Účinky DPTQ, nového pozitívneho alosterického modulátora dopamínového D1 receptora, na spontánnu frekvenciu žmurkania očí a priestorovú pracovnú pamäť u primátov (okrem človeka, časť 1)

Abstraktné

Odôvodnenie

Dopamínová (DA) signalizácia cez D1 receptor je neoddeliteľnou súčasťou viacerých aspektov kognície, vrátane základného procesu pracovnej pamäte. Objav pozitívnych alosterických modulátorov (PAM) D1 receptora umožnil liečebné modality, ktoré môžu mať alternatívne výhody ako ortosterické D1 agonisty vyplývajúce zo synergizmu účinku s funkčnou D1 receptorovou signalizáciou.

Dopamín je neurotransmiter, ktorý má dôležité účinky na fungovanie mozgu. Hrá dôležitú úlohu pri regulácii emócií, jedenia, emócií, učenia, pamäti a mnohých ďalších aspektov. Nedávne štúdie zistili silný vzťah medzi dopamínom a pamäťou.

Štúdie ukázali, že dopamín môže zlepšiť schopnosť jednotlivca zapamätať si situácie a udalosti. Je to preto, že dopamín reguluje interakcie medzi neurónmi v mozgu, čím uľahčuje ukladanie a získavanie relevantných informácií. Dopamín môže zároveň posilniť spojenie medzi neurónmi, zlepšiť účinnosť prenosu medzi neurónmi a ďalej podporovať tvorbu a udržiavanie pamäte.

V reálnom živote môžeme zvýšiť sekréciu dopamínu rôznymi spôsobmi, aby sme si zlepšili pamäť. Cvičenie môže napríklad podporovať vylučovanie dopamínu, takže pravidelné fyzické cvičenie je účinným spôsobom, ako zlepšiť pamäť. Navyše, niektoré potraviny ako fazuľa, orechy, celozrnný chlieb atď. môžu tiež zvýšiť sekréciu dopamínu a pomôcť nám zlepšiť pamäť.

Pri každodennom štúdiu a práci môžeme zlepšiť pamäť aj stimuláciou dopamínového systému mozgu. Môžeme napríklad aktivovať dopamínový systém stanovením cieľov, odmeňovaním sa a poskytovaním pravidelnej spätnej väzby, čím si zlepšíme pamäť a pochopenie vedomostí, ktoré sme sa naučili. Navyše, pozitívny prístup a dobrá nálada môžu tiež podporiť vylučovanie dopamínu a zlepšiť pamäť.

Stručne povedané, medzi dopamínom a pamäťou je úzky vzťah. Prostredníctvom vedeckých metód a správneho postoja môžeme podporiť vylučovanie dopamínu, zlepšiť našu pamäť a lepšie zvládať výzvy v štúdiu a práci. Je vidieť, že potrebujeme zlepšiť pamäť a Cistanche deserticola dokáže výrazne zlepšiť pamäť, pretože Cistanche deserticola dokáže regulovať aj rovnováhu neurotransmiterov, ako je zvýšenie hladín acetylcholínu a rastových faktorov. Tieto látky sú veľmi dôležité pre pamäť a učenie. Okrem toho Mäso môže tiež zlepšiť prietok krvi a podporiť dodávku kyslíka, čo môže zabezpečiť, že mozog dostane dostatok živín a energie, čím sa zlepší mozgová vitalita a vytrvalosť.

Kliknite na vedieť spôsoby, ako zlepšiť funkciu mozgu

Ciele

Aby sme preskúmali tento potenciál, študovali sme účinky nového D1 PAM DPTQ na úlohu pracovnej pamäte s priestorovou oneskorenou odozvou u opice rhesus. Počiatočné štúdie ukázali, že DPTQ sa viaže na primát D1R s vysokou afinitou a selektivitou a zvyšuje spontánnu rýchlosť žmurkania u opíc rhesus spôsobom závislým od dávky v súlade s expozíciami plazmatického ligandu a centrálnou aktiváciou D1.

