Ochranná imunita proti SARS CoV-2 infekcii škrečkov vyvolaná očkovaním DNA

Obr. 2. Protilátková odpoveď u myší po imunizácii SARS-CoV a SARS-CoV-2 S DNA vakcínami.

(A) BALB/c myši (n=4 na skupinu) boli intramuskulárne imunizované dvakrát v 3-týždennom intervale 100 ug uvedeného plazmidu, po čom nasledovala elektroporácia. Vzorky séra sa odobrali v uvedených časových bodoch po prvej imunizácii. (BD, F, G) Protilátky proti SARS-CoV-2 kompletnému spike proteínu, oblasti S2 a RBD boli hodnotené testom ELISA. (E, H) Vakcínou indukovaná neutralizačná protilátka proti SARS-CoV-2 bola hodnotená neutralizačným testom. Titre protilátok sú prezentované ako priemer ± SEM a neutralizačné titre sú vyjadrené ako geometrický priemer s 95 % intervalom spoľahlivosti. *p<0.05 by the Mann-Whitney test.

Aby sme ďalej preskúmali, či nahradenie vedúcej sekvencie môže zvýšiť sekréciu proteínu, použili sme vedúcu sekvenciu z aktivátora tkanivového plazminogénu na fúziu rôznych variantov SARS-CoV-2 S proteínu. Všetky varianty obsahujú oblasť RBD proteínu SARS-CoV-2 S. Po dvoch dávkach imunizácie DNA sa séra zozbierané v 4. a 6. týždni analyzovali na titre IgG protilátok a neutralizačných protilátok. Imunizácia pomocou ptSARS2-S indukovala vyššie titre protilátok proti proteínu S plnej dĺžky v týždni 4 ako imunizácia ptRBD, ptRBDTM a ptSdTM (S1A Obr). Titre protilátok proti RBD pri imunizácii ptRBD boli vyššie ako pri imunizácii ptSARS2-S (1496,2 vs. 530,9, p=0,057) v 4. týždni (S1B Obr). Avšak imunizácia ptRBD a ptSARS{0}}S indukovala podobné hladiny neutralizujúcich protilátok v 4. týždni (S1C Obr). Rovnaké výsledky boli pozorované pri analýze séra v 6. týždni; Imunizácia ptRBD vyvolala vyššie hladiny protilátok proti RBD v porovnaní s imunizáciou ptSARS2-S (12589,3 vs. 1000,0, p=0,028), ale rovnaké hladiny neutralizačných protilátok (9,3 oproti 9,6 (log2)) (obr. 2F, 2G a 2H). Pretože varianty s fúzovanou vedúcou sekvenciou tPA neindukovali vyššie titre neutralizačných protilátok ako imunizácia pSARS2-S, použili sme na ďalšie skúmanie pSARS{19}}S.

Konkurenčná väzba sérových protilátok a ACE2 na SARS-CoV-2 RBD

Aby sme preskúmali schopnosť sérových protilátok interferovať s interakciou ACE2-RBD, vykonali sme kompetitívny sérologický test SARS-CoV-2. V tomto teste sa na doštičky ELISA vopred potiahnuté proteínom SARS-CoV-2 RBD pridali sérové ​​protilátky a potom sa pridal ľudský proteín ACE2. Ako referencia bola použitá špecifická neutralizačná protilátka proti SARS-CoV-2 RBD. Ako je uvedené vObrsérové ​​protilátky z myší imunizovaných pSARS{0}}S sa naviazali na RBD a blokovali väzbu ACE2, čo bolo ekvivalentné približne 353 ug/ml referenčnej protilátky, zatiaľ čo sérum pSARS-S bolo ekvivalentné 56 ug/ml referenčnej protilátky. Naše údaje preto naznačujú, že imunizácia pSARS2-S by mohla vyvolať kompetitívne protilátky, ktoré účinne blokujú väzbu SARS-CoV-2 RBD na receptor ACE2. Tento výsledok bol v súlade s titrom ELISA proti SARS-CoV2 RBD (Obr. 2D) a podporené štúdiou o rozdiele sekvencií RBD medzi SARS-CoV a SARS-CoV-2 [24].

