Dvojité modulačné účinky diosmínu na procesy tvorby obličkových kameňov šťavelanu vápenatého: kryštalizácia, rast, agregácia, adhézia kryštálových buniek, internalizácia do renálnych tubulárnych buniek a invázia cez extracelulárnu matricu
Mar 16, 2022
pre viac informácií:{0}}
Supaporn Khamchuna,b,c,1, Sunisa Yoodeea,1, Visith Thongboonkerda,*
aJednotka lekárskej proteomiky, Úrad pre výskum a vývoj, Lekárska fakulta Siriraj Hospital, Mahidol University, Bangkok 10700, Thajsko
bKatedra medicínskej technológie, School of Allied Health Sciences, University of Phayao, Phayao 56000, Thajsko
cJednotka excelentnosti v integratívnej molekulárnej biomedicíne, School of Allied Health Sciences, University of Phayao, Phayao 56000, Thajsko
Kľúčové slová: Bioaktívna zlúčenina, Flavonoid, Inhibítor, Modulátor, Nefrolitiáza, Promótor, Urolitiáza
ABSTRAKT
Diosminje prírodný flavónový glykozid (bioflavonoid) nachádzajúci sa v ovocí a rastlinách s niekoľkými farmakologickými aktivitami. Široko sa používa ako doplnok stravy alebo terapeutické činidlo pri rôznych chorobách/poruchách. Hoci sa odporúča, dôkaz o jeho ochranných mechanizmoch protiobličkykamenné ochorenie (nefrolitiáza/urolitiáza), najmä monohydrát oxalátu vápenatého (CaOx) (COM), ktorý je najbežnejším typom, zostal nejasný. V tejto štúdii sme teda systematicky hodnotili účinkydiosmín(pri 2,5–160 nM) v rôznych štádiáchobličkyprocesy tvorby kameňov vrátane kryštalizácie COM, rastu kryštálov, agregácie, adhézie kryštál-bunka, internalizácie do renálnych tubulárnych buniek a invázie cez extracelulárnu matricu (ECM). Ukázali to výsledkydiosmínmali od dávky závislé modulačné účinky na všetky spomenuté procesy COM obličkových kameňov.Diosminvýznamne zvýšil počet a hmotnosť COM kryštálov počas kryštalizácie, ale znížil veľkosť a rast kryštálov. Zatiaľ čodiosmínpodporoval agregáciu kryštálov, inhiboval adhéziu kryštál-bunka a internalizáciu do renálnych tubulárnych buniek. Nakoniec diosmín podporil inváziu kryštálov cez ECM. Naše údaje poskytujú dôkazy preukazujúce inhibičné aj podporné účinky diosmínu na COMobličkyprocesy tvorby kameňa. Na základe týchto duálnych modulačných aktivít diosmínu je jeho antiurolitiázová úloha pochybná a je potrebné venovať pozornosť jeho použitiu vobličkykamenná choroba.
1. Úvod
Diosmin(3′,5,7-trihydroxy-4′-metoxyflavón-7-ramnoglukozid) je prírodný bioflavonoid bežne sa vyskytujúci v rôznych rastlinách a ovocí, najmä v Citrus spp. [1,2]. Môže byť syntetizovaný alebo odvodený z iného flavonoidu, hesperidínu [1,2]. Diosmín samotný alebo v kombinácii s hesperidínom sa široko používa ako flebotropný liek na liečbu venóznych a lymfatických porúch, ako je chronická venózna insuficiencia a hemoroidy [3,4]. Okrem toho diosmín vykazuje niekoľko ďalších biologických a farmakologických aktivít, vrátane antioxidačných a protizápalových aktivít [5,6], antimutagénnych a antineoplastických vlastností [7,8], antibiotických účinkov [9], antihyperglykemických vlastností [ 10] a ochranné účinky proti multiorgánovým poškodeniam, tj.
kardiovaskulárne [11], retinálne [12],obličky, poškodenie pečene a mozgu [13].
Obličkykamenná choroba (alebo nefrolitiáza/urolitiáza) je spôsobená pevným kameňom vyvinutým a uloženým v obličkách a postihuje ľudí vo všetkých oblastiach zemegule s vysokou mierou recidívy [14–17]. Spomedzi všetkých rôznych príčinných kryštálov je šťavelan vápenatý (CaOx), najmä monohydrátová forma (COM), najpatogénnejšou a najbežnejšou kryštalickou zložkou, ktorá sa nachádza u tvorcov kameňov (pacienti s obličkovými kameňmi) [18]. Mechanicky majú kryštály COM najsilnejšiu adhezívnu schopnosť a najviac cytotoxických účinkov na renálne tubulárne epitelové bunky [19,20]. Počas patogenézy kameňa majú model Randallovho plaku aj intratubulárna hypotéza spoločné znaky procesov tvorby kameňov COM, vrátane kryštalizácie COM, rastu, agregácie, retencie povrchovou adhéziou na renálnych tubulárnych bunkách alebo obličkovej panvičke, internalizácie do buniek a invázie do renálneho interstícia cez extracelulárnu matricu (ECM) [21,22].
V poslednej dobe sa veľa štúdií zameralo na objavovanie liekov s použitím liečivých rastlín/ovocí a ich bioaktívnych zlúčenín s cieľom zabrániť tvorbe nových a/alebo opakujúcich sa kameňov. Viaceré predchádzajúce správy ukázali, že niektoré bioaktívne zlúčeniny, najmä fenolové zlúčeniny (polyfenol, flavonoid, flavónový glykozid atď.) extrahované z viacerých liečivých rastlín/ovocí, majú preventívne účinky proti patogénnym mechanizmomobličkykamenné ochorenie in vitro aj in vivo [23–25]. Medzi týmito prospešnými látkami niekoľko správ naznačilo, že diosmín môže zabrániť ukladaniu kryštálov CaOx v tkanive obličiek na zvieracích modeloch [26,27]. Jeho presná modulačná úloha (inhibícia alebo podpora) a mechanizmy (štádiá alebo procesy tvorby kameňov) pri tvorbe obličkových kameňov COM však neboli skúmané. Táto štúdia teda systematicky hodnotila účinkydiosmín(pri 2,5–160 nM) v rôznych štádiáchobličkyprocesy tvorby kameňov, vrátane kryštalizácie, rastu kryštálov, agregácie, adhézie kryštál-bunka, internalizácie do renálnych tubulárnych buniek a invázie prostredníctvom ECM.
Kliknite naDávkovanie Cistanche tubulosa pre funkciu obličiek
2. Materiály a metódy
2.1. Prípravok diosmínu
Diosmin(Tokyo Chemical Industry; Tokio, Japan) sa rozpustilo v 100 percentnom dimetylsulfoxide (DMSO) (Sigma-Aldrich; St. Louis, MO) a pripravili sa pracovné alikvóty v konečných koncentráciách 2,5, 5, 10, 20, 40, 80 a 160 nM na skúmanie jeho účinkov na kryštály COM. Okrem toho sa ako negatívna kontrola vo všetkých experimentoch použil 100 percent DMSO.
2.2. Bunková kultúra
MDCK renálna tubulárna epiteliálna bunková línia odvodená z distálneho tubulárneho segmentu nefrónu (ATCC; Manassas, VA) bola propagovaná v Eagleovom minimálnom esenciálnom médiu (MEM) (Gibco; Grand Island, NY) doplnenom 10 percentným fetálnym bovinným sérom (FBS), 60 U/ml penicilínu G (Sigma-Aldrich) a 60 ug/ml streptomycínu (Sigma-Aldrich). Bunky sa udržiavali vo zvlhčenom inkubátore s 5 percentami CO2 pri 37 °C.