Výsledky

Na základe týchto výsledkov bol DPTQ testovaný pri 2,5 mg/kg IM v úlohe pracovnej pamäte. 1 hodinu po podaní sa nepozoroval žiadny akútny účinok, ale o 48 hodín neskôr sa výkon zhoršil. Je pozoruhodné, že po tomto defekte okamžite nasledovalo výrazné zlepšenie kognície počas nasledujúcich 3 dní.

V druhom experimente, v ktorom sa DPTQ podával v dňoch 1 a 5, bolo skoré poškodenie menšie a nedosiahlo štatistickú významnosť, ale počas nasledujúceho týždňa sa pozorovalo štatisticky významné zlepšenie výkonu. Nižšie dávky 0,1 a 1.0 mg/kg boli tiež schopné produkovať toto predĺžené zlepšenie bez vyvolania akéhokoľvek prechodného poškodenia.

Závery

DPTQ je príkladom triedy D1PAM, ktoré môžu byť schopné poskytovať dlhodobé zlepšenia pracovnej pamäte.

Kľúčové slová

Pozitívny alosterický modulátor · Dopamín · D1 · Žmurkanie · Pracovná pamäť · Priestorovo oneskorená odozva · Cyklický AMP · Plasticita.

Úvod
Dopamín (DA) sa kriticky podieľa na mnohých aspektoch funkcie mozgu vrátane motorickej aktivity, bdelosti a kognície. Najmä receptor D1 je rozhodujúci pre udržanie kognitívnych funkcií vysokého rádu u primátov, vrátane pozornosti, výkonných funkcií a pracovnej pamäte, a tento receptor je hojný v prefrontálnom kortexe primátov, kde je jeho signalizácia integrálnou súčasťou základného kognitívneho procesu práce. pamäť (Sawaguchi a GoldmanRakic ​​1991; Goldman-Rakic ​​et al. 2004).

Pracovná pamäť je kľúčovým ukazovateľom výsledku u pacientov so schizofréniou a jej funkcia sa znižuje pri starnutí a neurodegeneratívnych poruchách (Bodnar a kol. 2008; Rhode a Katz 2017; Zokaei a Husain 2019). Toto sú oblasti s vysokou neuspokojenou medicínskou potrebou. Najmä je známe, že vyčerpanie prenosu dopamínu (vrátane signalizácie D1 receptora) pri starnutí prispieva k poklesu kognitívnych funkcií súvisiacich s vekom (Roth a Joseph 1994; Volkow a kol. 1998; Karrer a kol. 2017).

V dôsledku toho bola funkcia D1 receptora predmetom rozsiahlej štúdie na behaviorálnej, bunkovej a molekulárnej úrovni (Muly a kol. 1998; Castner a kol. 2000; Goldman-Rakic ​​a kol. 2000; Dunah a Standaert 2001; Castner a Williams 2007; Liu a kol., 2017).

Vývoj D1 agonistov na zlepšenie kognície predstavoval zložitú výzvu v dôsledku reakcie na dávku v tvare obráteného U (Williams a Goldman-Rakic ​​1995; Vijayraghavan et al. 2007). Okrem toho predĺžená stimulácia D1 agonistami s vysokou afinitou/dlhodobým účinkom môže viesť k rozvoju tolerancie (Asin a Wirtshafter 1993; Lewis a kol. 1998; Gulwadi a kol. 2001; Smith a kol. 2002, Ryman-Rasmussen a kol. 2007 ).

Preto klinické štúdie s úplnými D1 agonistami mali obmedzený úspech (Blanchet a kol. 1996; Giardina a Williams 2001; Zang a kol. 2009). Boli zavedené novšie prístupy na aktiváciu D1 vrátane čiastočných agonistov dopamínu D1 (Roberts a kol. 2010; Balice-Gordon a kol. 2020; Kozak a kol. 2020; Riesenberg a kol. 2020).

Alternatívnym prístupom by bolo vyvinúť pozitívny alosterický modulátor (PAM) pre D1 receptor na základe hypotézy, že aktivita PAM by bola závislá od endogénneho dopamínergného tonusu, ktorý by potencoval dopamín, kedy a kde sa uvoľňuje. To by ponúklo fyziologickejší prístup, ktorý by mohol poskytnúť lepšie terapeutické rozpätie a možno by sa tak vyhlo reakcii na dávku v tvare obráteného U a vývoju tolerancie pozorovanému u niektorých agonistov D1. Nedávno bolo opísaných a charakterizovaných niekoľko selektívnych D1PAM zo štruktúrnej triedy tetrahydroizochinolínov a farmakologická diferenciácia od agonistov D1 bola stanovená v sérii štúdií in vitro a in vivo (Svensson a kol. 2017; Bruns a kol. 2018; Hao a kol. 2019; Meltzer a kol. 2019 a Svensson a kol. 2019).