Obr. 3. Konkurenčná aktivita imunizovaných myších sér proti interakcii RBD/ACE2.

BALB/c myši (n=4 na skupinu) boli intramuskulárne imunizované dvakrát v 3-týždennom intervale 100 ug vektora, pSARS-S alebo pSARS{4}}S, po čom nasledovala elektroporácia. Vzorky séra sa odobrali v 8. týždni po prvej imunizácii. Sérové ​​protilátky, ktoré súťažia s ACE2 o väzbu RBD, boli hodnotené kompetitívnym sérologickým testom SARS-CoV-2. Kompetitívna aktivita myšacieho séra je vyjadrená ako ekvivalentná hladina anti-RBD (spike protein SARS-CoV{11}}) (referenčná protilátka). Titre protilátok sú uvedené ako priemer ± SEM. *p<0.05 by the Mann-Whitney test.

SARS-CoV-2 S DNA vakcínou indukovaná dlhodobá humorálna imunita a ponúkaná krížová ochrana proti SARS-CoV-2 s mutáciou D614G

Pozoruhodné je, že dlhodobé udržiavanie titrov protilátok IgG proti S plnej dĺžky sa pozorovalo 20 týždňov po prvej imunizácii (Obr. 4A). Geometrický priemer titrov (log2) pre SARS-CoV-2 neutralizujúcu protilátku dosiahol 10,8 v týždni 8 po imunizácii pSARS2-S, mierne klesol na 9,1 v týždni 12 a na 8,8 v týždni 20 (Obr. 4B). Tieto výsledky naznačujú, že imunizácia pSARS2-S poskytuje dlhotrvajúcu humorálnu odpoveď proti SARS-CoV-2. Okrem toho vakcína pSARS2-S DNA s genotypom D614 vyvolala reakciu neutralizujúcich protilátok proti vírusu obsahujúcemu mutáciu D614G (Obr. 4C), čo je podobné ako neutralizačné titre proti genotypu D614. Preto je pSARS2-S schopný poskytnúť krížovú ochranu proti najrozšírenejšiemu a dominantnému variantu D614G SARS-CoV-2.

Obr. 4. SARS-CoV-2 S DNA vakcína indukovala dlhodobú humorálnu imunitu a skríženú ochranu proti SARS-CoV-2 s mutáciou D614G.

BALB/c myši (n=4 na skupinu) boli intramuskulárne imunizované trikrát v 3-týždennom intervale 100 ug vektora, pSARS-S alebo pSARS{4}}S, po čom nasledovala elektroporácia. Vzorky séra sa odobrali v uvedených časových bodoch po prvej imunizácii. (A) Protilátky proti spike proteínu SARS-CoV-2 plnej dĺžky boli hodnotené testom ELISA. (B, C) Neutralizačná aktivita vyvolaná vakcínou proti SARS-CoV-2 s genotypmi D614 alebo G614 bola hodnotená neutralizačným testom. Titre protilátok sú prezentované ako priemer ± SEM a neutralizačné titre sú vyjadrené ako geometrický priemer s 95 % intervalom spoľahlivosti. *p<0.05 by the Mann-Whitney test.