2.3. COM kryštalizačný test
Kryštalizácia COM sa uskutočnila tak, ako bolo opísané vyššie [28,29]. Stručne, 500 ul 10 mM CaCl2⋅2H20 v kryštalizačnom pufri (obsahujúcom 10 mM Tris-HCl a 90 mM NaCl) (pH 7,4) sa pridalo do každej jamky 24-jamkovej platne (Corning Inc.; Corning, NY). Rovnaký objem (4 ul) kryštalizačného pufra (slepá kontrola), DMSO (negatívna kontrola) alebodiosmín(2,5, 5, 10, 20, 40, 80 alebo 160 nM) sa zmiešal s CaCl2. Nakoniec sa pridalo 500 ul 1,0 mM Na2C204 v kryštalizačnom pufri, aby sa dosiahli konečné koncentrácie CaCl2 a Na2C204 na 5 mM a 0,5 mM. Zmes sa inkubovala pri 25 °C počas 1 hodiny a potom sa skúmala. Snímky kryštálov boli zachytené náhodne z najmenej 15 vysokovýkonných polí (HPF) pod mikroskopom Nikon Eclipse Ti-S s invertovaným fázovým kontrastom (Nikon; Tokio, Japonsko). Veľkosť a počet kryštálov sa merali z najmenej 15 HPF pre každú vzorku pomocou softvéru NIS Element D verzie 4.11 (Nikon). Hmotnosť kryštálov sa vypočítala z najmenej 100 kryštálov v 15 HPF pomocou nasledujúceho vzorca: Hmotnosť kryštálov (µm2/HPF)=Priemerná veľkosť kryštálov v každom poli (µm2) × Počet kryštálov v každom poli (/HPF) ( 1)
2.4. Test rastu kryštálov COM
Test rastu kryštálov sa uskutočnil tak, ako bolo opísané vyššie [30,31].
Stručne, rovnaký objem (500 ul) 10 mM CaCl2⋅2H20 a 1,0 mM Na2C204 v kryštalizačnom pufri sa zmiešal (1:1) (obj./obj.) v každej jamke { {12}}jamková platňa. Zmes sa inkubovala pri 25 °C počas 1 hodiny, aby sa umožnila úplná kryštalizácia. V tomto bode (T0) sa použije rovnaký objem (4 ul) kryštalizačného pufra (slepá kontrola), DMSO (negatívna kontrola) alebodiosmín(2,5, 5, 1{{10}}, 20, 40, 80 alebo 160 nM) sa pridal do každej jamky a zmes sa ďalej inkubovala počas 60 minút (T60). Pri T0 a T60 boli snímky kryštálov zachytené náhodne z najmenej 15 HPF pod mikroskopom Nikon Eclipse Ti-S s inverzným fázovým kontrastom. Veľkosti kryštálov v T0 a T60 sa merali pomocou softvéru NIS Element D verzie 4.11 (Nikon), zatiaľ čo rast kryštálov (reprezentovaný Δ veľkosť kryštálov) sa vypočítal z najmenej 100 kryštálov v 15 HPF pomocou nasledujúceho vzorca: Δ Veľkosť kryštálov (µm2)=Veľkosť kryštálov pri T60 − Veľkosť kryštálov pri T0 (2)
2.5. Test agregácie kryštálov COM
Test agregácie kryštálov sa uskutočnil tak, ako bolo opísané vyššie [32,33]. Kryštály COM sa vytvorili ako je uvedené vyššie v teste rastu kryštálov, ale s väčším objemom v 50-ml kónickej skúmavke (Corning Inc.) a potom sa zozbierali centrifugáciou pri 2000 g počas 5 minút. Supernatant sa odstránil, zatiaľ čo kryštály COM sa trikrát premyli metanolom. Po ďalšej centrifugácii pri 2000 g počas 5 minút sa metanol zlikvidoval a kryštály sa sušili na vzduchu cez noc pri 25 °C. Kryštály COM (1000 ug suchej hmotnosti) boli resuspendované v 1 ml kryštalizačného pufra v každej jamke 6-jamkovej platne (Corning Inc.). Rovnaký objem (4 ul) kryštalizačného pufra (slepá kontrola), DMSO (negatívna kontrola) alebodiosmín(2,5, 5, 10, 20, 40, 80 alebo 160 nM) sa pridal do suspenzie COM kryštálov v každej jamke. Platňa sa nepretržite pretrepávala v trepacom inkubátore (Zhicheng; Shanghai, Čína) pri 150 otáčkach za minútu a 25 °C počas 1 hodiny. Potom sa skúmala a zobrazila tvorba agregátu kryštálov COM (definovaného ako "zostava troch alebo viacerých jednotlivých kryštálov COM, ktoré sú navzájom tesne spojené" [32]) pod mikroskopom Nikon Eclipse Ti-S s inverzným fázovým kontrastom. Počet kryštálových agregátov COM sa vypočítal z najmenej 15 náhodných HPF na jamku.
2.6. Test adhézie kryštálov a buniek COM
Test adhézie kryštál-bunka sa uskutočnil tak, ako bolo opísané vyššie [34,35]. Stručne, kryštály COM sa vytvorili, ako je uvedené vyššie, v 50-ml kónickej skúmavke a potom sa zozbierali centrifugáciou pri 2000 g počas 5 minút. Supernatant sa odstránil, zatiaľ čo kryštály COM sa trikrát premyli metanolom. Po ďalšej centrifugácii pri 2000 g počas 5 minút sa metanol zlikvidoval a kryštály sa sušili na vzduchu cez noc pri 25 °C. Kryštály boli pred zásahom do buniek dekontaminované UV žiarením počas 30 minút.
MDCK bunky (v hustote 2 x 105 buniek/jamka) boli naočkované a pestované v každej jamke 6-jamkovej platne (Corning Inc.) počas 48 hodín, aby sa získala konfluentná monovrstva. Kultivačné médium sa potom obnovilo pred pridaním kryštálov COM (100 ug suchých kryštálov na ml kultivačného média). Rovnaký objem (4 ul) kryštalizačného pufra (slepá kontrola), DMSO (negatívna kontrola) alebodiosmín(2,5, 5, 10, 20, 40, 80 alebo 160 nM) sa pridal do každej jamky. Bunky sa ďalej inkubovali vo zvlhčenom inkubátore s 5 percentami CO2 pri 37 °C počas 1 hodiny. Potom sa bunky päťkrát dôkladne premyli PBS a zobrazili sa pod mikroskopom Nikon Eclipse Ti-S s inverzným fázovým kontrastom. Počet zostávajúcich kryštálov COM priľnutých k povrchu renálnych tubulárnych buniek sa vypočítal z najmenej 15 náhodných polí na jamku.
Cistanche pre funkciu obličiek
2.7. Test internalizácie kryštálov COM
Fluorescenčne označené kryštály COM boli vytvorené tak, ako bolo opísané vyššie [36,37]. Zloženie/koncentrácie chemikálií použitých na kryštalizáciu boli rovnaké, ako je uvedené vyššie pre čisté (neoznačené) kryštály, ale 0,1 µg/ml fluoresceín izotiokyanát (FITC) (Thermo Scientific Pierce; Rockford, IL) bol pridaný do roztoku CaCl2⋅2H2O pred zmiešaním s Na2C204. Nasledujúce kroky (kryštalizácia a zber) sa uskutočnili tak, ako je uvedené vyššie, ale v tme.
Na vyhodnotenie internalizácie kryštálov do renálnych tubulárnych epiteliálnych buniek sa bunky MDCK (v hustote 2 x 105 buniek/jamka) naočkovali a pestovali v každej jamke 6-jamkovej platne (Corning Inc.) počas 48 hodín, aby sa získali splývajúca monovrstva. Bunková monovrstva bola inkubovaná s FITC-značenými COM kryštálmi (1000 ug kryštálov/ml média) vo zvlhčenom inkubátore s 5 percentami CO2 pri 37 °C počas 1 hodiny. Potom boli bunky premyté PBS a inkubované s roztokom trypsín-EDTA, aby sa eliminovali neinternalizované (adherujúce aj neadherentné) kryštály. Percento buniek s internalizovanými kryštálmi sa kvantifikovalo z celkového počtu 10 000 získaných udalostí pomocou prietokového cytometra (BD Accuri C6) (BD Biosciences; San Jose, CA). Bunky inkubované s obyčajnými (neoznačenými) kryštálmi COM sa použili na prednastavenie šumu a prahu pre pozitívny fluorescenčný signál. Bunky s pozitívnymi fluorescenčnými signálmi sa potom spočítali a použili na takýto percentuálny výpočet.