Kvôli druhovému rozdielu vo väzbe D1 pre D1PAM sa tieto neurochemické a behaviorálne štúdie uskutočnili na transgénnej myši, v ktorej bol myší D1 receptor nahradený jeho ľudským ekvivalentom (hD1 myš). Celkovo údaje podporili prokognitívny potenciál pre tento prístup (Bruns et al. 2018 a Meltzer et al. 2019). Pre túto štúdiu sme vybrali D1PAM DPTQ (Hao a kol. 2019), blízky štrukturálny analóg predtým opísaného farmakologického nástroja DETQ a klinického kandidáta LY3154207 (medailovaný; Hao a kol. 2019; Wilbraham a kol. 2021, Biglan a kol., 2022 a McCarthy a kol., 2022).

DPTQ má EC50 76 nM pre potenciáciu dopamínom indukovaného zvýšenia cAMP v stabilne transfekovaných ľudských D1 klonovaných bunkách a má vhodné fyzikálno-chemické vlastnosti s prijateľnou penetráciou do mozgu po systémovom dávkovaní (Hao et al. 2019).

Naším hlavným cieľom tejto štúdie bolo stanoviť centrálnu farmakodynamickú aktivitu a preskúmať potenciálnu účinnosť na kogníciu s D1PAM u vyššieho druhu, opice rhesus. Už skôr sa ukázalo, že členovia série tetrahydroizochinolín D1PAM majú vysokú afinitu k tomuto druhu, podobne ako ľudia (Svensson et al. 2017, Wang et al. 2018 Hao et al. 2019).

Na počiatočné farmakodynamické testovanie sme vybrali model spontánnej rýchlosti žmurkania u opice rhesus, aby sme stanovili dávky potrebné na dosiahnutie centrálnej D1 reakcie na DPTQ u vyšších druhov. Je známe, že D1 agonisty v tomto modeli zvyšujú frekvenciu žmurkania (Elsworth a kol. 1991; Jutkiewicz a Bergman 2004). Okrem toho majú pacienti s Parkinsonovou chorobou zníženú frekvenciu spontánneho žmurkania (Deuschl a Goddemeier 1998; Karson a kol. 1982).

Hoci existuje veľa interaktívnych neurotransmiterových systémov zapojených do spontánnej rýchlosti žmurkania, tento model možno použiť ako marker aktivácie centrálneho dopamínového D1 receptora (Jutkiewicz a Bergman 2004) a môže odrážať aj účinky na kogníciu (Taylor a kol. 1999; Jongkees a Colzato 2016). Predchádzajúca štúdia s DETQ ukázala zvýšenú frekvenciu spontánneho žmurkania, aj keď s menšou odozvou ako tá, ktorá bola pozorovaná u D1 agonistu SKF82958 (Bruns et al., 2018).

Na kognitívne testovanie u opice rhesus sme vybrali úlohu priestorovej oneskorenej odozvy (Roberts et al., 2010), vysoko zavedenú translačnú mieru priestorovej pracovnej pamäte, o ktorej sa ukázalo, že zapája rovnaké nervové obvody u ľudí a primátov (Jonides a kol., 1993; GoldmanRakic, 1996; McCarthy a kol., 1996; Postle a kol., 2000).

Metódy

In vitro testovanie v cAMP teste

Receptor D1 človeka, opice rhesus, psa alebo myši bol klonovaný do vektorového systému Jump-In (Life Technologies Corp, CA) a prechodne transfekovaný do buniek HEK293. Zvýšenie cAMP pomocou DPTQ (voľná báza, Eli Lilly) sa meralo v prítomnosti EC20 koncentrácie dopamínu. Hodnoty EC50 pre každý druh spolu s % max stimulácie (kde maximálna stimulácia dopamínu sa rovná 100 %) sú uvedené v tabuľke 1. Tieto in vitro štúdie sa uskutočnili v Eli Lilly and Company, Indianapolis, v USA. Ďalšie podrobnosti o meraní účinkov na akumuláciu cAMP v týchto prechodne transfekovaných bunkách pozri Hao et al. (2019).

