doteraz uskutočnené štúdie modelovania chorôb

3.2.1. Organoidy obličiek ako modely genetických chorôb

Obličkové organoidy sa použili na štúdium tubulárnych a glomerulárnych genetických ochorení obličiek [26,34,35]. Medzi najvýznamnejšie tubulárne choroby u ľudí patrí detská polycystická choroba obličiek (PKD), ktorá je výsledkom autozomálnych recesívnych mutácií vo fibrocystickom géne (PKHD1), a PKD dospelých, ktorá je výsledkom autozomálne dominantných mutácií v polycystíne-1 a -2 génov [36–38]. Tieto mutácie môžu byť umelo zavedené do hiPSC pomocou technológií na úpravu génov, ako je systém CRISPR-Cas 9. Upravené hiPSC môžu byť následne pestované na PKD modelujúce ľudské obličkové organoidy a analyzované pomocou farbenia proteínov a profilovania RNA. Napríklad Freedman a kol. (2015) a Cruz a kol. (2017) vyradili polycystínové gény v líniách hiPSC pomocou systému CRISPR/Cas9 a následne odvodili organoidy, ktoré napodobňujú cystický fenotyp nachádzajúci sa in vivo u chorých pacientov [14,26]. Tieto štúdie ukazujú, že organoidy obličiek možno použiť ako ľahko pozorovateľné platformy relevantné pre ochorenie na štúdium PKD. Okrem toho organoidy vyrobené z bunkových línií získaných od pacienta umožňujú nahliadnuť do mutácií špecifických pre pacienta a pravdepodobnosti rozvoja ochorenia. Napríklad Low a kol. (2019) vyvinuli obličkové organoidy odvodené od pacientov s mutáciami PKHD1 a porovnali ich s organoidmi divokého typu [39]. Choré organoidy vykazovali výrazne väčšiu tvorbu cýst, čo demonštrovalo potenciál obličkových organoidov predpovedať manifestáciu ochorenia z genotypu [39]. V inej štúdii Hernandez et al. (2021) odvodili hiPSC od pacientov s mutáciami v géne komplexu tuberóznej sklerózy-2, čo spôsobuje, že pacient je náchylný na vývoj nádoru obličiek [40]. Potom korigovali mutáciu pacienta systémom CRISPR/Cas9. Obličkové organoidy z týchto korigovaných izogénnych mutantných línií vykazovali zníženú tvorbu cýst a obnovené génové dráhy v porovnaní s chorými organoidmi, čím demonštrovali užitočnosť obličkových organoidov pri štúdiu následných funkčných účinkov špecifických mutácií v izogénnych orgánoch podobných systémoch.

Výskumníci tiež použili organoidy získané od pacienta, aby získali prehľad o genetických ochoreniach, ktoré postihujú glomerulus. Napríklad Hale a kol. (2018) sa zamerali na gén NPHS1 (nefrín), ktorý, ak je zmutovaný, indukuje chybnú tvorbu výbežku podocytovej nohy a netesnú filtráciu moču, čo vedie k ochoreniu obličiek [34]. Hale a kol. (2018) použili mutantné NPHS1 hiPSC odvodené od pacienta na odvodenie obličkových organoidov, ktoré modelovali tieto chybné procesy podocytovej nohy, vrátane znížených hladín proteínov špecifických pre podocyty, nefrínu a podocínu [34]. Rovnako aj Freedman a spol. (2015) vyradili glomerulárny gén PODXL v hiPSC a zistili, že organoidy vykazujú chybnú architektúru podocytov a podocytov [14].

Jedným z prevažne nevyužitých potenciálov obličkových organoidov je ich schopnosť modelovať embryonálne a fetálne defekty. V súčasnosti sa vedci snažia modelovať obličku dospelého človeka pomocou obličkového organoidu. V súčasnom stave v prvom a druhom trimestri však možno organoidy obličiek použiť na štúdium vývojových defektov obličiek [41]. Vývojové defekty močového systému, ako je dysplázia obličiek, patria medzi niektoré z najčastejších a najzávažnejších vývojových porúch [42]. Keďže mnohé z týchto chorôb možno odhaliť už v 11. týždni, organoidy obličiek sa hodia obzvlášť dobre na štúdium vrodených porúch obličiek. K dispozícii máme nielen metanefrické obličkové organoidy v prvom a druhom trimestri, ale máme aj primitívne mezonefrické obličkové bunkové línie (napr. Tsujimoto et al., 2020) na štúdium embryonálnych a fetálnych defektov [24]. Keďže len málo systémov umožňuje štúdium a manipuláciu s vyvíjajúcou sa ľudskou obličkou, organoid obličiek poskytuje obrovský potenciál pre fetálne genetické, toxikologické a vývojové štúdie.