2.8. Invázia kryštálov COM prostredníctvom testu ECM
Kryštály COM boli pripravené tak, ako je opísané vyššie pre agregáciu kryštálov a testy adhézie kryštál-bunka. Test invázie kryštálov sa uskutočnil podľa protokolu stanoveného skôr [38,39]. Stručne povedané, celkovo 20 ug kryštálov COM potiahnutých kryštalizačným pufrom (slepá kontrola), DMSO (negatívna kontrola), albumínom (Sigma-Aldrich) (pozitívna kontrola) alebodiosmín(2,5, 5, 1{{10}}, 20, 40, 80 alebo 160 nM) sa pridali do 200 ul MEM. Následne sa zmiešalo 200 ul 0,3 pM Lys-plazminogénu (Fitzgerald Industries international; Acton, MA) v PBS a inkubovalo sa s komplexom kryštál-proteín pri 37 °C počas 1 hodiny. Nenaviazaný plazminogén sa odstránil centrifugáciou pri 2000 g počas 5 minút a peleta sa raz premyla PBS. Potom sa 100 ul 0,15 pM urokinázového aktivátora plazminogénu (uPA) (Fitzgerald Industries International) v PBS zmiešalo s komplexom kryštál-proteín-plazminogén/plazmín. Zmes sa potom pridala na vrch matricového gélu vo vnútri migračnej komory ECM a inkubovala sa pri 37 °C. Po 24-hodinovej inkubácii sa roztok, ktorý zostal v hornej časti migračnej komory, odstránil pomocou gázy alebo hodvábneho papiera. Napadnuté kryštály COM vo vnútri matricového gélu sa potom zobrazili pomocou svetelného mikroskopu s režimom diferenciálneho interferenčného kontrastu (DIC) (Nikon H600L). Invázna vzdialenosť kryštálov sa merala a spriemerovala z najmenej 15 polí s nízkym výkonom (LPF) v tej istej komore pomocou softvéru NIS Element D verzie 4.11 (Nikon).
2.9. Štatistická analýza
Všetky vyššie uvedené experimenty sa uskutočnili trojmo (tri nezávislé experimenty) a kvantitatívne údaje sú uvedené ako priemer ± SEM. Viacnásobné porovnania sa uskutočnili s použitím jednosmernej analýzy rozptylu (ANOVA) s Tukeyho post-hoc testom. Na určenie vzťahu medzi premennými bol vykonaný Pearsonov korelačný test. Všetky štatistické analýzy sa uskutočnili pomocou softvéru SPSS (verzia 18) (IBM SPSS; Armonk, NY). Hodnota P menšia ako 0,05 sa považovala za štatisticky významnú.
3. Výsledky
3.1. Účinok diosmínu na kryštalizáciu COM
Kryštalizácia je jedným zo základných počiatočných krokovobličkyprocesy tvorby kameňov všetkých typov. Po 1- hodinách kryštalizácie s alebo bezdiosmínpri rôznych koncentráciách (2,5, 5, 10, 20, 40, 80 alebo 160 nM) sa merala veľkosť a počet kryštálov COM a vypočítala sa hmotnosť kryštálov. Kryštalizačný pufor a riedidlo DMSO slúžili ako slepé a negatívne kontroly. Údaje ukázali, že všetky dávky (2,5–160 nM) disomínu významne znížili veľkosť kryštálov, ale zvýšili počet kryštálov spôsobom závislým od dávky v porovnaní so slepými a negatívnymi kontrolami (obr. 1A–1C). V súlade s počtom kryštálov sa hmotnosť kryštálov zvyšovala v závislosti od dávky (obr. 1D). Celkovo tieto údaje naznačujú, že diosmín podporuje kryštalizáciu COM (neokryštály).
3.2. Účinok diosmínu na rast kryštálov COM
Modulačný účinokdiosmínna COM rast kryštálov sa hodnotil meraním zmeny veľkosti kryštálov (A veľkosť kryštálov) po 60- min ďalšej inkubácie po dokončení počiatočného kryštalizačného kroku, keď neokryštály chýbali. Výsledky ukázali, že všetky dávky (2,5–160 nM) dizomínu významne znížili veľkosť A kryštálov spôsobom závislým od dávky v porovnaní so slepou a negatívnou kontrolou (obr. 2). Tieto zistenia naznačujú, že diosmín inhibuje rast kryštálov COM.
3.3. Účinok diosmínu na agregáciu kryštálov COM
Okrem rastu kryštálov je ďalším dôležitým krokom agregácia jednotlivých kryštálov, ktoré k sebe pevne priľnúobličkypatogenéza kameňov. Vysoký stupeň agregácie kryštálov môže v konečnom dôsledku viesť k zväčšeniu kameňa a obštrukcii malého renálneho tubulárneho lúmenu. V porovnaní so slepou a negatívnou kontrolou,diosmínpri 10–160 nM sa v závislosti od dávky zvýšil počet agregátov kryštálov COM (obr. 3). Tieto výsledky naznačujú, že diosmín podporuje agregáciu kryštálov COM.
Cistanche pre funkciu obličiek
3.4. Účinok diosmínu na adhéziu kryštálov COM
Zadržanie príčinných kryštálov je jedným z rozhodujúcich krokov preobličkytvorba kameňov a môže byť vyvolaná adhéziou kryštál-bunka, ktorá zabraňuje vypudeniu kryštálov spolu s odtokom moču. Takto sme vyhodnotili modulačnú aktivitu odiosmínna adhézii kryštálov a buniek COM. Údaje ukázali, že diosmín v koncentrácii 5–160 nM významne znížil adhezívnu schopnosť kryštálov COM na renálnych tubulárnych bunkách v závislosti od dávky v porovnaní so slepými a negatívnymi kontrolami (obr. 4). Tieto údaje naznačujú, že diosmín inhibuje adhéziu COM kryštál-bunka.
3.5. Účinok diosmínu na internalizáciu kryštálov COM do renálnych tubulárnych buniek
Po adhézii môžu byť niektoré kryštály COM internalizované do renálnych tubulárnych buniek a spôsobiť niekoľko následných bunkových odpovedí [37,40]. Internalizácia kryštálov sa vyhodnotila použitím kryštálov COM značených FITC a kvantifikovala sa prietokovou cytometriou. Na odčítanie technického šumu a na zabezpečenie toho, aby intenzita fluorescencie bola zo signálu FITC, sa použili obyčajné kryštály COM (bez označenia). V porovnaní so slepou a negatívnou kontrolou sa percento buniek s internalizovanými kryštálmi výrazne znížilodiosmínpri 10–160 nM spôsobom závislým od dávky (obr. 5). Zistenia naznačujú, že disomín inhibuje internalizáciu kryštálov COM do renálnych tubulárnych buniek.
3.6. Účinok diosmínu na inváziu kryštálov COM prostredníctvom ECM
Invázia kryštálov prostredníctvom ECM je patogénny/deštruktívny proces počasobličkypatogenézy kameňov, ktoré môžu spustiť rôzne zápalové reakcie a kaskády, čím sa zhoršia mechanizmy ochorenia. Tento jav sme skúmali pomocou zavedeného protokolu založeného na plazminogén-plazmínovej aktivite komplexu kryštál-proteín [38,39]. Výsledky ukázali, že všetky dávky disomínu (2,5–160 nM) významne zvýšili inváziu kryštálov COM cez ECM spôsobom závislým od dávky (obr. 6). zaujimave,diosmínpri 160 nM by mohol podporovať inváziu kryštálov COM porovnateľnú s albumínom, ktorý je známym silným promótorom invázie kryštálov COM [41] (obr. 6). Tieto výsledky naznačujú, že diosmín silne podporuje inváziu kryštálov COM cez ECM.