Rýchlosť spontánneho žmurkania u opice rhesus

Zvieratá

Do štúdie bolo zahrnutých 11 5–{1}}-ročných samcov opíc rhesus (Chengdu Ping, An Animal Breeding and Research Base, provincia Sichuan, Čína) s priemernou hmotnosťou 4,83 kg. Zvieratá boli náhodne rozdelené do troch skupín, skupina s vyššou kumulatívnou dávkou DPTQ (n=4); DPTQ skupina s nižšou kumulatívnou dávkou (n=3); a vehikulum (20 % Captisol (CyDex Pharmaceuticals, Inc., KS) v NaP04 pufri) skupina (n=4).

Agonista D1 SKF82958 bol zahrnutý ako pozitívna kontrola; výsledky pre túto zlúčeninu (tu nie sú uvedené) boli nedávno publikované spolu s údajmi pre iný D1PAM (DETQ, pozri Bruns et al. 2018). D1 selektívny antagonista SCH39166 hydrobromid (kat. č.: 2299, šarža č.: 3A/129719) bol zakúpený od Tocris, MN, a bol pripravený v čistej vode Millipore s objemom injekcie 0,2 ml/kg. Antagonista D1 sa podával 15 minút pred vehikulom alebo DPTQ (n=4 zvierat na skupinu).

Opice boli chované individuálne vo viváriu s kontrolovanou klímou (22–24 stupňov) a vlhkosťou (40–70 %). Uskutočnil sa cyklus 12 hodín svetlo/12 hodín tma (svetlo svietilo od 7:00 do 19:00). Opice mali neobmedzený prístup k vode a dostávali denný prídel vysokoproteínového opičieho jedla, každý deň doplnené ovocím. Pred podaním zlúčeniny a počas testovacích hodín neboli opice kŕmené ovocím ani potravou.

Štúdia Spontaneous Eye Blink Rate bola vykonaná v ChemPartner, Shanghai, Čína. Ustajnenie pre opice v zariadení pre veľké zvieratá Shanghai ChemPartner je plne akreditované AAALAC. Zvieratá boli sociálne párovo umiestnené v 2 prepojených klietkach, čo umožnilo vizuálnu a verbálnu komunikáciu so susednými opicami, ako aj sebapozorovanie zo závesného zrkadla na každej klietke. Rozmer klietky pre každú opicu bol 0,9 (D) × 0,9 (Š) × 2 (V) m, vnútri bola umiestnená tekvica, loptička na kŕmenie alebo guľôčka na žuvanie.

Program obohatenia zahŕňal televízne programy 2-3 krát týždenne a hudbu na pozadí niekoľko hodín každý druhý deň. Zdravotný stav zvierat bol pravidelne kontrolovaný ošetrujúcim veterinárom a denne personálom starostlivosti o zvieratá na ich (1) vzhľad, srsť a chvost; (2) výkaly a močenie; a (3) hrubé správanie, spotreba potravy a príznaky choroby. Všetky tréningové a testovacie protokoly boli schválené Inštitucionálnym výborom pre dobré životné podmienky zvierat IACUC a výborom pre politiku v ChemPartner (Shanghai, Čína).

Prístroj a experimentálny protokol

Rýchlosť spontánneho žmurkania bola meraná počas pozorovacích experimentov uskutočnených v špeciálne skonštruovanom opičom kresle (Mason et al. 2019). Krčná doska v tvare U, ktorá pomáhala fixovať orientáciu hlavy, sa použila na uľahčenie pozorovania odozvy rýchlosti žmurkania. Kompaktná videokamera (Panasonic/wv-cp480/CH) na statíve bola umiestnená pred sediacou opicou. Dva obrazy z kamier boli spojené zberačom videa (systém Color QUAD) a prenesené do softvéru EthoVision (Noldus, Leesburg, VA) v počítači na online prezeranie a nahrávanie.

