Echinakozid zvráti prestavbu myokardu a zlepšuje funkciu srdca

Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Yajuan Ni1|Jie Deng1|Xin Liu1|Qing Li1|Juanli Zhang1|Hongyuan Bai1|Jingwen Zhang2

Abstraktné

Remodelácia myokardu je dôležitým patologickým základom SZ, mitochondriálny oxidačný stres je promótorom hypertrofie myokardu, fibrózy a apoptózy. ECH je hlavnou aktívnou zložkou tradičnej čínskej medicíny Cistanches Herba, množstvo štúdií naznačuje, že má silnú antioxidačnú kapacitu v nervových bunkách a nádoroch, inhibuje mitochondriálny oxidačný stres, chráni mitochondriálne funkcie, ale konkrétny mechanizmus nie je jasný. SIRT1/FOXO3a/MnSOD je dôležitá antioxidačná os, štúdia zistila, že ECH sa kovalentne viaže na SIRT1 ako ligand a upreguluje expresiu SIRT1 v mozgových bunkách. Predpokladáme, že ECH môže zvrátiť remodeláciu myokardu a zlepšiť srdcovú funkciu SZ prostredníctvom regulácie signalizačnej osi SIRT1/FOXO3a/MnSOD a inhibície mitochondriálneho oxidačného stresu v kardiomyocytoch. Tu najprv indukujeme bunkový model oxidačného stresu pomocou ISO s AC-16 bunkami a predbežne ošetríme ECH, úroveň mitochondriálneho ROS, oxidačné poškodenie mtDNA, MMP, karbonylovaný proteín, peroxidáciu lipidov, intracelulárne ROS a apoptózy, potvrdzujú účinok ECH pri mitochondriálnom oxidačnom strese a fungujú in vitro. Potom sme vytvorili model potkanov HF indukovaný pomocou ISO a predbežne ošetrili ECH. Meria sa indexy funkcie srdca, remodelácie myokardu, mitochondriálneho oxidačného stresu a funkcie, expresia signalizačnej osi SIRT1/FOXO3a/MnSOD, údaje naznačujú, že ECH zlepšuje funkciu srdca, inhibuje hypertrofiu myokardu, fibrózu a apoptózu zvyšuje expresiu SIRT1/FOXO3a/ Signálna os MnSOD, znižuje mitochondriálne oxidačné poškodenia, chráni mitochondriálne funkcie. Dospeli sme k záveru, že ECH obracia remodeláciu myokardu a zlepšuje srdcovú funkciu prostredníctvom up-regulácie osi SIRT1 / FOXO3a / MnSOD a inhibície mitochondriálneho oxidačného stresu u potkanov HF.

KĽÚČOVÉ SLOVÁ echinakozid, srdcové zlyhanie, mitochondriálny oxidačný stres, remodelácia myokardu

čerstvé bylinky cistanchedomitochondriálny oxidačný stres

1|ÚVOD

Zlyhanie srdca (SZ) je konečným výsledkom väčšiny kardiovaskulárnych ochorení s vysokou prevalenciou a zlou prognózou a so zhoršujúcim sa trendom starnutia populácie, hospitalizácie a úmrtnosti v dôsledku chronického srdcového zlyhania (CHF) prudko vzrástli na celom svete.1 Za posledných 20 rokov zaznamenala medikamentózna liečba SZ veľký pokrok, ale účinok je veľmi obmedzený, takže sú naliehavo potrebné nové lieky. Remodelácia myokardu je dôležitým patologickým základom SZ a je charakterizovaná hypertrofiou myokardu, apoptózou, intersticiálnou fibrózou, bunky myokardu sú dezorganizované a vedú k zníženiu ejekčnej frakcie (LVEF), zväčšeniu koncových diastolických a systolických rozmerov ľavej komory (LVIDd a LVID) a zníženie frakčného skrátenia ľavej komory (LVFS).2 Ale základné mechanizmy stále neboli úplne pochopené. V posledných rokoch mnohé štúdie potvrdili, že oxidačný stres je dôležitým stimulátorom prestavby myokardu.3-7

Oxidačný stres je stav, pri ktorom sa nadmerne vytvárajú reaktívne formy kyslíka (ROS) alebo voľné radikály, čo vedie k oxidačnému poškodeniu bunkových komponentov, čo následne spôsobuje dysfunkciu buniek.8 Mitochondrie sú hlavným zdrojom intracelulárnych ROS v dôsledku únik z respiračného elektrónového transportného reťazca a mitochondrie sú najcitlivejšou pozíciou na účinky ROS.9 Štúdie v HF identifikovali zvýšenú tvorbu ROS z komplexu I dýchacieho reťazca.8 Zvýšená produkcia ROS napáda najskôr mitochondriálne komponenty a vedie k nadmernému oxidačnému stresu sa prejavuje karbonyláciou proteínov, peroxidáciou lipidov a poškodením DNA10a dysfunkcia mitochondrií, ktorá následne vedie k nadmernej tvorbe ROS,8 vytvára začarovaný kruh. Ukázalo sa, že trvalý oxidačný stres môže spôsobiť hypertrofiu myokardu a fibrózu myokardu11-13 a spôsobiť apoptózu buniek myokardu prostredníctvom aktivácie apoptózy závislej od mitochondrií v dôsledku karbonylácie proteínov mitochondriálnej membrány a straty potenciálu mitochondriálnej membrány. Uvažuje sa, že inhibícia mitochondriálneho oxidačného stresu môže byť novou stratégiou na prevenciu remodelácie myokardu a dokonca aj SZ.15-17