3.2.2. Obličkové organoidy ako modely iných chorôb

Okrem genetického ochorenia sa organoidy obličiek používajú na štúdium reakcie ľudských systémov na vírusovú infekciu, rakovinu a poranenie. Napríklad Jansen a kol. (2021) použili platformu obličkových organoidov na vyhodnotenie účinkov vírusového SARS-CoV-2 na ľudské obličky [43]. Táto skupina zistila, že infekcia SARS-CoV-2 vedie k zvýšenej expresii kolagénu-I v organoidoch ľudských obličiek, čím poskytuje mechanické vysvetlenie poškodenia obličiek a fibrózy, ktoré často sprevádzajú závažné prípady dlhotrvajúceho COVID-19 [ 43]. Čo sa týka výskumu rakoviny, Hernandez a kol. (2021) transplantovali obličkové organoidy imunodeficientným potkanom na modelovanie zriedkavých geneticky ovplyvnených nádorov obličiek. Tu sa u organoidov odvodených od pacienta vyvinuli nádorové lézie, čím sa rekapitulovali nádory ľudských obličiek [40]. Okrem toho použili modely nádorov na báze organoidov obličiek ako polofunkčné štruktúry odvodené od človeka a testovali lieky a terapie založené na nanočasticiach. Napokon nedávne štúdie ukázali, že organoidy obličiek možno použiť na testovanie reakcie na poškodenie obličiek. Napríklad Prezpiorski a kol. (2022) preukázali, že obličkové organoidy produkujú markery oxidačného poškodenia a zvýšenú expresiu markerov poranenia podávaním molekuly poranenia hemínu do obličkových organoidov spolu s biosenzorom [44].

3.2.3. Organoidy v obličkách pri hodnotení liečiv

Okrem poskytnutia prehľadu o chorobách sa obličkové organoidy použili na skríning liekov. Najmä obličkové organoidy sa použili na štúdium poškodenia obličiek vyvolaného liekmi (DIKI), ktoré je hlavnou príčinou akútneho poškodenia obličiek [45]. Pri hodnotení vedľajších účinkov cisplatiny Czerniecki et al. (2018) ukázali, že obličkové organoidy sú užitočné ako vysoko výkonné modely na preverenie nových liečiv v rozmanitej škále ľudskej genetiky [46].

Iní, ako Wu a kol. (2018) okrem sekvenovania DropSeg scRNA v obličkových organoidoch vykonali izoláciu jadier a sekvenovanie snRNA. Okrem hladín RNA boli kvantifikované a porovnané rôzne hladiny proteínov z obličkového organoidného lyzátu prostredníctvom imunoblotu (napr. Cruz a kol., 2017; Morais a kol., 2022) [26,27]. Okrem toho sa v obličkových organoidoch rutinne vykonáva imunocytochemická analýza, aby sa preskúmali špecifické štruktúry nefrónov. Toto sa často vykonáva ako farbenie celých organoidov; alternatívne sa na sondovanie použili aj tkanivové rezy (napr. Takasato et al., 2015; Cruz et al., 2017) (20,26).Tieto štúdie odhalili, že organoidy obličiek vykazujú glomeruly, proximálny tubul, distálny tubul, bazálnu membránu a usporiadanie zberných kanálikov (20, 27). Obrázok 3 nižšie ukazuje príklad organoidov ľudskej obličky zaliatych a narezaných na rezy generované pomocou protokolu Takasato et al. (2016) (12) Rez je zafarbená na glomerulárny, proximálny tubul a distálny tubulárnych markerových proteínov a vykazuje kontinuálne glomerulárne až distálne tubulárne nefronické štruktúry. Okrem štruktúr je známe, že obličkové organoidy vykazujú aj vaskulatúru, ktorá je však obmedzená, rýchlo regresuje a nie je organizovaná ako v typickej obličke (28).

Obrázok 4. Súhrn spôsobov použitia obličkových organoidov na modelovanie ochorenia. Súhrn spôsobov použitia obličkových organoidov na modelovanie di