Dva týždne pred testovaním boli opice denne trénované, aby sedeli v opičej stoličke počas dvoch 2-hodinových intervalov s odmenou za jedlo. Počas testov po tréningu, ktoré sa uskutočňovali každý deň medzi 9:00 ráno a 16:30, bola každá opica skúmaná počas deviatich po sebe nasledujúcich 15-minútových komponentov. Každý 15-minútový blok pozostával z 10-minútového privykacieho obdobia, po ktorom nasledovalo 5-minútové obdobie, počas ktorého sa počítalo žmurkanie.

The video was displayed on a computer screen to allow continual observation of the subject. Observers blind to the treatment conditions later scored each 5-minute videotaped session. An eye blink was defined as a visible, rapid opening and closing of the eyelid. Two observers independently confirmed the measurement with reliability>90%.

Farmakologické testovanie

Účinky rôznych D1 ligandov na spontánnu rýchlosť žmurkania boli študované postupom kumulatívneho dávkovania (Jutikiewicz a Bergman 2004). Aktívna zlúčenina alebo vehikulum (Captisol 20 % w/v NaP04 pufor) sa podávali po získaní dvoch základných záznamov očných žmurkaní. Ligand sa podával v náhodnom poradí rôznym opiciam z každej skupiny, ako je opísané vyššie. Na štúdium reakcie na dávku a časového priebehu sa na konci 15-minútových zložiek každej testovacej relácie podávali prírastkové dávky DPTQ.

Chemikálie

DPTQ (voľná báza, pozri Hao a kol. 2019) bola dodaná spoločnosťou Eli Lilly Company. Kaptizol (šarža č.: NC04A-05034) sa pripravil nasledovne: Kaptizol 20% w/v NaPO4 pufor 25 mM, pH 8. Objem injekcie pre DPTQ bol 0,5 ml/kg IM. DPTQ v dávkach 0,1 mg/kg, 0,5 mg/kg a 1 mg/kg boli dávkované ako číry roztok, zatiaľ čo dávky 5 mg/kg a 10 mg/kg boli formulované ako jemné suspenzie.

Vyššie uvedený roztok vehikula sa skladoval pri 4 stupňoch v chladničke a pred použitím sa vrátil na teplotu miestnosti. Pri dennej príprave čerstvého DPTQ sa k zlúčenine pridala časť vehikula (20 % Captisol) a zmes sa miešala do vlhka, potom sa pridal zvyšok vehikula a zmes sa miešala, kým sa roztok nestal homogénnym. Suspenzia sa potom sonikovala na ľadovom kúpeli počas 40 minút, aby sa zmenšila veľkosť častíc. Zvieratám sa podávali dávky v kresle.

Analýza údajov pre frekvenciu žmurkania

Výsledky pre každú opicu boli vyjadrené ako rýchlosť žmurkania (žmurkania za minútu) spriemerovaná za každú 5-minútovú testovaciu epochu. Účinky vehikula a D1 PAM na žmurkanie očí boli spriemerované pre každú skupinu opíc a vyjadrené ako priemer ± SE. Účinky DPTQ a vehikula sa analyzovali pomocou dvojcestnej ANOVA (D1 PAM a čas), po ktorej nasledoval Bonferroniho post hoc test (GraphPad Prism, San Diego CA).

Úloha priestorovej pracovnej pamäte

Zvieratá

Šestnásť makakov rhesus a jeden makak tupochvostý sa zúčastnilo štúdie (podrobnosti sú uvedené nižšie), ktorá sa uskutočnila na Yale University, New Haven CT, USA. Zvieratá sa používali a starali sa o ne v úplnom súlade s usmerneniami a zásadami IACUC univerzity Yale, ako aj so všetkými federálnymi zásadami a nariadeniami USA. Opice dostávali každý deň svoju bežnú stravu, vrátane vhodne výživných sušienok a viacerých druhov ovocia a zeleniny na obohatenie. Testovanie a akékoľvek školenie prebiehalo tesne pred ich hlavným jedlom.
Toto krmivo pozostávalo zo sušienok dodávaných každý deň a všetky zvieratá mali celý 24-hodinový prístup k vode ad libitum. Účasť na kognitívnom testovaní bola zabezpečená obohatením o stimuláciu prostredia a poskytovaním obľúbených pochúťok zvierat ako odmeny v úlohe, vrátane jogurtu, hrozienok, mandlí, hrozna, ovocných slučiek a mnohých ďalších potravín (Roberts a kol. 2010).