Echinakozid (ECH), prírodný fenyletanoidový glykozid, je hlavnou aktívnou zložkou Cistanches Herba, čo je tradičná čínska medicína. V posledných rokoch bola ECH extenzívne študovaná v nervovom systéme a nádoroch a uvádza sa, že má rôzne farmakologické účinky, ako sú antioxidačné, protizápalové, antiapoptózové a protinádorové vlastnosti.18,19In nervových buniek, ECH výrazne zvyšuje antioxidačnú kapacitu, znižuje produkciu ROS, zlepšuje potenciál mitochondriálnej membrány (MMP) a zvyšuje životaschopnosť buniek,20 vykazuje ochranné účinky na mitochondriálnu funkciu a inhibuje mitochondriálny oxidačný stres, chráni pred oxidačným poškodením a zlepšuje pamäť, prípadne zabraňuje neurodegenerácia.21,22 ECH tiež zvyšuje aktivitu SOD a hrá ochrannú úlohu v mozgovom tkanive a tkanive sietnice,19,23 ale špecifický mechanizmus jej antioxidačného účinku je nejasný.

SIRT1 úzko súvisí s oxidačným stresom a signalizačná os SIRT1/FOXO3a/MnSOD je najdôležitejšou antioxidačnou osou a je zodpovedná za potlačenie mitochondriálneho oxidačného stresu, MnSOD sa široko distribuuje v mitochondriách a je primárne zodpovedný za odstraňovanie mitochondriálnych ROS, teda zlúčeniny, ktoré aktivujú túto antioxidačnú os, môžu inhibovať oxidačný stres.24,25 Nedávne štúdie ukázali, že ECH uplatňuje svoje farmakologické účinky prostredníctvom regulácie viacerých signálnych dráh, ako sú p-AKT, mTOR/STAT3, TGF-beta 1/Smads a signálna dráha SIRT1.{10}} nová štúdia zistila, že ECH sa kovalentne viaže na SIRT1 ako ligand a upreguluje expresiu SIRT1 v mozgových bunkách.26Naznačuje to, že ECH môže inhibovať mitochondriálny oxidačný stres v kardiomyocytoch a zvrátiť činnosť myokardu prestavba. Výskum účinkov ECH sa však zameral na nervový systém alebo nádor, účinky a mechanizmy ECH na mitochondriálny oxidačný stres v kardiomyocytoch a remodeláciu myokardu zostávajú neznáme. Tu najprv indukujeme bunkový model oxidačného stresu pomocou ISO a potvrdzujeme účinok ECH na mitochondriálny oxidačný stres a funkciu in vitro. Potom vytvoríme model potkanov HF indukovaný ISO a demonštrujeme, že ECH obracia remodeláciu myokardu a zlepšuje srdcovú funkciu prostredníctvom upregulácie signalizačnej osi SIRT1 / FOXO3a / MnSOD a inhibície mitochondriálneho oxidačného stresu u potkanov HF. Výsledky majú poskytnúť experimentálny dôkaz pre vývoj nových liekov na prevenciu srdcového zlyhania.

2|MATERIÁLY A METÓDY

2,1|Bunková kultúra a liečba

Bunky AC16 sú zakúpené od Bena Culture Collection. Bunky sú udržiavané v doplnku s vysokým obsahom glukózy Dulbeccovo modifikované Eaglovo médium (DMEM; Hyclone, GE Healthcare, USA) s 10 percentami fetálneho bovinného séra (10 percent FBS; Gibco) v T-75 bankách (Corning Glassworks, Corning, NY, USA). Podmienky sa udržiavajú na 37 stupňoch vo vlhkej atmosfére obsahujúcej 5 percent CO2. Keď bunky dosiahnu 70 percent -80 percent konfluencie, bunky skupiny ISO (Sigma, USA) sa inkubujú s médiom obsahujúcim 10 uM ISO (Sigma, USA) počas 24 hodín, bunky skupiny ECH sa vopred ošetria 50 uM ECH (MCE , USA) 30 minút pred expozíciou ISO. Kontrolné bunky (Ctrl) nie sú ošetrené ničím.

cistanche na predajextrakt

2,2|Detekcia mitochondriálnej hladiny ROS pomocou luminolovej chemiluminiscencie

Mitochondrie sa izolujú a purifikujú z buniek AC-16 pomocou súpravy Mitochondria Isolation Kit (Sigma, USA) podľa pokynov výrobcu. Koncentrácie proteínov sa stanovujú pomocou súpravy na testovanie proteínov BCA (Biotech). Mitochondriálna hladina ROS sa deteguje luminálom (3-hydrazid aminoftalovej kyseliny 5-amino-2,3-dihydro-1,4-ftalazíndión) pomocou súpravy Elisa (GERMED SCIENTIFIC INC, USA), reaguje s ROS a spôsobuje emisiu fotónov, čo je pásové spektrum s vrcholom pri približne 460 nm, a jednotka relatívneho svetla (RLU) je detegovaná chemiluminiscenčným meracím prístrojom a konvertovaná na RLU/ug mitochondriálny proteín.