Indukcia Th1- alebo Th2-zaujatých odpovedí

Efektorové CD4+ T bunky možno rozdeliť do dvoch hlavných funkčných podskupín, Th1 a Th2, na základe secernovaných cytokínov pri aktivácii. Th1 bunky produkujú zápalové cytokíny (IFN- ) a podieľajú sa na bunkami sprostredkovaných imunitných odpovediach voči intracelulárnym baktériám a vírusom, zatiaľ čo Th2 bunky vylučujú hlavne B bunky produkovať protilátky, ale podporujú aj eozinofilmi sprostredkovanú imunitu (IL-5 a IL{ {9}}), čo má za následok humorálne alebo alergické reakcie [25, 26]. Mechanizmy závislé od Th2 buniek môžu navyše prispievať k zvýšenému respiračnému ochoreniu súvisiacemu s vakcínou (VAERD), ako ukázali štúdie kandidátov na vakcínu proti SARS-CoV [27, 28], ktoré zdôrazňujú, že vyvážená odpoveď T buniek je rozhodujúca pre bezpečný vývoj vakcíny proti COVID{0}}29]. Na vyriešenie tohto problému boli myši BALB/c a C57BL/6 imunizované vektorom, pSARS-S a pSARS2-S dvakrát v 3-týždennom intervale. Myši boli usmrtené 7 dní po druhej imunizácii a splenocyty boli stimulované proteínom SARS-CoV-2 S (5 ug/ml) počas 3 dní. U myší BALB/c (Obr. 5A–5D), sekrécia cytokínov typu Th1 IFN- (19641,3 pg/ml ± 8823,5) a IL-2 (599,5 pg/ml ± 37,7) bola vysoká po stimulácii proteínom S v pSARS2-S imunizačnej skupine, ale boli detegované veľmi nízke hladiny cytokínov typu Th2 IL-5 (18,1 pg/ml ± 11,8) a IL-13 (567,2 pg/ml ± 166,2). Podobné výsledky sa pozorovali u myší C57BL/6, imunizačná skupina pSARS2-S indukovala vyššie množstvo IFN- (33918,8 pg/ml ± 11646,1) a IL-2 (800,3 pg/ml ± 109,5) ako IL-5 (4,6 pg/ml ± 2,9) a IL-13 (545,7 pg/ml ± 117,4) (Obr. 5E-5H). Tieto údaje naznačujú, že pSARS2-S by mohol vyvolať Th1-skreslené imunitné reakcie.

Obr. 5. Odpoveď T buniek u myší po imunizácii DNA vakcínami pSARS-S a SARS{2}}S.

Myši BALB/c (AD) a C57BL/6 (EH) (n=4 na skupinu) boli intramuskulárne imunizované dvakrát v 3-týždennom intervale 100 ug vektora, pSARS-S alebo pSARS{{ 8}}S, po ktorej nasleduje elektroporácia. Splenocyty sa odobrali v 4. týždni po prvej imunizácii a hladiny secernovaného IFN- (A, E), IL-2 (B,F), IL-5 (C,G) a IL -13 (D, H) boli hodnotené po restimulácii rekombinantným proteínom SARS-CoV{15}} S. Titre protilátok sú uvedené ako priemer ± SEM. *p<0.05 by the Mann-Whitney test.

Profylaktická účinnosť DNA vakcín proti SARS-CoV-2 Výzva

Na preskúmanie ochrannej účinnosti vakcinácie pSARS{0}}S boli sýrske škrečky imunizované dvakrát 100 ug DNA v 3-týždennom intervale a v 7. týždni boli intranazálne stimulované vírusom SARS-CoV-2 (Obr. 6A). Po imunizácii sa zhromaždili séra v 4. a 6. týždni na analýzu titra anti-spike protilátok (IgG) a neutralizačných protilátok. Imunizácia pomocou pSARS2-S vyvolala vyššie hladiny titrov protilátok proti Spike ako imunizácia ptRBD v 4. týždni (1584,9 oproti 50,1) a v 6. týždni (1995,3 oproti 63,1) u škrečkov (Obr. 6B). V súlade s titrami anti-Spike protilátok séra škrečkov imunizovaných pSARS2-S zvýšili veľmi vysoké titre neutralizačných protilátok (6,5 v týždni 4 a 6,4 v týždni 6 (log2)), ale séra vektora- resp. ptRBD-imunizované škrečky nie (Obr. 6C). Po infekcii SARS-CoV-2 sa telesná hmotnosť škrečka monitorovala každý deň. Predchádzajúce štúdie ukázali, že vírusový titer v pľúcach škrečka dosiahol vysokú úroveň 3 dni po provokácii [30]. Polovica škrečkov z každej skupiny sa teda usmrtila na 3. deň a analyzovala sa vírusová záťaž v pľúcach. Telesná hmotnosť vektorom očkovaných škrečkov postupne klesala a percento straty telesnej hmotnosti bolo 11,1 % 6 dní po provokácii. Naproti tomu imunizácia pSARS2-S chránila škrečky pred stratou telesnej hmotnosti (Obr. 6D). Okrem toho infekčné vírusové titre a počet kópií vírusovej RNA v skupine pSARS{0}}S vykazovali 2,29 a 1,37 log10 redukcie v porovnaní s vektorovou kontrolnou skupinou (Obr. 6E a 6F). Tieto výsledky naznačujú, že imunizácia pSARS2-S poskytuje ochranu pred infekciou SARS-CoV-2 u škrečkov sýrskych.