Obr. 1. Účinokdiosmínpri kryštalizácii COM. Kryštalizačný test sa uskutočnil s rovnakým objemom (4 ul) kryštalizačného pufra (slepá kontrola), DMSO (negatívna kontrola) alebo diosmínu (2,5–160 nM). (A): Kryštalická morfológia v každom stave po 1-h kryštalizácii. Pôvodné zväčšenie bolo 400× pre všetky panely. (B): Veľkosť kryštálov. (C): Číslo kryštálu. (D): Kryštalická hmota (pozri vzorec 1 v "Materiály a metódy") sa analyzovala z aspoň 100 kryštálov v 15 HPF. Každý stĺpec predstavuje priemer ± SEM údajov odvodených z 3 nezávislých experimentov. *=s< 0.05="" vs.="" blank="" control;="" #="">< 0.05="" vs.="" dmso.="">
Obr. 2. Účinokdiosmínna rast kryštálov COM. Test rastu kryštálov sa uskutočnil po dokončení kryštalizácie (aby sa zabránilo neokryštalizácii) s rovnakým objemom (4 ul) kryštalizačného pufra (slepá kontrola), DMSO (negatívna kontrola) alebo diosmínu (2,5–16 0 nM). (A): Morfológia kryštálu v každej podmienke v T0 a T60. Pôvodné zväčšenie bolo 400 × pre všetky panely. (B)-(J): Histogramy veľkostí kryštálov merané z jednotlivých kryštálov pri TO a T60 v každej skupine. (K): A veľkosť kryštálov (pozri vzorec 2 v "Materiály a metódy") sa analyzovala z aspoň 100 kryštálov v 15 HPF. Každý stĺpec predstavuje priemer ± SEM údajov odvodených z 3 nezávislých experimentov. *= p < 0,05="" vs.="" prázdna="" kontrola;="" #="p">< 0,05="" v="" porovnaní="" s="">
Obr. 3. Účinokdiosmínna agregácii kryštálov COM. Test agregácie kryštálov sa uskutočnil s rovnakým objemom (4 ul) kryštalizačného pufra (slepá kontrola), DMSO (negatívna kontrola) alebo diosmínu (2,5–160 nM). (A): Mikrofotografie agregovaných kryštálov COM (označené bodkovanými krúžkami). Pôvodné zväčšenie bolo 400 × pre všetky panely. (B): Počet kryštálových agregátov sa vypočítal z najmenej 15 náhodných HPF v každej jamke. Každý stĺpec predstavuje priemer ± SEM údajov odvodených z 3 nezávislých experimentov. *=s< 0.05="" vs.="" blank="" control;="" #="p" <="" 0.05="" vs.="" dmso.="">
Obr. 4. Účinokdiosmínna adhézii kryštálov a buniek COM. Test adhézie kryštálových buniek sa uskutočnil s rovnakým objemom (4 ul) kryštalizačného pufra (slepá kontrola), DMSO (negatívna kontrola) alebo diosmínu (2,5–160 nM). (A): Mikrofotografie zostávajúcich kryštálov, ktoré pevne priľnuli na bunkovú monovrstvu po odstránení nenaviazaných kryštálov intenzívnym premytím PBS. Pôvodné zväčšenie bolo 200 × pre všetky panely. (B): Počet priľnutých kryštálov sa vypočítal z najmenej 15 náhodných polí v každej jamke. Každý stĺpec predstavuje priemer ± SEM údajov odvodených z 3 nezávislých experimentov. *{{8 str<0.05 vs.="" blank="" control;="" #="p"><0.05 vs.="">
Obr. 5. Účinokdiosmínna internalizáciu kryštálov COM do renálnych tubulárnych buniek. Test internalizácie kryštálov sa uskutočnil s použitím kryštálov COM označených FITC (FITC-COM), zatiaľ čo čisté (neoznačené) kryštály COM sa použili na odčítanie pozadia/šumu. Test sa uskutočnil s rovnakým objemom (4 ul) kryštalizačného pufra (slepá kontrola), DMSO (negatívna kontrola) alebo diosmínu (2,5–160nM). (A): Prietoková cytometrická bodová analýza veľkosti (os y) a intenzity fluorescencie FITC (os x) buniek po odstránení neinternalizovaných kryštálov pomocou 0,1 percenta trypsínu/2,5 mM EDTA. (B): Percento buniek s internalizovanými FITC-značenými COM kryštálmi. Každý stĺpec predstavuje priemer ± SEM údajov odvodených z 3 nezávislých experimentov. *= s<0.05 vs.="" fitc-com="" +="" blank="" control;="" #="">< 0.05="" vs.="" fitc-com="" +="" dmso.="">
Obr. 6. Účinokdiosmíno invázii kryštálov COM cez ECM. Invázia kryštálov prostredníctvom testu ECM sa uskutočnila pomocou kryštálov COM potiahnutých kryštalizačným pufrom (slepá kontrola), DMSO (negatívna kontrola), albumínom (pozitívna kontrola) alebo diosmínom (2, 5–160 nM). (A): Mikrofotografie kryštálov COM preniknutých alebo migrovaných cez migračnú komoru ECM. Pôvodné zväčšenie bolo 100 × pre všetky panely. (B): Vzdialenosť invázie kryštálov sa merala z najmenej 15 náhodných LPF v každej komore. Každý stĺpec predstavuje priemer ± SEM údajov odvodených z 3 nezávislých experimentov. *= s<0.05 vs.="" blank="" control;="" #="p" <="" 0.05="" vs.="">
4. Diskusia
Ochorenie obličkových kameňov je spôsobené tvorbou kameňov vo vnútriobličkya pelvocalyceálny systém. Bežné procesy tvorby obličkových kameňov zahŕňajú kryštalizáciu COM, rast, agregáciu, retenciu adhéziou kryštál-bunka a inváziu cez renálne interstícium bohaté na ECM [21,22]. Existuje niekoľko pokusov predchádzať tomuto ochoreniu pomocou rôznych liekov a/alebo výživových doplnkov. Mnoho nedávnych dôkazov uvádza, že flavonoidy, flavónové glykozidy a iné zlúčeniny extrahované z citrusových plodov môžu mať preventívne účinky na obličkové kamene a iné poruchy [23–25]. Medzi týmito,diosmín, prírodný flavónový glykozid a derivát hesperidínu, ktorý sa nachádza hlavne v citrusových plodoch [1,2], sa predpokladá, že hrá preventívnu úlohu proti poraneniu a poškodeniuobličkytkaniva [13,42]. Navyše, jeho antiurolitiázová úloha bola hlásená v niekoľkých predchádzajúcich štúdiách na zvieracích modeloch [26,27]. Priaznivé účinky a základné mechanizmy diosmínu pri prevencii obličkových kameňov však zostali nejasné. Skúmali sme teda modulačnú aktivitu diosmínu na kryštáloch COM. Systematické analýzy sa robili na rôznych stupňoch COMobličkytvorba kameňov, vrátane kryštalizácie, rastu kryštálov, agregácie, adhézie kryštál-bunka, internalizácie do renálnych tubulárnych buniek a invázie prostredníctvom ECM.
Po perorálnom užitídiosmínjeho plazmatická hladina u ľudí sa pohybuje od {{0}},5 do 200 ng/ml (alebo 0,8–300 nM) [43,44]. Maximálna plazmatická koncentrácia (Cmax) je približne 50 ng/ml (alebo 85 nM) [43,44]. Preto boli dávky diosmínu použité v našej súčasnej štúdii (2, 5–160 nM) vo farmakologicky relevantnom rozsahu pre jeho farmakokinetiku. Pretože DMSO sa použil ako riedidlo na úplné rozpustenie diosmínu podľa odporúčania, DMSO sa v tejto štúdii použil ako negatívna kontrola okrem slepej kontroly, aby sa zabezpečilo, že nedochádza k žiadnym účinkom samotného riedidla, ktoré by mohli interferovať s interpretáciou údajov. Vo všetkých testoch údaje ukázali, že neboli pozorované žiadne významné účinky DMSO a všetky kvantitatívne údaje odvodené od negatívnej kontroly boli porovnateľné s údajmi slepej kontroly.
COM kryštalizačný test odhalil, že všetky koncentráciediosmín(2,5, 5, 10, 20, 40, 80 a 160 nM) mohli znížiť veľkosť kryštálov COM, ale na druhej strane zvýšiť počet kryštálov. Keďže kryštálová hmota je konečným produktom veľkosti aj počtu kryštálov a je relevantnejšia, aby odrážala stupeň kryštalizácie COM, potom sme vyhodnotili, či diosmín ovplyvnil tento kryštálový index. Údaje ukázali, že všetky koncentrácie diosmínu mali podporný účinok na hmotnosť kryštálov COM, čo je v súlade s údajmi o počte kryštálov. Po kryštalizácii môžu kryštály COM ďalej rásť do väčšej veľkosti pre ďalší krokobličkytvorba kameňov.