2,3|8-OHdG sa používa na vyhodnotenie oxidačného poškodenia mitochondriálnej DNA

Oxidačné poškodenie mitochondriálnej DNA sa hodnotí detekciou obsahu 8-Hydroxy-2-deoxyguanozínu (8-OHG). Vyčistené mitochondrie v bunkách sa izolujú pomocou súpravy na izoláciu mitochondrií, ako je uvedené vyššie (Sigma). Koncentrácie proteínov sa stanovujú pomocou súpravy na testovanie proteínov BCA (Biotech). Potom sa disociujú, aby sa určila hladina 8-OHdG pomocou súpravy Elisa (GERMED SCIENTIFIC INC, USA) podľa pokynov výrobcu. Absorbancia zmeny farby sa meria na spektrofotometri pri vlnovej dĺžke 450 nm. Koncentrácia 8-OHdG vo vzorkách sa potom stanoví porovnaním OD vzoriek so štandardnou krivkou a prevedie sa na ng/ml.

2,4|Meranie MMP spoločnosťou JC-1

Mitochondrie sa izolujú a vyčistia od AC-16 a koncentrácia proteínu sa určí tak, ako je uvedené vyššie. Potom sa mitochondrie resuspendujú pri koncentrácii 1 mg/ml, MMP sa meria pomocou JC-1 testovacej súpravy podľa pokynov výrobcu. Intenzita fluorescencie sa meria pri excitačnej vlnovej dĺžke: 490 nm, štrbine 5 nm, emisnej vlnovej dĺžke: 590 nm, štrbine 5 nm pomocou spektrofotometrického prístroja30, výsledky sú vyjadrené ako FLU/ugP.

2,5|Detekcia apoptotických buniek prietokovou cytometriou v AC-16 bunkách

Prietoková cytometria sa používa na hodnotenie bunkovej apoptózy. Súprava na detekciu apoptózy Annexin V-FITC/PI (CWBIO, Čína) sa používa na detekciu apoptotických a nekrotických buniek podľa pokynov dodávateľa. Skoré štádium apoptózy, neskoré štádium apoptózy alebo nekrózy, bunkové zvyšky a životaschopné bunky sú identifikované ako anexín V (plus)/PI (-), anexín V (plus)/PI (plus), anexín V (-)/PI ( plus ) a anexín V (-)/PI (-). Intenzity fluorescencie sa analyzujú pomocou prietokového cytometra (BD FACSVerse™ Flow Cytometer, BD Biosciences, San Jose, CA, USA). Každý experiment sa opakuje 3-krát.

2,6|Stanovené intracelulárne ROS prietokovým cytometrom

Po ošetrení sa bunky trypsinizujú, premyjú sa dvakrát PBS. Bunky sa potom resuspendujú v PBS, farbia sa s DCFH-DA (Beyotime, Čína) v konečnej koncentrácii 1 uM a inkubujú sa 1 hodinu pri 37 stupňoch v inkubátore s CO2 a potom sa testujú v prietokovom cytometri pri excitácii 488 nm. . Intenzita fluorescencie predstavuje úroveň intracelulárneho ROS.

2,7|Otestujte obsah karbonylového proteínu v mitochondriách AC-16 buniek

Po ošetrení sa purifikované mitochondrie izolujú a sonikujú na ľade a spracujú sa s 1 percentom streptomycín sulfátu, aby sa vyzrážali mitochondriálne nukleové kyseliny, stanoví sa koncentrácia proteínu. Obsah karbonylového proteínu sa testuje pomocou súpravy Elisa (GERMED SCIENTIFIC INC, USA) založenej na derivatizácii karbonylovej skupiny dinitrofenylhydrazínom (DNPH), podľa pokynov súpravy sa OD meria čítačkou mikrodoštičiek a prevádza sa na nmol/ mg proteínu porovnaním so štandardnou krivkou.

2,8|Stanovenie hladiny peroxidácie lipidov v mitochondriách AC-16 buniek

Po ošetrení sa bunky zbierajú a lýzujú, mitochondrie sa izolujú a purifikujú a popraskajú ultrazvukom, koncentrácia proteínu sa stanoví pomocou súpravy na testovanie proteínov BCA (Biotech), peroxidácia lipidov sa stanoví na základe hladiny malondialdehydu (MDA) prostredníctvom testu TBARS pomocou súpravy (Nan jing Jian cheng, Čína) a hladina MDA sa meria podľa protokolu výrobcu. OD sa deteguje pri 586 nm čítačkou mikrodoštičiek a prevedie sa na μmol/g proteínu porovnaním so štandardnou krivkou.