Obr. 6. Profylaktická účinnosť SARS-CoV-2 S DNA vakcíny u škrečkov infikovaných SARS-CoV-2-.

(A) Časový priebeh očkovania DNA a provokačnej dávky SARS-CoV-2. Sýrske škrečky boli intramuskulárne imunizované dvakrát v 3-týždennom intervale 100 ug kontroly, pSARS-S alebo pSARS{5}}S, po čom nasledovala elektroporácia. Vzorky séra sa odoberali retroorbitálnym odberom krvi v 4. a 6. týždni po prvej imunizácii. 4 týždne po druhej imunizácii boli sýrske škrečky intranazálne stimulované 105 TCID50 SARS-CoV-2. (B) Protilátky proti SARS-CoV-2 kompletnému vrcholovému proteínu boli hodnotené testom ELISA. (C) Neutralizačná aktivita vyvolaná vakcínou proti SARS-CoV-2 bola hodnotená neutralizačným testom. (D) Zmena telesnej hmotnosti (%) škrečkov sa zaznamenávala každý deň po infekcii SARS-CoV-2. Vírusové titre (E) a vírusové kópie RNA (F) v pľúcach škrečkov infikovaných SARS-CoV-2- 3 dni po provokácii boli stanovené testom TCID50 a qRT-PCR, v uvedenom poradí. Titre protilátok sú prezentované ako priemer ± SEM a neutralizačné titre sú vyjadrené ako geometrický priemer s 95 % intervalom spoľahlivosti. *p<0.05, ***p<0.001 by the Mann-Whitney test.