Na rozdiel od kryštalizácie, diosmín vo všetkých koncentráciách vykazoval inhibičný účinok na rast kryštálov COM spôsobom závislým od dávky. Niektoré predchádzajúce štúdie uvádzajú, že rozpustnosť kryštálov CaOx možno zvýšiť derivátmi hydroxyantrachinónov s glykozyláciou [45]. Okrem toho sa prítomnosť cukrov v takýchto bioaktívnych zlúčeninách môže viazať s voľným vápenatým iónom pravdepodobne v dôsledku hydroxylových skupín v molekulárnej štruktúre, čím sa inhibuje tvorba kryštálov CaOx [45,46]. Diosmín môže tiež ovplyvniť prechod solubilizovaných vápenatých a oxalátových iónov na kryštalické častice COM v renálnej tubulárnej tekutine v procese kryštalizácie COM založenej na tomto mechanizme.
Napriek tomu bola agregácia kryštálov COM podporovaná 10–160 nMdiosmín, čo naznačuje schopnosť diosmínu pôsobiť ako spojovacia alebo adhezívna molekula na získavanie jednotlivých kryštálov, aby sa spojili a vytvorili kryštálové agregáty. Táto väzba tiež vedie k progresii adhéznych mostíkov medzi jednotlivými kryštálmi a môže vyvolať tvorbu veľkej štruktúry kryštálov COM, ktoré ľahko prispievajú k ukladaniu kamenných nidus vo vnútriobličky[32].
Retencia COM kryštálov prostredníctvom adhézie kryštálov na povrchu renálnych tubulárnych buniek bola preukázaná ako ďalší dôležitý krok pri tvorbe obličkových kameňov [47]. Naše údaje odhalili, že diosmín by mohol znížiť adhéznu schopnosť kryštálov COM viazať sa na apikálne povrchy renálnych tubulárnych buniek MDCK. Niektoré predchádzajúce štúdie ukázali, že glykozaminoglykány (polysacharidové zlúčeniny) potiahnuté na kryštáloch CaOx alebo exprimované na renálnych tubulárnych bunkách môžu interferovať s adhéznou schopnosťou kryštálov CaOx na renálne tubulárne bunky [48]. Navyše expresia kryštálových receptorov na renálnych tubulárnych bunkách je jedným z rozhodujúcich mechanizmov určujúcich adhéziu kryštál-bunka [21]. Zatiaľ čo kryštály CaOx indukujú poškodenie apikálnych membrán, najmä mikroklkov, niektoré polyfenoly, ako je epigalokatechín galát (EGCG), môžu zabrániť adhézii kryštál-bunka a poškodeniu buniek [49]. Navyše, flavonoidová látka v rôznych rastlinných extraktoch už skôr uvádzala, že zvyšuje hladinu pH moču, čo vedie k inhibícii adhézie kryštál-bunka [50,51]. Možno,diosmínmôže tiež zmierniť takéto bunkové poškodenie vyvolané COM, čím sa zníži adhézia kryštál-bunka.
Ukázalo sa, že internalizácia kryštálov COM sa prejavuje hlavne endocytózou prostredníctvom makropinocytózy sprostredkovanej aktínovým cytoskeletom [40]. Bolo hlásené, že flavonoidy, ako je kvercetín, ovplyvňujú aktínový cytoskelet potrebný pre makropinocytózu [52,53]. Naše zistenia ukázali, že diosmín významne znížil schopnosť buniek MDCK internalizovať kryštály COM. Takýto inhibičný účinok diosmínu môže byť spojený so zostavením alebo organizáciou aktínového cytoskeletu vo vnútri buniek, ktorý priamo ovplyvňuje dráhu makropinocytózy [54,55].
Po internalizácii boli kryštály COM degradované endolyzozómami, čo viedlo k zvýšeniu voľných vápnikových a oxalátových iónov v renálnom interstíciu [37]. Takéto zvýšenie vápnikových a oxalátových iónov môže viesť k nekryštalizácii COM v renálnom interstíciu [56,57]. Okrem toho prítomnosť intersticiálnych kryštálov COM môže byť spôsobená defektmi tesného spojenia a paracelulárnych adhéznych bariér, čo vedie k zvýšenej paracelulárnej permeabilite a translokácii kryštálov [58–60]. Tieto kryštály potom môžu preniknúť do renálneho interstícia cez ECM a následne spustiť niekoľko zápalových reakcií a poškodenia tkaniva [58–60]. V tejto štúdii sme pozorovali, že invázia kryštálov COM cez migračnú komoru ECM bola vyvolaná všetkými koncentráciami diosmínu. Diosmín sa môže viazať na povrchy kryštálov COM a interagovať so systémom plazminogén-plazmín, ktorý riadi migráciu kryštálov v migračnej komore ECM [38,39].
Cistanche pre obličky
Pretožediosmínindukovali inhibičné aj podporné účinky na rôzne rôzne procesy tvorby kameňov COM, preto sme ich vzťah určili pomocou Pearsonovho korelačného testu. Korelačná analýza odhalila, že počet kryštálov nepriamo koreluje s veľkosťou kryštálov a rastom kryštálov (A veľkosť kryštálov) (obr. 7A a B). Veľkosť kryštálov silne koreluje s rastom kryštálov (obr. 7C), ale nepriamo koreluje s hmotnosťou kryštálov (obr. 7D). Nakoniec kryštálová hmotnosť silne koreluje s počtom kryštálov a agregáciou kryštálov (obr. 7E a F). Z korelačnej analýzy údaje naznačujú, že počet kryštálov a hmotnosť kryštálov sú relevantnejšie na vyjadrenie kryštalizácie ako veľkosť kryštálov (obr. 7A, D a E). Okrem toho veľkosť neokryštálov počas kryštalizácie súvisí s rastom vopred vytvorených kryštálov (obr. 7C), zatiaľ čo stupeň kryštalizácie (podľa počtu kryštálov a hmotnosti kryštálov) úzko súvisí so stupňom agregácie kryštálov (obr. 7E a F). Tieto korelácie sú však s najväčšou pravdepodobnosťou špecifické pre účinky diosmínu, zatiaľ čo účinky iných modulátorov môžu alebo nemusia mať rovnaké korelácie. Napríklad fibronektín znižuje hmotnosť kryštálov a inhibuje rast kryštálov, ale podporuje agregáciu kryštálov [31]. Okrem toho intaktná životaschopná Escherichia coli zvyšuje veľkosť a hmotnosť kryštálov, ale nemá žiadny vplyv na počet kryštálov [33]. Tieto údaje naznačujú, že korelácie medzi rôznymi kryštálovými testami COM nie sú univerzálne pre všetky modulátory.
Nakoniec sme zhrnuli výsledky získané z rôznych testov a integrovali ich s patogénnymi mechanizmamiobličkykamenné ochorenie (pozri schémy na obr. 8). Z korelačnej analýzy vyplýva, že diosmín podporuje kryštalizáciu (obr. 8A). Medzi kryštalizáciou a rastom kryštálov,diosmínudržiava rovnováhu tým, že podporuje kryštalizáciu, ale na druhej strane inhibuje rast kryštálov (obr. 8B). Čo sa týka všetkých účinkov na samotné kryštály COM (bez zohľadnenia buniek a ECM, ktoré tiež zasahujú), podporná aktivita diosmínu je výraznejšia ako jeho inhibičná aktivita na kryštály COM, pretože podporuje kryštalizáciu aj agregáciu kryštálov, ale inhibuje iba rast kryštálov ( Obr. 8C). Hoci sa kryštalizácia zvyšuje, veľkosť kryštálov sa zmenšuje a je spojená s inhibíciou rastu (obr. 7C). Tieto údaje sú v súlade s výsledkami, ktoré uvádza Kavanagh et al. [61–63], čo dokazuje, že zvýšenie kryštalizácie vedie k poklesu presýtenia vápenatých a oxalátových iónov v roztoku, čím sa znižuje rast. Rast kryštálov však nie je jediným určujúcim faktoromobličkypatogenéza kameňa [64], najmä keď je kryštálová hmota zahltená a je spojená so zvýšením agregácie kryštálov (obr. 7F), čo môže zvýšiť šancu kryštálových materiálov uviaznuť v malých tubulárnych segmentoch (v intratubulárnej hypotéze), čím sa zvýši možnosť tvorby kameňa. Okrem toho predchádzajúca štúdia ukázala, že údaje sú v súlade s našimi zisteniami, čo naznačuje, že zvýšenie počtu kryštálov je spojené so zvýšením agregácie kryštálov a zväčšením kameňa [63].