Kognitívne testovanie

Priestorová oneskorená odpoveď je zavedeným translačným meradlom priestorovej pracovnej pamäte, o ktorej sa ukázalo, že zapája rovnaké nervové obvody u ľudí a primátov (McCarthy et al. 1996). Obvody zahrnuté v tejto reakcii sú takmer výlučne „dorzálny prúd“ zahŕňajúci dorzolaterálny prefrontálny kortex, najmä oblasť 46, a laterálny intraparietálny sulcus (GoldmanRakic ​​1996). Úplný popis tu použitej úlohy nájdete v Roberts et al. (2010). Zvieratá boli testované v odhlučnenej miestnosti s testovacou komorou. Pri tejto úlohe sa jedno z niekoľkých umiestnení jamiek navnadí potravou podávanou zvieraťu a jamky sa potom prikryjú rovnakými plakmi.

Nepriehľadná clona sa potom spustí na jedno z 5 premenlivých oneskorení a potom sa zdvihne, aby umožnila zvieraťu zareagovať na jedno z umiestnení jamky na získanie potravy. Každá dĺžka oneskorenia sa opakovala 4-krát v polonáhodnom rozložení v rámci 2 0 pokusov v každej testovacej relácii. Každé zviera bolo stabilizované pred začatím akéhokoľvek podávania postupným zvyšovaním počtu jamiek (začínajúc len 2) a dĺžky oneskorenia. 5 premenných dĺžok oneskorenia bolo nastavených na 0, 1, 2, 3 a 4 s vynásobené faktorom "N." Hodnota N sa teda zvyšovala o 1 až maximálne 10, až kým subjekt nevykonával 80 % alebo viac v 3 po sebe nasledujúcich testovacích reláciách, potom sa počet jamiek zvýšil o 1.

Tento proces sa opakoval pre každého jednotlivca, kým nedosiahli stabilný výkon (65–75 % ± menej alebo rovný 2,5 % správny). Táto normalizovaná úroveň výkonu umožňuje citlivú detekciu akéhokoľvek poškodenia alebo zlepšenia spôsobeného experimentálnymi podmienkami. Pre základné údaje pre túto štúdiu sme vzali 7 alebo viac po sebe idúcich údajových bodov, ktoré boli zozbierané v predchádzajúcich týždňoch, ktoré spadali do stabilných limitov testu. Pre celú skupinu 17 zvierat zúčastňujúcich sa na tejto štúdii bol stredný počet jamiek 4 (rozsah 2–7) a stredná hodnota N bola 3 (rozsah 1–7). Zvieratá boli typicky testované 2 až 3 dni v týždni.

Zložené podávanie

DPTQ (voľná báza, Eli Lilly & Co.) sa pripravil tak, ako je opísané vyššie pre test spontánneho žmurkania. Zvieratá (4 samce a 6 samíc, priemerný vek =22 0,1 ± 1,7 roka) boli pôvodne určené na podanie buď vehikula alebo DPTQ 2,5 mg/kg IM v semináhodnom usporiadaní. Jedno zviera dostalo vehikulum, ale nedostalo sa mu DPTQ. Táto istá skupina zvierat sa neskôr použila v štúdii s opakovaným dávkovaním DPTQ 2,5 mg/kg vs. vehikulum. Po zdĺhavom vymývacom období niekoľkých mesiacov sme testovali nižšie dávky 0,1 mg/kg a 1{14}} mg/kg vo vzostupnom poradí.

Táto skupina 10 zvierat zahŕňala 3 z predchádzajúcej štúdie (3 samcov a 7 samíc (vrátane jedného staršieho makaka pahýľového); priemerný vek =22 0,6 ± 1,7 roka). Najmladšie zviera v tejto štúdii malo 17,3 roka. Žiadne zo zvierat nebolo naivné a všetky boli použité v predchádzajúcich štúdiách s inými zlúčeninami. Dostali rozsiahle vymývanie niekoľko týždňov alebo mesiacov pred touto štúdiou a zistilo sa, že majú normálny základný výkon v úlohe.