2,9|Zvieratá a liečba

Mladé samce potkanov Sprague-Dawley s hmotnosťou 120-140 g sa získali z centra laboratórnych zvierat univerzity Xi'an Jiao tong (Shaanxi, Čína). Vyšetrovanie je v súlade s Príručkou pre starostlivosť a používanie laboratórnych zvierat, ktorú vydal Národný inštitút zdravia USA (publikácia NIH č.{2}}, revidovaná v roku 1996) a experimentálne protokoly boli schválené miestnymi úradmi ( Biomedicínsky etický výbor lekárskeho oddelenia univerzity Xi 'a Jiao tong). Model HF na potkanoch je stanovený tak, ako sme už opísali.31 Stručne, izoproterenol (10 mg/kg) sa podáva raz denne intraperitoneálnou injekciou počas 2 týždňov (definovaná ako skupina HF), ECH sa podáva s 20 ug/g raz denne intraperitoneálnou injekciou 30 minút pred ošetrením ISO (definovaná ako skupina ECH) a podávanie trvá 2 týždne. Kontrolným zvieratám sa podával 0,9 % NaCl (definovaný ako Ctrl skupina). Na vyhodnotenie funkcie srdca sa vykonávajú echokardiografické merania.

2,10|Echokardiografické merania

Zvieratá sa anestetizujú intraperitoneálnou injekciou 300 mg/kg chloralhydrátu. Ultrazvukový systém SONOS-2500 s ultrazvukovým prevodníkom 7,5 MHz (HP, USA) sa používa na echokardiografické vyšetrenia. ejekčná frakcia ľavej komory (LVEF), frakčné skrátenie ľavej komory (LVFS), koncové diastolické rozmery ľavej komory (LVIDd), koncové systolické rozmery ľavej komory (LVID), srdcová frekvencia (HR), hrúbka medzikomorového septa v diastole (IVSTd ), hrúbka zadnej steny ľavej komory v diastole (LVPWTd) sa meria tak, ako sme už opísali.32

OBRÁZOK 1 50μmol ECH účinne inhibuje mitochondriálny oxidačný stres AC-16 buniek vyvolaný 10 μmol/l ISO a chráni mitochondriálnu funkciu a znižuje apoptózu.

2.11|Meria sa pomer hmotnosti srdca k telesnej hmotnosti (HW/BW).

Potkana sa pred anestéziou odváži, izoluje sa čerstvé srdce a vymyje sa krv s 0,1 mol/l PBS, odrežú sa cievy a iné nadbytočné tkanivo a srdce sa odváži, potom sa HW/BW(mg/100g) vypočítané.

2,12|Histologické farbenie

Srdcia krýs sa vypreparujú a fixujú v 4 percentnom paraformaldehyde, zapustia sa do parafínu a narežú sa na plátky s hrúbkou 5 μm. Farbenie hematoxylín-eozín (HE) sa používa na pozorovanie patologických zmien a Massonov trichróm sa používa na hodnotenie kolagénových vlákien tkaniva myokardu potkanov. Objemová frakcia srdcového kolagénu (CVF) a plocha prierezu kardiomyocytov sa meria pomocou Image-Pro Plus 6.0 (Media Cybernetics, Bethesda, MD, USA).

2,13|Farbenie TUNEL

Tkanivo myokardu z ľavej komory sa odoberie a test TUNEL sa uskutoční tak, ako sme už opísali32

2,14|Transmisný elektrónový mikroskop

Čerstvé srdcové tkanivo sa fixuje v 2,5 percentnom glutaraldehyde pri 4 stupňoch, tkanivo sa potom nareže na objem 1 mm3 a znova sa fixuje v 2,5 percentnom glutaraldehyde pri 4 stupňoch počas 2 hodín, potom sa premyje 0,1 mol/l PBS, fixované v 1% kyseline osmiovej, dehydratovanej acetónom, zaliatej epoxidovou živicou, sa vyrobia ultratenké plátky s hrúbkou asi 800nm, zafarbia sa octanom uranylom a citrátom olovnatým a potom sa pozorujú pod transmisným elektrónovým mikroskopom (H{ {13}}, Hitachi Limited, Japonsko). Na kvantifikáciu ochranného účinku ECH v mitochondriálnej morfológii sa štatisticky analyzuje priemerný obvod mitochondrií, stredná plocha prierezu mitochondrií, percento degenerácie a percento vakuolizácie v mitochondriách pomocou Image-Pro Plus 6.0 (Media Cybernetics, USA).

2,15|Kvantitatívna PCR

Celková RNA sa pripraví z tkaniva ľavej komory pomocou činidla Trizol (Invitrogen, Carlsbad, USA). cDNA sa syntetizuje pomocou súpravy TUREscript 1st Strand cDNA Synthesis Kit (Takara, Japonsko). Špecifické sekvencie primérov kolagénu I použité na PCR v reálnom čase sú nasledovné: vpred: 5'-GTCGTATCCAGTGCGTGTC-3′, reverzné: 5′-GTGGAGTCGGCAATTGCA-3′. GAPDH vpred 5'-GGC AAG GTC ATC CCA GAG CT-3', spätný 5'-CGC CTG CTT CAC CAC CTT CT-3'. Kvantitatívna PCR v reálnom čase (qPCR) sa vykonáva pomocou SYBRPremix Ex Taq (Perfect Real Time) (Takara, Japonsko). Relatívna hladina mRNA sa vypočíta normalizáciou na GAPDH podľa metódy 2-ΔΔCT.