Obr. 7. Analýza korelácií. (A)–(F): Korelácie medzi počtom kryštálov COM, veľkosťou kryštálov, Δ veľkosťou kryštálov, hmotnosťou kryštálov a množstvom kryštálových agregátov sa analyzovali pomocou Pearsonovho korelačného testu.
Obr. 8. Schéma sumarizujúca modulačné účinkydiosmínna COMobličkyprocesy tvorby kameňa. (A): Účinky diosmínu na kryštalizáciu COM. (B): Účinky diosmínu na kryštalizáciu COM a rast kryštálov. (C): Účinky diosmínu na kryštalizáciu, rast a agregáciu COM. (D): Účinky diosmínu na celý proces tvorby obličkových kameňov COM.
Keď sa zvažujú interakcie s renálnymi tubulárnymi bunkami a ECM, celkový obraz duálnych účinkovdiosmínna COM tvorba obličkových kameňov sa stáva oveľa jasnejšou (obr. 8D). Diosmín inhibuje adhéziu kryštál-bunka, čím znižuje internalizáciu kryštálov do buniek. To možno vysvetliť tým, že menšia veľkosť kryštálov COM má menšiu adhezívnu schopnosť viazať renálne tubulárne bunky v porovnaní s väčšími, ako sa uvádza v našej nedávnej štúdii [34] a predchádzajúcej štúdii inej skupiny [65]. Menšia adhézna schopnosť menších kryštálov COM je spôsobená ich menšou adhéznou silou k povrchu bunky a menším počtom receptorov kryštálov COM, ktoré sú na ne naviazané, ako bolo stanovené mikroskopiou atómovej sily a analýzou proteómu [34]. Diosmín tiež inhibuje internalizáciu kryštálov. Všimnite si, že proces internalizácie je dvojsečná zbraň, ktorá si vyžaduje starostlivý výklad. Internalizácia alebo endocytóza v jednom z obranných mechanizmov, ktoré bunky využívajú na elimináciu kryštálov endolyzozómami. Degradácia intaktných kryštálov však vytvára voľné vápenaté a oxalátové ióny, ktoré sa môžu presúvať z intracelulárneho kompartmentu do renálneho interstícia, kde môžu vytvárať neokryštály [56,57]. Na druhej strane diosmín podporuje inváziu kryštálov cez ECM, čo je jeden z mechanizmov dôležitých pre patogenézu obličkových kameňov (najmä v modeli Randallovho plaku) [58–60]. Celkovo obr. 8D sumarizuje všetky duálne modulačné účinky diosmínu na COMobličkyprocesy tvorby kameňa. Je potrebné poznamenať, že rovnováhu týchto podporných a inhibičných účinkov nemožno presne vypočítať (na rozdiel od matematickej rovnice). Okrem toho existuje niekoľko ďalších endogénnych a exogénnych faktorov, ktoré môžu tiež zasahovať do procesov tvorby kameňa. Napokon, diosmín tiež vykazuje niekoľko nepriamych účinkov na tvorbu obličkových kameňov, vrátane jeho antioxidačných a protizápalových vlastností [5,6], ktoré je potrebné vziať do úvahy. Preto je konečným výsledkom týchto dvojitých modulačných účinkovdiosmínna COMobličkytvorba kameňov si vyžaduje ďalšie vyšetrenie in vivo a prospektívnu štúdiu s veľkou kohortou.
5. Závery
V súhrne tu uvádzame duálne účinky diosmínu na moduláciu kryštálov COM spôsobom závislým od dávky. Zatiaľ čo inhibuje rast kryštálov COM, adhéziu kryštál-bunka a internalizáciu do renálnych tubulárnych buniek,diosmínpodporuje kryštalizáciu, agregáciu a inváziu COM cez ECM. Preto je jeho antiurolitiázová úloha pochybná a pri jeho použití pri obličkových kameňoch je potrebné dávať pozor.
vyhlásenie o autorskom príspevku CRediT
Supaporn Khamchun: Konceptualizácia, Metodológia, Softvér, Validácia, Formálna analýza, Vyšetrovanie, Spracovanie údajov, Zápis – originálny návrh, Vizualizácia, Sunisa Yoodee: Konceptualizácia, Metodológia, Softvér, Validácia, Formálna analýza, Vyšetrovanie, Spracovanie údajov, Zápis – originálny návrh, Vizualizácia, Navštívte Thongboonkerd: Konceptualizácia, Metodológia, Softvér, Validácia, Zdroje, Písanie – kontrola a úprava, Dohľad, Správa projektu, Získavanie financií.
Vyhlásenie o konflikte záujmov
Autori nevyhlasujú ŽIADNY konflikt záujmov.
Poďakovanie
Sme vďační za technickú pomoc Kittiya Suwannakud. Táto práca bola podporovaná Úradom národnej rady pre vedu pre výskum a inovácie v oblasti vysokoškolského vzdelávania (NXPO) prostredníctvom PMU-B a Thajského výskumného fondu (IRN60W0004). VT je podporovaná aj grantom „Chalermphrakiat“, Lekárska fakulta nemocnice Siriraj.
Referencie
[1] A. Bogucka-Kocka, M. Wozniak, M. Feldo, J. Kockic, K. Szewczyk,Diosmin– izolačné techniky, stanovenie v rastlinnom materiáli a farmaceutických prípravkoch a klinické použitie, Nat. Prod. komun. 8 (2013) 545–550.
[2] Y. Zheng, R. Zhang, W. Shi, L. Li, H. Liu, Z. Chen, L. Wu, Metabolizmus a farmakologické aktivity prírodnej zdraviu prospešnej zlúčeniny diosmínu, Food Funct. 11 (2020) 8472 – 8492.
[3] MR Cesarone, G. Belcaro, L. Pellegrini, A. Ledda, G. Vinciguerra, A. Ricci, A. Di Renzo, I. Ruffini, G. Gizzi, E. Ippolito, F. Fano, M. Dugall , G. Acerbi, U. Cornelli, M. Hosoi, M. Cacchio, Venoruton vs Daflon: hodnotenie účinkov na kvalitu života pri chronickej venóznej insuficiencii, Angiológia 57 (2006) 131–138.
[4] KA Lyseng-Williamson, CM Perry, Mikronizovaná purifikovaná flavonoidná frakcia: prehľad o jej použití pri chronickej venóznej insuficiencii, žilových vredoch a hemoroidoch, Drugs 63 (2003) 71–100.
[5] AS Shalkami, M. Hassan, AG Bakr, Protizápalová, antioxidačná a antiapoptotická aktivita diosmínu pri ulceróznej kolitíde vyvolanej kyselinou octovou, Hum. Exp. Toxicol. 37 (2018) 78 – 86.
[6] M. Berkoz, Diosmin potláča prozápalové mediátory v makrofágoch RAW264.7 indukovaných lipopolysacharidmi prostredníctvom signálnych dráh NF-kappaB a MAPKs, Gen. Physiol. Biophys. 38 (2019) 315–324.
[7] M. Rajasekar, K. Suresh, K. Sivakumar, Diosmin indukujú apoptózu prostredníctvom modulácie STAT-3 signalizácie v 7,12-dimetylbenz(a)antracénom indukovanej škodlivej karcinogenéze bukálnych vačkov, Biomed. Pharm. 83 (2016) 1064–1070.