Diskusia

Bolo spustených viac ako 80 klinických testov vakcíny COVID{1}} a imunogenicita a štúdie vírusovej expozície na zvieratách sú kritickými krokmi v procesoch vývoja vakcín. DNA vakcíny na infekciu SARS-CoV-2 boli intenzívne vyvinuté pre rôzne spôsoby podávania. Elektroporácia je sľubný prístup, ktorý môže zlepšiť dodávanie DNA a antigenicitu imunogénov in vivo. Boli publikované dve štúdie DNA vakcíny Yu et al. [13] a Smith a kol. [12]. Yu et al. found that rhesus macaques immunized with naked DNA encoding full-length S protein (without electroporation) exhibited >3.1 log10 zníženia vírusovej záťaže v bronchoalveolárnej laváži po stimulácii v porovnaní s kontrolami. Smith a kol. zistili, že imunizácia myší a morčiat pomocou INO-4800 (kódujúceho proteín S plnej dĺžky) s elektroporáciou by mohla vyvolať neutralizačné protilátky proti infekcii SARS-CoV-2 a blokovať väzbu proteínu S na receptor ACE2, ale dokázala neposkytujú údaje o expozícii zvierat. V tejto správe sme hodnotili rôzne varianty kandidátov na DNA vakcíny a zistili sme, že proteín S plnej dĺžky (pSARS2-S) je najvhodnejší pre ďalšiu imunologickú štúdiu. Hoci SARS-CoV a SARS-CoV{12}} zdieľajú 76 % homológiu vo svojich proteínoch S [31, 32], imunizácia pSARS-S nemôže vyvolať protilátky proti RBD proteínu SARS-CoV-2 S ani neutralizačné titre protilátok proti infekcii SARS-CoV-2 (Obr). Anti-RBD protilátky skutočne hrajú dôležitú úlohu pri blokovaní vírusovej infekcie. Avšak imunizácia samotným RBD (ptRBD) generovala vysoké titre neutralizačných protilátok u myší, ale nie u škrečkov (obr.2Ha6C). Predpokladali sme, že tento výsledok môže byť spôsobený signálnym peptidom (aktivátor tkanivového plazminogénu), ktorý neuľahčuje sekréciu RBD proteínu u škrečkov. Podrobný mechanizmus si v budúcnosti vyžaduje ďalšie štúdium. Tiež sme si všimli, že imunizácia ptRBDTM (kódujúca fragment z RBD do transmembránovej domény S) vyvolala nižšie titre neutralizačných protilátok ako imunizácia ptRBD (obr.2HaS1C). Výsledky môžu odrážať nestabilnú štruktúru proteínu RBD-TM. Na ďalšie skúmanie imunitných reakcií Th1/Th2 boli splenocyty z imunizovaných myší stimulované proteínom SARS-CoV-2 S. Zistili sme, že imunizácia pSARS2-S indukovala silné Th1-skreslené imunitné reakcie s vyššími hladinami sekrécie IFN- - po stimulácii (Obr), ale imunizácia pSARS-S vyvolala iba nízke hladiny sekrécie IFN- -. Tieto údaje naznačujú, že skrížená reaktivita reakcií T buniek medzi vrcholovým proteínom SARS-CoV a SARS-CoV-2 nie je vysoká (Obr). Okrem toho test IFN-ELISPOT odhalil, že bolo detegovaných menej reakcií T buniek proti oblasti S1 u myší C57BL/6 a BALB/c imunizovaných pSARS-S (S2 Obr), čo podporuje aj Smithova štúdia [12]. Tieto údaje naznačujú, že vakcína proti SARS nemusí poskytnúť úplný ochranný účinok proti infekcii SARS-CoV-2. Vývoj DNA vakcín je dôležitý pre rýchlu reakciu na pandemickú infekciu koronavírusom. Úspech DNA vakcíny proti SARS-CoV-2 by sa teda dal aplikovať aj na iné vznikajúce infekčné choroby.

Rôzne konštrukty použité v DNA vakcínach SARS-SoV-2 vyvolali rôzne hladiny titrov neutralizačných protilátok. Vedúca sekvencia tPA sa použila na zvýšenie expresie a sekrécie antigénu v DNA vakcínach [21, 33–35]. Vedúca sekvencia tPA však v tejto správe významne nezvýšila titre protilátok. Na ďalšie zvýšenie účinnosti vakcíny by sa na nahradenie natívnej vedúcej sekvencie spike proteínu mohli použiť rôzne vedúce sekvencie. Vedúca sekvencia IgE bola použitá v INO{0}} DNA vakcíne a MERS-CoV vakcíne [5, 12]. Navyše, modifikovaná sekvencia spike proteínu môže tiež zvýšiť imunogenicitu vakcíny. Stabilizovaný hrotový proteín bol navrhnutý mutáciou furínového miesta a iných oblastí, aby sa vytvorila prefúzna štruktúra (S-2P), ktorá môže zvýšiť expresiu hrotového proteínu ~10--násobne [36]. Ideálna DNA vakcína by mala optimalizovať konštrukciu plazmidovej DNA a transportný systém, aby sa zvýšila hladina expresie proteínu.