2,16|Western blot analýza expresie proteínu SIRT1, FOXO3a, MnSOD

Celkový proteín tkaniva ľavej komory sa extrahuje na ľade s použitím studeného pufra RIPA (BioRad, USA) s kokteilom inhibítora proteázy (Sigma-Aldrich). Koncentrácia sa stanoví metódou BCA. Postupy Western blotu sú opísané vyššie.33 Stručne, vzorka proteínu sa frakcionuje na 15% dodecylsulfát-polyakrylamidových géloch, prenesie sa na PVDF membrány (BioRad, USA), blokuje sa 5% odstredeným mliekom a inkubuje sa s myšou protilátkou MYH. (riedené 1:200, Santa Cruz, USA). Potom sa inkubuje s kozou myšacou protilátkou konjugovanou s chrenovou peroxidázou (zriedená 1:2,000, Santa Cruz, USA). Relatívna hladina proteínu sa vypočíta normalizáciou strednej hodnoty lúča na -aktín. Proteínové pásy sa detegujú chemiluminiscenčným systémom (ChemiDoc XRS, BioRad).

2,17|Meranie mitochondriálneho oxidačného stresu v myokarde potkanov

Vyčistené mitochondrie potkanieho myokardu sa izolujú pomocou Mitochondria Isolation Kit (Sigma, USA) podľa pokynov výrobcu, mitochondriálne ROS, MMP, oxidačné poškodenie mtDNA, obsah karbonylovaných proteínov a hladina peroxidácie lipidov v mitochondriách sa zisťujú rovnakými metódami ako bunkové experimenty opísané vyššie. Je potrebné poznamenať, že ROS v tkanive myokardu sa deteguje fluorescenčnými sondami DCFH-DA, intenzita fluorescencie sa deteguje pomocou nástroja na meranie enzýmového značenia, výsledky sú reprezentované ako RLU/ug mitochondriálneho proteínu.

2,18|Štatistická analýza

Všetky údaje sú uvedené ako priemer ± SEM. Na porovnanie rozdielov medzi viacerými skupinami sa používa jednosmerná ANOVA, po ktorej nasleduje Tukeyho post hoc test na významnosť. Všetky štatistiky sú určené pomocou softvéru SPSS15.0 (SPSS Inc, IL, USA). Hodnota pravdepodobnosti P < 0,05="" sa="" považuje="" za="">

3|VÝSLEDKY

3.1|50 μM ECH účinne inhibuje mitochondriálne oxidačné poškodenie a apoptózu v AC-16 bunkách

Neošetrené bunky sú nastavené ako skupina Ctrl. Po prvé, ako ukazuje obrázok 1A, ECH inhibuje mitochondriálne ROS indukované ISO. Bunky ošetrené ISO vykazujú významné zvýšenie mitochondriálnych ROS v porovnaní s Ctrl a toto zvýšenie je významne oslabené predbežným ošetrením 50 μM ECH. Po druhé, ECH môže inhibovať oxidačné poškodenie mtDNA indukované ISO. 8-OHdG sa považuje za jednu z najčastejších lézií DNA vyplývajúcich z oxidačného stresu a je biomarkerom oxidačného poškodenia a opravy DNA. Ako ukazuje obrázok 1B, deteguje sa obsah 8-OHdG v purifikovaných mitochondriách z AC-16 buniek, výsledky ukazujú, že hladina 8-OHdG v mitochondriách z buniek ošetrených ISO sa dramaticky zvýšila, ale zmena bola zvrátená 50 μM ECH. Po tretie, ECH je účinný pri ochrane MMP, ktorý je narušený ISO. Intenzita fluorescencie je významne znížená v bunkách ošetrených ISO v porovnaní s bunkami Ctrl, zatiaľ čo predbežné ošetrenie 50 uM ECH pozoruhodne zmierňuje zníženie MMP, ako ukazuje obrázok 1C. Po štvrté, ECH chráni pred oxidačným poškodením mitochondriálneho proteínu v AC-16 bunkách. Ako ukazuje obrázok 1D, obsah karbonylového proteínu v mitochondriách ISO liečebných buniek je výrazne zvýšený a ECH zoslabuje účinok. Po piate, ECH tiež inhibuje mitochondriálnu lipidovú peroxidáciu v AC-16 bunkách indukovanú ISO. Ako ukazuje obrázok 1E, hladina lipidových peroxidov v mitochondriách ISO buniek je zjavne vyššia ako hladina v Ctrl bunkách, pričom toto zvýšenie je výrazne znížené predúpravou 50 uM ECH. V konečnom dôsledku ECH inhibuje akumuláciu intracelulárnych ROS. Ako ukazuje obrázok 1F, hladina intracelulárnych ROS v ISO bunkách je výrazne zvýšená a výrazne znížená v bunkách vopred ošetrených ECH. Obrázok 1G ukazuje, že rýchlosť apoptózy AC-16 buniek je významne zvýšená po 24-hodinových inkubáciách s 10 uM ISO v porovnaní s bunkami Ctrl, zatiaľ čo bunky pred ošetrením s 50 uM ECH významne znižujú apoptózu indukovanú ISO.