Počas štúdie boli zvieratá vymyté na základe známych PK vlastností (polčas rozpadu) tohto liečiva, ako aj základnej výkonnosti každého zvieraťa. To znamená, že výkon bol potrebný na návrat na základnú úroveň pred začatím akéhokoľvek iného stavu a typicky sa použila doba vymývania aspoň dva týždne. Kognitívne testovanie sa uskutočnilo 1 hodinu po injekcii, aby zodpovedalo času maximálneho účinku pozorovanému v pôvodnej štúdii žmurkania.

Analýza kognitívnych údajov

Účinok podania vehikula a každej dávky DPTQ sa analyzoval pomocou 1-analýzy rozptylu (ANOVA), po ktorej nasledovali post hoc porovnania na základe miery falošných objavov (FDR), s použitím dvojstupňového krokového- up metóda Benjaminiho a kol. (2006; GraphPad Prism 9.1). Táto metodika bola zvolená vzhľadom na vysoký počet skupín (dní) a obmedzený počet testov (zvieratá).

Na určenie štatistickej významnosti sa použila hladina 0,05. Po počiatočnom testovaní, aby sa zaistilo, že vehikulum nebude mať žiadne významné účinky (pozri "Výsledky" nižšie), sa vykonali porovnania so základnou líniou (spriemerovanou z niekoľkých relácií) ako kontrolou.

Analýza expozície plazmatického ligandu

Vzorky plazmy sa odobrali do skúmaviek EDTA pri {{0}}, 0,25, 0,50, 1, 2, 4, 8, 12 a 24 hodinách po boluse IM injekcia a skladovaná pri -70 °C až do ďalšej analýzy pomocou LC/MS (ďalšie podrobnosti pozri Hao et al. 2019). Pre nižšiu dávku 0, 1 mg / kg, IM, sa vzorky plazmy odobrali od troch zvierat, ktoré sa podieľali na úlohe priestorovej pracovnej pamäte na Yale University, približne 1, 5 hodiny po podaní dávky (~ 30 minút po ukončení relácie behaviorálneho testu).

Zvieratá boli aklimatizované na voľné sedenie na prispôsobenej stoličke a držanú jednu nohu na ostrihanie srsti (ak to bolo potrebné), utieranie 70 % alkoholom a napichnutie saphenóznej žily pomocou trubice BD Vacutainer vo vnútri bezpečnostného držiaka. Pre dávku 5 mg/kg IM sa vzorky plazmy odobrali v samostatnej štúdii u troch dospelých samcov opíc makakov v Eli Lilly and Company, Indianapolis, IN. Odber a skladovanie vzoriek prebiehalo podľa postupu opísaného vyššie a analýza hladín D1 ligandu sa uskutočnila v Eli Lilly and Company, Indianapolis, IN, USA, pomocou kvapalinovej chromatografie a tandemovej hmotnostnej spektrometrie.

Výsledky

Účinky DPTQ na akumuláciu cAMP u štyroch druhov

DPTQ bol testovaný v HEK293 bunkách prechodne exprimujúcich ľudské, psie, opice rhesus a myšie dopamínové D1 receptory. Hodnoty EC50 a Emax potenciátora pre D1 receptory psov a opíc rhesus boli podobné ako hodnoty pre ľudský D1 receptor (tabuľka 1). Avšak potenciátor EC50 pre myšací D1 receptor bol posunutý doprava asi 14- až 23-násobne v porovnaní s opičkou rhesus a človekom. Okrem toho Emax pre myšací receptor D1 bol iba 41% v porovnaní so 77–88% pre ostatné tri druhy.