cistanche tubulosa - zlepšenie imunitného systému

Zvieracie modely sú rozhodujúce pre vývoj vakcíny proti COVID{0}}. Na vyhodnotenie účinnosti vakcín proti COVID-19 sa použilo niekoľko zvieracích modelov vrátane primátov (okrem človeka) [13, 37], ľudské ACE2 transgénne myši [38] a sýrske škrečky [39]. ACE2 sýrskeho škrečka má vysokú podobnosť s ľudským ACE2 a jeho väzbová afinita k S proteínu SARS-CoV-2 bola predpovedaná vyššia ako myšací ACE2 [40]. To je dôvod, prečo boli ľudské transgénne myši ACE2 použité ako modely vyvolania SARS-CoV-2, ale nie myši divokého typu. Štúdie prenosu SARS-CoV{5}} ukázali, že vírus môže účinne infikovať naivné škrečky priamym kontaktom alebo aerosólmi [41]. Intranazálna infekcia SARS-CoV-2 sa môže replikovať a indukovať patogenézu v pľúcach sýrskych škrečkov [30]. This study and previous reports also showed that SARS-CoV-2 infection caused approximately a 10% reduction in the initial body weight of hamsters. Clinical manifestations of patients with COVID-19, including changes in smell and taste, and severe respiratory distress, might be accompanied by weight loss (>5 % zníženie oproti východiskovej hodnote), čo bolo spojené s dlhším trvaním ochorenia [42]. Tieto zistenia naznačujú, že škrečok sýrsky je tiež vhodným zvieracím modelom na hodnotenie vakcín proti COVID-19. Na základe dostupnosti zvieracích modelov sme ako testovací model SARS-CoV-2 na vyhodnotenie účinnosti vakcíny vybrali škrečky. Naše údaje ukázali, že imunizácia pSARS2-S, ale nie ptRBD, môže indukovať vysoké titre anti-Spike IgG protilátky a titre neutralizačných protilátok (Obr. 6B a 6C). V súlade s tým škrečky imunizované pSARS{0}}S, ale nie škrečky imunizované ptRBD, vyvolali imunitné reakcie proti infekcii SARS-CoV-2. Poznamenali sme, že imunizácia ptRBD by mohla indukovať vysoké hladiny titrov neutralizačných protilátok u myší, ale nie u škrečkov. Konfliktné výsledky môžu byť spôsobené tým, že samotné RBD nie je stabilne exprimované u škrečkov. Model škrečka sa tiež použil na vyhodnotenie vakcíny COVID-19 založenej na vektore adenovírusu sérotypu 26 (Ad26). Jediná imunizácia vakcínou založenou na vektore Ad26 exprimujúcou stabilizovaný vrcholový proteín SARS-CoV{12}}, ktorý vyvolal neutralizačné protilátkové reakcie a chránil pred infekciou SARS-CoV{14}}, vyvolal úbytok hmotnosti, čiastočnú úmrtnosť a replikáciu vírusu v pľúcach [39]. Tieto výsledky naznačujú, že model škrečka je vhodný na hodnotenie účinnosti vakcín proti COVID{0}}.

Mnohé snahy o vývoj vakcíny proti SARS-CoV{1}} sú založené na skúsenostiach z výskumu MERS-CoV a SARS-CoV. Celosvetovo bolo v decembri 2020 schválených niekoľko vakcín proti COVID{4}}, vrátane vakcín proti COVID-19 na báze vektorov RNA a adenovírusov. Diskutovalo sa o výhodách a nevýhodách rôznych očkovacích platforiem [43]. Adenovírusové vektorové vakcíny môžu vyvolať silnejšie imunitné reakcie ako DNA a mRNA vakcíny, ale ich účinnosť vakcíny by mohla byť znížená už existujúcou imunitou proti Ad vektorom [44]. V porovnaní s DNA vakcínou potrebuje mRNA vakcína ultranízku teplotu na skladovanie a prepravu [45]. Preto by DNA vakcína mohla byť potenciálnou platformou vakcín, najmä počas núdzového použitia.