OBRÁZOK 2 Srdcová hypertrofia potkanov HF indukovaná pomocou ISO sa zmierni a srdcová funkcia sa výrazne zlepší liečbou ECH.

3,2|ECH obracia remodeláciu myokardu a zlepšuje srdcovú funkciu ISO-indukovaných HF potkanov

Ako je znázornené na obrázku 2A, srdcia u potkanov HF majú zjavnú hypertrofiu a sú zvrátené liečbou ECH. Ako ukazujú obrázky 2B-D a L, ECH znižuje HW/BW. Výsledky echokardiografie ukazujú, že LVEF a LVFS sú signifikantne znížené v skupine SZ, LVIDd, LVID a IVSTd sú významne zvýšené v skupine SZ. ECH však významne znižuje LVIDd, LVID, IVSTd a zlepšuje LVEF a LVFS, medzi týmito tromi skupinami nie je žiadny významný rozdiel v HR, LVPWTd je zvýšený v HF, ale žiadny rozdiel medzi ECH a Ctrl alebo medzi ECH a HF, všetko ako Obrázok 2E-K ukazuje. Výsledky farbenia HE naznačujú, že hypertrofia myokardu, usporiadaná porucha alebo degeneračná nekróza, infiltrácia zápalových buniek a intersticiálna hyperémia a edém u potkanov HF a ECH významne zmierňuje tieto poškodenia, hypertrofia myokardu a usporiadaná porucha sú zmiernené. degeneračná nekróza a zápalový infiltrát sú znížené, ako je znázornené na obrázku 3A. Meria sa plocha prierezu kardiomyocytov, po ISO sa výrazne zväčšuje a v skupine liečenej ECH sa znižuje, ako ukazuje obrázok 3E. Hodnotenia depozície kolagénu farbením podľa Massona odhaľujú, že obsah kolagénu v ľavej komore u potkanov HF je zjavne zvýšený a zjavne znížený po liečbe ECH, čo zjavne znižuje CVF. Analýza PCR v reálnom čase odhaľuje, že transkripty prokolagénu typu Ⅰ sú up-regulované u potkanov ISO a down-regulované u potkanov ECH, tieto výsledky sú navzájom konzistentné, ako ukazujú obrázky 3B a FG, údaje naznačujú, že ECH účinne znižuje ukladanie kolagénu . Počet TUNEL-pozitívnych buniek v kardiomyocytoch je významne zvýšený u HF potkanov v porovnaní s Ctrl, ECH výrazne znižuje apoptózu myokardiálnych buniek a obrázok 3C-D ukazuje reprezentatívny obraz TUNEL-pozitívnych buniek v poliach s nízkym a vysokým výkonom a obrázok 3H ukazuje rýchlosť apoptózy buniek myokardu. Tieto výsledky naznačujú, že ECH účinne zvráti hypertrofiu myokardu, intersticiálnu fibrózu myokardu a apoptózu a zlepšuje funkciu srdca u potkanov HF indukovaných ISO.

OBRÁZOK 3 Výsledky histologického farbenia demonštrujú, že ECH obracia remodeláciu ľavej komory HF potkanov indukovanú ISO.

3,3|ECH chráni ultraštruktúru myokardu u HF potkanov

Výsledky transmisných elektrónových mikrografov ukazujú, že poškodenie ultraštruktúry myokardu by mohlo byť oslabené ECH, ako ukazuje obrázok 4A-B. Myofibrily sú vertikálne usporiadané, štruktúra sarkomér je zrejmá, myofilamenty sú usporiadané úhľadne a čiara Z je jasná. Mitochondrie sú úhľadne usporiadané a štruktúra je u Ctrl potkanov jasná. Myofibrily sú však dezorganizované, prasknuté a rozpustené, štruktúra sarkomér je neostrá, chýba čiara Z, je viditeľná zóna kontrakcie myokardu, počet a objem mitochondrií je zvýšený, mitochondrie sú rôzneho tvaru a veľkosti, usporiadané v neporiadku, štruktúra je nejasná, opuch a fragmentácia krís, kolaps alebo zhlukovanie a rozpustené vo vakuole u HF potkanov. ECH tieto zmeny očividne tlmí, väčšina vlákien srdcového svalu je úhľadne usporiadaná a vlákna myokardu sú čisté, čiara Z existuje, aj keď je zjavné určité rozpúšťanie vlákien, štruktúra sarkomér je jasná, hustota mitochondrií je znížená, tvary a veľkosti sú uvoľnené, usporiadané prehľadnejšie, opuch mitochondrií a fragmentácia krís, kolaps alebo zhlukovanie a vakuolizácia sú evidentne znížené ECH v porovnaní so HF. Opuch a fragmentácia mitochondrií, kolaps alebo zhlukovanie a čiastočná vakuolizácia sú identifikované ako mitochondriálna degenerácia. Výsledky ukazujú, že ECH účinne chráni ultraštruktúru myokardu a najmä chráni mitochondriálnu morfológiu u potkanov HF, ako ukazuje obrázok 4C-F.

OBRÁZOK 4 ECH chráni ultraštruktúru kardiomyocytov a mitochondriálnu morfológiu HF potkanov indukovanú ISO.