Spontánna frekvencia žmurkania očí

Priemerná východisková frekvencia žmurkania pred podaním dávky neprekročila 10 žmurknutia/min a frekvencia žmurkania bola relatívne stabilná v rámci testovacích relácií u jednotlivých subjektov po injekcii vehikula. DPTQ bol testovaný v dvoch kumulatívnych dávkových režimoch (obr. 1). Vyššia kumulatívna dávka DPTQ (0,5 mg/kg, 5 mg/kg a 10 mg/kg, IM) viedla k najvyššej miere žmurkania. Účinok časového priebehu po týchto vyšších dávkach ukázal, že po 30 minútach došlo k významnému zvýšeniu rýchlosti žmurkania očami po DPTQ (p<0.01), 45 min (p<0.001), 60 min (p<0.01), and 75 min (p<0.05) (Fig. 1). The lower cumulative dose of DPTQ (0.1 mg/ kg, 1 mg/kg and 5 mg/kg, resulted in small but significant (p < 0.05) increases in rates of eye blinking only at the 45-min and 60-min time points (Fig. 1). During recording and observation, some vehicle group monkeys fell asleep or became drowsy in the monkey chair as time went by. In contrast, all of the DPTQ-treated monkeys remained alert throughout the test period of close to 2.5 hours.

Vysoké aj nižšie kumulatívne dávky DPTQ viedli k určitému stupňu orálneho pohybu, ako je vyčnievanie jazyka (údaje nie sú uvedené). Avšak iba vyššia kumulatívna dávka vykazovala jasný účinok 30 minút po podaní DPTQ v porovnaní so skupinou s vehikulom. To je v súlade s aktiváciou pohybu jazyka po stimulácii receptora D1 opísanej u opíc (Bédard a Boucher 1989).

Podávanie samotného D1 selektívneho antagonistu SCH39166 (0,03 mg/kg, IM) vyvolalo krátke zníženie rýchlosti žmurkania a vizuálne pozorovania ukázali, že zvieratá boli mierne utlmené. Tento efekt trval asi 15 minút (obr. 2). Zvieratá vopred ošetrené SCH39166 vykazovali len malú, nevýznamnú (str<0.05) increase in eye blink rate induced by higher accumulated doses (0.5, 5, 10 mg/kg) of DPTQ (Fig. 2; compare to Fig. 1).

Analýza plazmatických hladín DPTQ u opíc

V prvej štúdii sa vzorky plazmy odoberali v rôznych časových bodoch od troch zvierat po dobu až 24 hodín po dávke 5 mg/kg IM (obr. 7). Vysoké celkové plazmatické hladiny DPTQ boli merané počas prvých 2 hodín v rozsahu od približne 9000 do 1800 nM s odhadovanými plazmatickými koncentráciami neviazanej látky 674 až 125 nM. Na základe údajov, že DPTQ má pomer koncentrácie neviazaného mozgu vs. neviazanej plazmy približne 0,3 a frakcie neviazaného ligandu 0,068 (J. Cramer, nepublikované údaje), predpokladané koncentrácie neviazaného mozgu pre DPTQ po injekcii 5 mg/kg by sa teda pohybovali od 202 až 38 nM počas prvých 2 hodín po podaní dávky. Tieto koncentrácie sú v rozsahu hodnoty hD1 EC50 pre DPTQ v teste cAMP, ktorý je hlásený ako 76 nM (Hao et al. 2019) a pri alebo nad opičím D1 EC50 38 nM, ktorý je tu uvedený s použitím prechodne exprimovaných buniek (tabuľka 1) .

V druhej štúdii sa vzorky odobrali po nízkej dávke {{0}},1 mg/kg, IM od troch zvierat približne 1,5 hodiny po dávke v kognitívnej štúdii. Ako je znázornené na obr. 3, nízka dávka 0,1 mg/kg IM viedla k približne 50x nižším plazmatickým hladinám DPTQ. Celkové plazmatické koncentrácie D1 PAM sa pohybovali od 56 do 91 nM (obr. 7). Pri použití rovnakých predpokladov ako vyššie pre frakciu neviazaného ligandu a pomer neviazaného mozgu verzus neviazaná plazma by odhadované koncentrácie neviazaného ligandu v mozgu boli 1–2 nM po 1,5 hodine po dávke 0,1 mg/kg IM. Tieto hladiny sú ďaleko pod hodnotami EC50 u opíc a ľudí pre zosilnenie aktivácie cAMP indukovanej dopamínom v teste vitro.

For more information:1950477648nn@gmail.com