[8] A. Lewinska, J. Adamczyk-Grochala, E. Kwasniewicz, A. Deregowska, M. Wnuk, Diosmínom indukovaná senescencia, apoptóza a autofágia v bunkách rakoviny prsníka s rôznym stavom p53 a aktivitou ERK, Toxicol. Lett. 265 (2017) 117–130.
[9] AC Pushkaran, V. Vinod, M. Vanuopadath, SS Nair, SV Nair, AK Vasudevan, R. Biswas, CG Mohan, Kombinácia repurponovaného liečiva diosmín s amoxicilínom a kyselinou klavulanovou spôsobuje synergickú inhibíciu rastu mykobaktérií, Sci. Rep. 9 (2019) 6800.
[10] CC Hsu, MH Lin, JT Cheng, MC Wu, Antihyperglykemický účinok diosmínu, citrusového flavonoidu, je indukovaný prostredníctvom endogénneho beta-endorfínu u diabetických potkanov typu I, Clin. Exp. Pharm. Physiol. 44 (2017) 549–555.
[11] O. Senthamizhselvan, J. Manivannan, T. Silambarasan, B. Raja,Diosminpredliečba zlepšuje srdcovú funkciu a potláča oxidačný stres v srdci potkana po ischémii/reperfúzii, Eur. J. Pharm. 736 (2014) 131–137.
[12] N. Tong, Z. Zhang, Y. Gong, L. Yin, X. Wu, Diosmin chráni sietnicu potkana pred ischemickým/reperfúznym poškodením, J. Ocul. Pharm. Ther. 28 (2012) 459–466.
[13] AE Elhelaly, G. AlBasher, S. Alfarraj, R. Almeer, EI Bahbah, MMA Fouda, SG Bungau, L. Aleya, MM Abdel-Daim, Ochranné účinky hesperidínu a diosmínu proti pečeni, obličkám vyvolaným akrylamidom, a oxidačné poškodenie mozgu u potkanov, Environ. Sci. Pollut. Res. Int. 26 (2019) 35151 – 35162.
[14] C. Thongprayoon, AE Krambeck, pravidlo AD, Stanovenie skutočného bremenaobličkykamenná choroba, Nat. Nephrol. 16 (2020) 736–746.
[15] K. Bishop, T. Momah, J. Ricks, Nefrolitiáza, prim. Starostlivosť 47 (2020) 661–671.
[16] A. Viljoen, R. Chaudhry, J. Bycroft, Renálne kamene, Ann. Clin. Biochem 56 (2019) 15-27.
[17] PM Ferraro, R. Marano, A. Primiano, J. Gervasoni, M. Bargagli, G. Rovere, PF Bassi, G. Gambaro, Zloženie kameňov a vaskulárne kalcifikácie u pacientov s nefrolitiázou, J. Nephrol. 32 (2019) 589–594.
[18] G. Schubert, Analýza kameňov, Urol. Res. 34 (2006) 146-150.
[19] A. Vinaiphat, S. Aluksanasuwan, J. Manissorn, S. Sutthimethakorn, V. Thongboonkerd, Reakcia renálnych tubulárnych buniek na rozdielne typy a dávky kryštálov oxalátu vápenatého: integratívna analýza proteómovej siete a funkčné výskumy, Proteomics 17 (2017 ), 1700192.
[20] P. Peerapen, S. Chaiyarit, V. Thongboonkerd, Analýza proteínovej siete a funkčné štúdie cytotoxicity vyvolanej kryštálmi oxalátu vápenatého v renálnych tubulárnych epiteliálnych bunkách, Proteomics 18 (2018), 1800008.
[21] KP Aggarwal, S. Narula, M. Kakkar, C. Tandon, Nefrolitiáza: molekulárny mechanizmus tvorby obličkových kameňov a kritická úloha modulátorov, Biomed. Res. Int. 2013 (2013), 292953.
[22] VN Ratkalkar, JG Kleinman, Mechanizmy tvorby kameňa, Clin. Rev. Bone Miner. Metab. 9 (2011) 187–197.
[23] X. Zeng, Y. Xi, W. Jiang, Ochranné úlohy flavonoidov a rastlinných extraktov bohatých na flavonoidy proti urolitiáze: prehľad, Crit. Food Sci. Nutr. 59 (2019) 2125–2135.
[24] MC Nirumand, M. Hajialyani, R. Rahimi, MH Farzaei, S. Zingue, SM Nabavi, A. Bishayee, Dietetické rastliny na prevenciu a manažmentobličkykamene: predklinické a klinické dôkazy a molekulárne mechanizmy, Int. J. Mol. Sci. 19 (2018) 765.
[25] S. Ahmed, MM Hasan, H. Khan, ZA Mahmood, S. Patel, Mechanistický pohľad na polyfenoly pri zmierňovaní urolitiázy s oxalátom vápenatým, Biomed. Pharm. 106 (2018) 1292–1299.
[26] VV Prabhu, D. Sathyamurthy, A. Ramasamy, S. Das, M. Anuradha, S. Pachiappan, Hodnotenie ochranných účinkov diosmínu (citrusový flavonoid) pri chemicky indukovanej urolitiáze u experimentálnych potkanov, Pharm. Biol. 54 (2016) 1513–1521.
[27] A. Noorafshan, S. Karbalay-Doust, F. Karimi,Diosminznižuje ukladanie oxalátu vápenatého a degeneráciu tkaniva pri nefrolitiáze u potkanov: stereologická štúdia, kórejský J. Urol. 54 (2013) 252–257.
[28] V. Thongboonkerd, T. Semangoen, S. Chutipongtanate, Faktory určujúce typy a morfológie kryštálov šťavelanu vápenatého: molárne koncentrácie, pufrovanie, pH, miešanie a teplota, Clin. Chim. Acta 367 (2006) 120-131.
[29] V. Thongboonkerd, T. Semangoen, S. Sinchaikul, ST Chen, Proteomická analýza kryštálmi indukovanej cytotoxicity monohydrátu oxalátu vápenatého v distálnych tubulárnych bunkách obličiek, J. Proteome Res. 7 (2008) 4689-4700.
[30] P. Amimanan, R. Tavichakorntrakool, K. Fong-ngern, P. Sribenjalux, A. Lulitanond, V. Prasongwatana, C. Wongkham, P. Boonsiri, WJ Umka, V. Thongboonkerd, Elongačný faktor Tu na Escherichia coli izolovaný z moču pacientov s obličkovými kameňmi podporuje rast a agregáciu kryštálov šťavelanu vápenatého, Sci. Rep. 7 (2017) 2953.
[31] S. Khamchun, K. Sueksakit, S. Chaiyarit, V. Thongboonkerd, Modulačné účinky fibronektínu na kryštalizáciu oxalátu vápenatého, rast, agregáciu, adhéziu na renálne tubulárne bunky a inváziu cez extracelulárnu matricu, J. Biol. Inorg. Chem. 24 (2019) 235–246.
[32] S. Chaiyarit, V. Thongboonkerd, Definovanie a systematické analýzy indexov agregácie na vyhodnotenie stupňa agregácie kryštálov šťavelanu vápenatého, Front. Chem. 5 (2017) 113.
[33] R. Kanlaya, O. Naruepantawart, V. Thongboonkerd, Flagellum je zodpovedný za podporu účinkov životaschopných Escherichia coli na kryštalizáciu šťavelanu vápenatého, rast kryštálov a agregáciu kryštálov, Front. Microbiol 10 (2019) 2507.
[34] P. Peerapen, V. Thongboonkerd, Diferenciálne viazané proteíny a adhezívne schopnosti kryštálov monohydrátu oxalátu vápenatého s rôznymi veľkosťami, Int. J. Biol. Macromol. 163 (2020) 2210 – 2223.
[35] K. Fong-ngern, K. Sueksakit, V. Thongboonkerd, Surface heat shock protein 90 slúži ako potenciálny receptor pre kryštál šťavelanu vápenatého na apikálnej membráne renálnych tubulárnych epitelových buniek, J. Biol. Inorg. Chem. 21 (2016) 463–474.