3,4|ECH up-reguluje proteínovú expresiu SIRT1, FOXO3a a MnSOD

Analýza Western Blot ukazuje, že hladina proteínovej expresie SIRT1, FOXO3a a MnSOD je u HF potkanov významne znížená, avšak ECH evidentne upreguluje zníženú expresiu proteínu. Reprezentatívne proteínové pásy výsledkov imunoblotu a štatistickej analýzy sú znázornené na obrázku 5. Časť údajov naznačuje, že ECH zvyšuje proteínovú expresiu SIRT1, FOXO3a a MnSOD.

3,5|ECH inhibuje mitochondriálny oxidačný stres v tkanive myokardu ľavej komory

V tejto časti sú merané mitochondriálne ROS, MMP, oxidačné poškodenie mitochondriálnej DNA, obsah karbonylového proteínu a hladina peroxidácie lipidov v mitochondriách v tkanive myokardu ľavej komory potkanov a výsledky sú v súlade s bunkovými experimentmi, tj. ECH znižuje mitochondriálne ROS, chráni MMP, zmierňuje stupeň poškodenia mtDNA, znižuje obsah karbonylového proteínu a peroxidáciu lipidov v mitochondriách, ako ukazuje obrázok 6.

OBRÁZOK 5 ECH up-reguluje hladinu proteínovej expresie SIRT1, FOXO3a a MnSOD, ktorá je down-regulovaná u HF potkanov.

4|DISKUSIA

Táto štúdia demonštruje, že ECH má účinné úlohy pri prevencii remodelácie myokardu a zlepšovaní funkcie srdca prostredníctvom up-regulácie signalizačnej osi SIRT1/FOXO3a/MnSOD a inhibície mitochondriálneho oxidačného stresu.

Mitochondrie sú hlavným miestom tvorby ROS ako vedľajšieho produktu oxidatívnej fosforylácie, vzhľadom na ich blízkosť k ROS sa mitochondriálne proteíny, lipidy a mtDNA považujú za primárne ciele oxidačného poškodenia po nadmernej emisii mitochondriálnych ROS,34,35 toto poškodenie stimuluje ďalšiu produkciu ROS, začarovaný kruh pokračuje, ROS a oxidačný stres by mohli viesť k hypertrofii myokardu, apoptóze, intersticiálnej fibróze a HF prostredníctvom aktivácie viacerých signálnych dráh.35 Zdá sa teda, že lieky, ktoré sa zameriavali na inhibíciu mitochondriálnej oxidačnej stres sú účinné pri prevencii remodelácie myokardu. ECH je prírodný fenyletanoidový glykozid, zložka tradičnej čínskej byliny Cistanche tubulosa. je široko študovaný a v posledných rokoch sa preukázalo, že má rôzne farmakologické aktivity, ako je protinádorový, antiapoptózový, anti-agingový, neuroprotektívny účinok atď. Štúdie preukázali, že farmakologické účinky ECH závisia najmä od jeho antioxidačnej a protizápalovej aktivity,18,21 a ECH znižuje mitochondriálne ROS a chráni mitochondriálnu funkciu pred oxidačným poškodením v nervových bunkách.20,22 Tu sme najprv preukázali, že ECH znižuje mitochondriálne ROS kardiomyocytov, čím zlepšuje MMP, znižuje oxidačné poškodenie mtDNA, proteínu a lipidov, účinne inhibuje mitochondriálne oxidačné poškodenie a znižuje apoptózu in vitro a in vivo, takže obracia remodeláciu myokardu a zlepšuje funkciu srdca. To znamená, že ECH je potenciálnym novým liekom na prevenciu remodelácie myokardu a SZ.

Za normálnych podmienok sa mitochondriálny ROS odstraňuje hlavne MnSOD, ktorý sa distribuuje v mitochondriách a chráni pred mitochondriálnym oxidačným poškodením. Ang II významne znižuje expresiu MnSOD v kardiomyocytoch a indukuje hypertrofiu myokardu, avšak resveratrol by mohol zvýšiť expresiu MnSOD a inhibovať hypertrofiu myokardu indukovanú Ang II.36 Pri HF je aktivita MnSOD významne znížená a tvorba mitochondriálnych ROS je zvýšená .37,38 U myší s knockoutom génu MnSOD špecifického pre srdce nebolo možné odstrániť mitochondriálne ROS a ROS je zvýšený v kardiomyocytoch, čo viedlo k mitochondriálnej dysfunkcii a progresívnemu zväčšeniu srdca, čo nakoniec viedlo k zlyhaniu srdca.39 V tejto štúdii potvrdzujeme že expresia MnSOD je výrazne znížená, čo je oslabené liečbou ECH, a tým je znížená mitochondriálna ROS a inhibovaný mitochondriálny oxidačný stres. Znamená to, že ECH chráni kardiomyocyty pred oxidačným poškodením prostredníctvom up-regulácie expresie MnSOD, ďalej skúmame molekulárne mechanizmy, ktoré sú základom týchto účinkov.