Naša štúdia naznačuje možnosť DNA vakcíny pre ľudí. Ďalšie štúdie by mohli preskúmať účinnosť tejto DNA vakcíny podávanej pomocou intradermálnej (ID) injekcie, ktorá je vhodnejšia na klinickú aplikáciu, pretože ihla na IM injekciu je u ľudí hlboká približne 18 mm a postihuje viac tkanív ako ID injekcia EP. Okrem toho by sa účinnosť vakcíny mala testovať na starších myšiach ako model pre starších ľudí, pretože táto populácia je obzvlášť vážne postihnutá infekciou SARS-CoV-2. Predchádzajúce štúdie ukázali, že odpoveď Th2 buniek bola spojená so zvýšeným respiračným ochorením (VAERD) po očkovaní inaktivovanými vírusovými vakcínami proti RSV [46], vírus osýpok [47] a SARS-CoV [27, 48]. Na rozdiel od toho sú hlásené menej závažné prípady SARS-CoV vyplývajúce z indukcie reakcie Th1 buniek [49]. Preto silné Th1-skreslené imunitné reakcie vyvolané DNA vakcínou naznačujú, že vedľajšie účinky pravdepodobne nebudú hlavným problémom [50]. Okrem toho sa objavili obavy z vakcín na báze proteínov v dôsledku použitia hlinitej soli alebo adjuvans typu emulzie olej vo vode, čo vedie k Th2-skresleným imunitným reakciám a zvyšuje potenciálne vedľajšie účinky [51, 52]. Stručne povedané, DNA vakcína COVID{0}} môže v blízkej budúcnosti zohrať významnú úlohu pri kontrole pandémie COVID-19.