[36] S. Chaiyarit, S. Mungdee, V. Thongboonkerd, Nerádioaktívne značenie kryštálov šťavelanu vápenatého na výskum interakcie a internalizácie kryštál-bunka, Anal. Methods 2 (2010) 1536–1541.
[37] S. Chaiyarit, N. Singhto, V. Thongboonkerd, kryštály monohydrátu šťavelanu vápenatého internalizované do renálnych tubulárnych buniek sú degradované a rozpustené endolyzozómami, Chem. Biol. Interagujte. 246 (2016) 30–35.
[38] W. Chiangjong, V. Thongboonkerd, Nový test na vyhodnotenie podporných účinkov proteínov na inváziu kryštálov oxalátu vápenatého cez extracelulárnu matricu na základe aktivity plazminogénu/plazmínu, Talanta 101 (2012) 240–245.
[39] W. Chiangjong, V. Thongboonkerd, Kryštály oxalátu vápenatého zvýšili sekréciu enolázy-1 z renálnych tubulárnych buniek, čo následne zvýšilo inváziu kryštálov a monocytov cez renálne interstícia, Sci. Rep. 6 (2016) 24064.
[40] R. Kanlaya, K. Sintiprungrat, S. Chaiyarit, V. Thongboonkerd, Makropinocytóza je hlavným mechanizmom endocytózy kryštálov šťavelanu vápenatého do renálnych tubulárnych buniek, Cell Biochem. Biophys. 67 (2013) 1171–1179.
[41] S. Sassanarakkit, P. Peerapen, V. Thongboonkerd, StoneMod: databáza preobličkykameň modulačné proteíny s experimentálnym dôkazom, Sci. Rep. 10 (2020) 15109.
[42] G. Eraslan, ZS Sarica, LC Bayram, MY Tekeli, M. Kanbur, M. Karabacak, Účinky diosmínu na poškodenie pečene a obličiek vyvolané aflatoxínmi, Životné prostredie. Sci. Pollut. Res. Int. 24 (2017) 27931 – 27941.
[43] R. Russo, D. Chandradhara, N. De Tommasi, Porovnávacia biologická dostupnosť dvochdiosmínformulácie po perorálnom podaní zdravým dobrovoľníkom, Molecules 23 (2018) 2174.
[44] JQ Silveira, TB Cesar, JA Manthey, EA Baldwin, J. Bai, S. Raithore, Farmakokinetika flavanónových glykozidov po požití jednotlivých dávok čerstvo vylisovanej pomarančovej šťavy oproti komerčne spracovanej pomarančovej šťave u zdravých ľudí, J. Agric . Food Chem. 62 (2014) 12576–12584.
[45] A. Frackowiak, P. Skibinski, W. Gawel, E. Zaczynska, A. Czarny, R. Gancarz, Syntéza glykozidových derivátov hydroxyantrachinónu so schopnosťou rozpúšťať a inhibovať tvorbu kryštálov šťavelanu vápenatého. Potenciálne zlúčeniny v terapii obličkových kameňov, Eur. J. Med. Chem. 45 (2010) 1001-1007.
[46] F. Grases, J. Perello, B. Isern, RM Prieto, Štúdia krému na báze myo-inozitolhexafosfátu na prevenciu dystrofickej kalcinózy cutis, Br. J. Dermatol. 152 (2005) 1022-1025.
[47] V. Thongboonkerd, Proteomika interakcií kryštál-bunka: model pre výskum obličkových kameňov, Cells 8 (2019) 1076.
[48] CF Verkoelen, Retencia kryštálov pri ochorení obličkových kameňov: kľúčová úloha pre glykozaminoglykán hyaluronan? J. Am. Soc. Nephrol. 17 (2006) 1673–1687.
[49] K. Fong-ngern, A. Vinaiphat, V. Thongboonkerd, Mikrovilárne poškodenie v renálnych tubulárnych epiteliálnych bunkách vyvolané kryštálom oxalátu vápenatého a ochranná úloha epigalokatechín-3-galátu, FASEB J. 31 (2017) 120 –131.
[50] J. Zhou, J. Jin, X. Li, Z. Zhao, L. Zhang, Q. Wang, J. Li, Q. Zhang, S. Xiang, Total flavonoids of Desmodium styracifolium zoslabuje tvorbu hydroxy- L-prolínom indukovaná kalciumoxalátová urolitiáza u potkanov, Urolitiáza 46 (2018) 231–241.
[51] J. Manissorn, K. Fong-ngern, P. Peerapen, V. Thongboonkerd, Systematické hodnotenie účinkov pH moču na kryštalizáciu šťavelanu vápenatého, adhéziu kryštál-bunka a internalizáciu do renálnych tubulárnych buniek, Sci. Rep. 7 (2017) 1798.
[52] S. Cui, J. Qian, P. Bo, Inhibičný účinok na fagocytózu Candida albicans vyvolanú predbežným ošetrením kvercetínom prostredníctvom interferencie aktínového cytoskeletu, J. Tradit. Brada. Med. 33 (2013) 804-809.
[53] S. Cui, Q. Wu, J. Wang, M. Li, J. Qian, S. Li, Quercetin inhibuje LPS-indukovanú migráciu makrofágov potlačením iNOS/FAK/paxilínovej dráhy a moduláciou cytoskeletu, bunkových adhéz . Migr. 13 (2019) 1–12.
[54] Y. Li, WG Gonzalez, A. Andreev, W. Tang, S. Gandhi, A. Cunha, D. Prober, C. Lois, ME Bronner, Recyklácia membrán sprostredkovaná makropinocytózou poháňa migráciu neurálnej lišty dodávaním F- aktín do lamellipódia, Proc. Natl. Akad. Sci. USA 117 (2020) 27400 – 27411.
[55] H. Inaba, K. Yoda, H. Adachi, F-aktín viažuci RapGEF GflB je potrebný pre účinnú makropinocytózu v Dictyostelium, J. Cell Sci. 130 (2017) 3158–3172.
[56] A. Khan, Prevalencia, patofyziologické mechanizmy a faktory ovplyvňujúce urolitiázu, Int. Urol. Nephrol. 50 (2018) 799-806.
[57] AP Evan, EM Worcester, FL Coe, J. Williams Jr., JE Lingeman, Mechanizmy tvorby ľudských obličkových kameňov, Urolitiáza 43 (Suppl 1) (2015) 19-32.
[58] S. Chaiyarit, V. Thongboonkerd, Mitochondriálna dysfunkcia aobličkykamenná choroba, Front. Physiol. 11 (2020), 566506.
[59] SR Khan, Histologické aspekty modelu tvorby kameňov s pevnými časticami: štúdie na zvieratách, Urolitiáza 45 (2017) 75–87.
[60] VY Bird, SR Khan, Ako vznikajú kamene? Je možné zjednotenie teórií o tvorbe kameňa? Arch. Esp. Urol. 70 (2017) 12.–27.
[61] JP Kavanagh, Metódy pre štúdium kryštalizácie šťavelanu vápenatého a ich aplikácia na výskum urolitiázy, Scanning Microsc. 6 (1992) 685-704, diskusia 704-5.
[62] JP Kavanagh, L. Jones, PN Rao, Kinetika kryštalizácie šťavelanu vápenatého pri rôznych koncentráciách ľudského a umelého moču, s konštantným pomerom vápnika k oxalátu, Urol. Res. 27 (1999) 231-237.
[63] NK Saw, PN Rao, JP Kavanagh, A. nidus, kryštalúria a agregácia: kľúčové zložky pre zväčšenie kameňov, Urol. Res. 36 (2008) 11-15.
[64] A. Borissova, GE Goltz, JP Kavanagh, TA Wilkins, Reverzné inžinierstvo obličiek: modelovanie kryštalizácie monohydrátu šťavelanu vápenatého v nefrone, Med. Biol. Ing. Výpočet. 48 (2010) 649-659.
[65] LA Thurgood, ES Sorensen, RL Ryall, Účinok intrakryštalického a povrchovo viazaného osteopontínu na pripojenie kryštálov dihydrátu šťavelanu vápenatého k bunkám psích obličiek Madin-Darby (MDCK) v ultrafiltrovanom ľudskom moči, BJU Int. 109 (2012) 1100–1109.