Expresia MnSOD je regulovaná FOXO3a, čo je transkripčný faktor a viaže sa v oblasti génového promótora MnSOD a vedie k podpore transkripcie génu.40 SIRT1 je protismerná molekula FOXO3a a môže aktivovať FOXO3a deacetyláciou. Signalizačná os SIRT1/FOXO3a/MnSOD hrá kľúčovú úlohu pri ochrane pred oxidačným stresom u rôznych typov buniek, aktivácia signalizačnej osi estradiolom inhibuje oxidačný stres a vykonáva srdcovú ochranu24; Aktivácia signalizačnej osi resveratrolom inhibuje bunkovú smrť vyvolanú oxidačným stresom40; V opačnom prípade angiotenzín II inhibuje dráhu SIRT1/FoxO3a/MnSOD a vyvoláva mitochondriálny oxidačný stres, poškodenie mtDNA v osteoblastoch41, adenylylcykláza typu 5 zvyšuje oxidačný stres inhibíciou expresie MnSOD prostredníctvom dráhy Sirt1/FoxO3a.42 Táto štúdia uvádza, že expresia SIRT1, FoxO3a a MnSOD sú všetky významne znížené u potkanov HF a mitochondriálne ROS je zvýšené a oxidačný stres je zvýšený, zmeny sú však zvrátené pomocou ECH. Nový výskum naznačuje, že ECH priamo viaže SIRT1 ako ligand a vytvára komplex s 9 kovalentnými väzbami a zvyšuje expresiu SIRT1 v nervových bunkách.26 V súlade s touto štúdiou táto štúdia ukazuje, že ECH tiež zvyšuje expresiu SIRT1 v kardiomyocytoch potom upreguluje génovú expresiu MnSOD prostredníctvom FoxO3a a inhibuje mitochondriálne ROS a oxidačný stres.

Dlhodobá chronická ischémia môže spôsobiť hibernáciu myokardu, tieto hibernujúce bunky myokardu typicky vykazujú stratu kontraktilných filamentov, v cytosóle je nadbytok granúl glykogénu, sarkoplazmatického retikula a stratia sa priečne tubuly43, existujú aj abnormality vo veľkosti a tvare mitochondrií. , reaktívna hypertrofia myokardu a intersticiálna fibróza, ktorá je sekundárna v dôsledku straty myocytov.44 Vyššie uvedené zmeny sme pozorovali aj u potkanov so HF v našej štúdii, zatiaľ čo ECH tieto zmeny výrazne zmierňuje, keďže najnovšia štúdia uvádza, že obnovenie srdcovej funkcie po ischemickom strese môže byť 7J.

Predchádzajúca štúdia tiež odhalila hibernáciu myokardu na modeli prasaťa s neischemickým srdcovým zlyhaním pomocou stimulácie voľnej steny ĽK s vysokou frekvenciou46, pretože mikrovaskulárna obštrukcia hrá dôležitú úlohu pri hibernácii myokardu a výslednej kontraktilnej dysfunkcii, ktorá sa výrazne zlepší, keď mikrovaskulárna obštrukcia je zvrátená liekom.47 V súčasnosti niektoré štúdie dospeli k záveru, že revaskularizačná terapia je účinná pri hibernácii myokardu,43 pomocou HE a Massonovho farbenia pozorujeme, že myokardiálna kapilárna a arteriolárna hustota sa u potkanov so srdcovým zlyhaním očividne znižuje a výrazne sa uvoľňuje pomocou ECH, ako je znázornené na obrázku 7A-H. Predchádzajúce štúdie ukázali, že iné prírodné zlúčeniny, ako je jačmenný beta-glukán, majú kardioprotektívne účinky zvýšením expresie MnSOD, 48, 49, a zvýšenie MnSOD súvisí so zvýšenou hustotou myokardu a expresiou VEGF. Vykonali sme RT-PCR na detekciu expresie VEGF, údaje sú v súlade so zistením histologického farbenia, čo znamená, že ECH môže podporovať angiogenézu a zvyšovať hustotu myokardu prostredníctvom regulácie expresie VEGF, ako je znázornené na obrázku 7I. Táto štúdia zistila, že ECH môže chrániť a zvyšovať myokardiálne kapiláry a arterioláry prostredníctvom up-regulácie dráhy SIRTI/FOXO3a/MnSOD a expresie VEGF, čím potláča hibernáciu myokardu a prispieva k zlepšeniu funkcie srdca.

Cistanche prispievadozlepšenie funkcie srdca.

Pre viac informácií kliknite sem.

Je potrebné poznamenať, že apoptóza kardiomyocytov je dobre známa ako dôležitá patologická zmena pri zlyhaní srdca a táto štúdia skutočne potvrdzuje, že veľké množstvo apoptotických buniek u potkanov HF a ECH významne znižuje apoptózu prostredníctvom regulácie dráhy SIRTI/FOXO3a/MnSOD a inhibície mitochondriálny oxidačný stres, ako je uvedené vyššie.

ECH predovšetkým obracia remodeláciu myokardu a zlepšuje funkciu srdca prostredníctvom upregulácie signalizačnej osi SIRT1/FoxO3a/MnSOD, čím inhibuje mitochondriálny oxidačný stres a znižuje hibernáciu myokardu. Preto sa predpokladá, že ECH je potenciálnym liekom na prevenciu alebo liečbu remodelácie myokardu a SZ.