Referencie

1. Pak A, Adegboye OA, Adekunle AI, Rahman KM, McBryde ES, Eisen DP. Ekonomické dôsledky vypuknutia COVID{0}}: Potreba pripravenosti na epidémiu. Front Public Health. 2020;8:241. pmid:325743072. Centrum pre systémové vedy a inžinierstvo (CSSE) [Internet]. COVID-19 informačný panel. Univerzita Johnsa Hopkinsa. [citované 11. februára 2021]. Dostupné z:
2. 3. Buchholz UJ, Bukreyev A, Yang L, Lamirande EW, Murphy BR, Subbarao K, et al. Príspevky štrukturálnych proteínov koronavírusu ťažkého akútneho respiračného syndrómu k ochrannej imunite. Proc Natl Acad Sci US A. 2004;101(26):9804–9. pmid:15210961
3. 4. Yang ZY, Kong WP, Huang Y, Roberts A, Murphy BR, Subbarao K a kol. DNA vakcína indukuje u myší neutralizáciu koronavírusu SARS a ochrannú imunitu. Príroda. 2004;428(6982):561–4. pmid:15024391
4. 5. Muthumani K, Falzarano D, Reuschel EL, Tingey C, Flingai S, Villarreal DO, a kol. Syntetická konsenzus anti-spike proteín DNA vakcína indukuje ochrannú imunitu proti koronavírusu respiračného syndrómu na Blízkom východe u primátov (okrem človeka). Sci Transl Med. 2015;7(301):301ra132. pmid:26290414
5. 6. Vakcíny Krammer F. SARS-CoV-2 vo vývoji. Príroda. 2020;586(7830):516–27. pmid:32967006
6. 7. Khalaj-Hedayati A. Ochranná imunita proti kandidátom na podjednotkovú vakcínu SARS na základe proteínu Spike: Lekcie pre vývoj vakcíny proti koronavírusu. J Immunol Res. 2020;2020:7201752. pmid:32695833
7. 8. Lu B, Tao L, Wang T, Zheng Z, Li B, Chen Z a kol. Humorálne a bunkové imunitné reakcie vyvolané 3a DNA vakcínami proti závažnému akútnemu respiračnému syndrómu (SARS) alebo koronavírusu podobnému SARS u myší. Clin Vaccine Immunol. 2009;16(1):73–7. pmid:18987164
8. 9. Bower JF, Yang X, Sodroski J, Ross TM. Vyvolanie neutralizačných protilátok pomocou DNA vakcín exprimujúcich rozpustné triméry obalového glykoproteínu vírusu ľudskej imunodeficiencie typu 1 konjugované s C3d. J Virol. 2004;78(9):4710–9. pmid:15078953
9. 10. Zakhartchouk AN, Viswanathan S, Moshynskyy I, Petric M, Babiuk LA. Optimalizácia DNA vakcíny proti SARS. DNA Cell Biol. 2007;26(10):721–6. pmid:17665998
10. 11.Gary EN, Weiner DB. DNA vakcíny: hlavný čas je teraz. Curr Opin Immunol. 2020;65:21–7. pmid:32259744
11. 12. Smith TRF, Patel A, Ramos S, Elwood D, Zhu X, Yan J a kol. Imunogenicita DNA vakcíny kandidáta na COVID-19. Nat Commun. 2020; 11 (1): 2601. pmid:32433465
12. 13.Yu J, Tostanoski LH, Peter L, Mercado NB, McMahan K, Mahrokhian SH a kol. Ochrana DNA vakcínou proti SARS-CoV-2 u makakov rhesus. Veda. 2020;369(6505):806–11. pmid:32434945
13. 14.Jorritsma SHT, Gowans EJ, Grubor-Bauk B, Wijesundara DK. Spôsoby podávania na zvýšenie bunkovej absorpcie a imunogenicity DNA vakcín. Vakcína. 2016;34(46):5488–94. pmid:27742218
14. 15. Kudchodkar SB, Choi H, Reuschel EL, Esquivel R, Jin-Ah Kwon J, Jeong M a kol. Rýchla reakcia na vznikajúce infekčné ochorenie – Poučenie získané z vývoja syntetickej DNA vakcíny zameranej na vírus Zika. Mikróby infikujú. 2018;20(11–12):676–84. pmid:2955534516. Adam L, Tchitchek N, Todorová B, Rosenbaum P, Joly C, Poux C a kol. Vrodený molekulárny a bunkový podpis v koži, ktorý predchádza dlhotrvajúcim reakciám T buniek po očkovaní elektroporovanou DNA. J Immunol. 2020;204(12):3375–88. pmid:32385135
15. 17. Lin F, Shen X, McCoy JR, Mendoza JM, Yan J, Kemmerrer SV a kol. Nové prototypové zariadenie na dodávanie DNA vakcíny zosilnenej elektroporáciou súčasne do kože aj svalov. Vakcína. 2011;29(39):6771–80. pmid:21199706
16. 18. Williams M, Ewing D, Blevins M, Sun P, Sundaram AK, Raviprakash KS a kol. Zvýšená imunogenicita a ochranná účinnosť tetravalentnej DNA vakcíny proti horúčke dengue pomocou elektroporácie a intradermálneho podávania. Vakcína. 2019;37(32):4444–53. pid:31279565
17. 19. Ramakrishnan MA. Stanovenie 50 % koncového titra pomocou jednoduchého vzorca. Svet J Virol. 2016;5(2):85–6. pmid:27175354
18. 20.Corman VM, Landt O, Kaiser M, Molenkamp R, Meijer A, Chu DK a kol. Detekcia nového koronavírusu (2019-nCoV) z roku 2019 pomocou RT-PCR v reálnom čase. Euro Surveill. 2020. pid:31992387
19. 21. Kou Y, Xu Y, Zhao Z, Liu J, Wu Y, You Q a kol. Signálna sekvencia tkanivového aktivátora plazminogénu (tPA) zvyšuje imunogenicitu vakcíny na báze MVA proti tuberkulóze. Immunol Lett. 2017;190:51–7. pmid:28728855
20. 22. Xia S, Zhu Y, Liu M, Lan Q, Xu W, Wu Y a kol. Mechanizmus fúzie 2019-nCoV a fúznych inhibítorov zacielených na doménu HR1 v spike proteíne. Cell Mol Immunol. 2020;17(7):765–7. pmid:32047258