Účinok extraktov z Cistanche Tubulosa na samčiu reprodukčnú funkciu u diabetických potkanov vyvolaných streptozotocínom-nikotínamidom-Ⅰ

1. Úvod

Diabetes mellitus (DM) je stav, pri ktorom sú zvýšenéhladiny glukózyv krvi v dôsledku neefektívnosti pankreasu pri produkcii dostatočného množstva inzulínu alebo neschopnosti tela ho efektívne využiť. Podľa WHO sa počet ľudí s cukrovkou zvýšil zo 108 miliónov v roku 1980 na 422 miliónov v roku 2014 [1]. Existujú štyri hlavné kategórie: prediabetes (štádium pred cukrovkou), typ 1 (kde pankreas nedokáže produkovať inzulín), typ 2 (telo nedokáže využiť inzulín) a gestačný diabetes (ktorý sa vyskytuje počas tehotenstva). Oxidačný stres vzniká v dôsledku nerovnováhy medzi produkciou reaktívnych foriem kyslíka (ROS) a antioxidantov [2], čo nakoniec vedie k diabetickému stavu. Medzi komplikácie cukrovky patrí zlyhanie obličiek, poškodenie nervov, slepota, mŕtvica, srdcový infarkt, smrť plodu a neplodnosť. [1]. Štúdie ukazujú, že jadrá spermií, deoxyribonukleová kyselina (DNA) a mitochondrie boli významne poškodené u pacientov s cukrovkou [3]. Oxidačný stres počas transportu spermií zmení proces mužského reprodukčného systému [4,5].

PRÍRODNÁ CISTANCHE TUBULOSA NA ZLEPŠENIE SEXUÁLNEJ FUNKCIE PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Proces spermatogenézy je riadený osou hypotalamus – hypofýza – gonáda (HPG). Hormón uvoľňujúci gonadotropín (GnRH) produkovaný hypotalamom stimuluje produkciu luteinizačného hormónu (LH) a hormónu stimulujúceho folikuly (FSH). Leydigove bunky sa nachádzajú v susedstve semenného tubulu aprodukovať testosterónpod kontrolou LH. FSH spúšťa produkciu proteínu viažuceho antigén (ABP), ktorý pomáha prenášať mužský hormón. Neplodnosť a iné problémy teda vznikajú najmä v dôsledku porúch, ktoré sa vyskytujú v HPG osi. Podávanie kombinácie streptozotocín-nikotínamid indukuje diabetes u experimentálnych potkanov. Streptozotocín je chemická zlúčenina toxická pre bunky v pankrease produkujúce inzulín a nikotínamid je vo vode rozpustný vitamín, ktorý chráni bunky pred úplným poškodením [6].

Cistanche tubulosa je púštny druh rastliny známy aj ako "Rou Cong-Rong" [7]. Je to nechlorofylová parazitická rastlina, ktorá rastie hlavne na koreni stromu Calotropis procera a je široko rozšírená v suchej krajine Gansu, Qinghai, Xinjiang, Mongolsku, Iráne a Indii. Všeobecný názov Cistanche tubulosa je „Púštny hyacint“. Je široko akceptovaný v čínskej tradičnej medicíne a dostal názov "Ženšen púšte". Je široko používaný v medicíne na liečbu morbídnej leukorey, hojnej metrorágie, chronických ochorení obličiek, zápchy, impotencie a neplodnosti. Chemické zložkyCistanche tubulosa pozostáva z neprchavých fenyletanoidových glykozidov(PHG), iridoidy, lignany, prchavé oleje, alditoly, oligosacharidy a polysacharidy [8]. Štúdie to ukazujúechinakozidz tejto byliny chráni poškodený fibroblast reguláciou hladiny ROS [9]. Táto zlúčenina vyvoláva antioxidačné, vazorelaxačné a protizápalové aktivity spolu s neuroprotekciou a prevenciou osteoporózy [10,11].

Cieľom tejto štúdie bolo preskúmať účinokExtrakt z Cistanche tubulosaobsahujúce ECH na reprodukčnú dysfunkciu diabetického potkana vyvolaného streptozotocínom-nikotínamidom.

2. Materiály a metódy

2.1. Materiály

ECH a CTE boli zakúpené od Sinphar Pharmaceutical Co., Ltd (Yilan, Taiwan). Koncové produkty pokročilej glykácie (AGE) boli zakúpené od Biovision (San Francisco, CA, USA). Bunkové línie LC-540 a TM3 boli zakúpené od Výskumného a vývojového inštitútu potravinárskeho priemyslu (Hsinchu, Taiwan). Päťtýždňové samce potkanov Sprague-Dawley (SD) boli zakúpené od National Laboratory Animal Center (Taipei, Taiwan). Feed Lab Diet® bol zakúpený od PMI Nutrition International, Inc. (Taipei, Taiwan). 2,2-difenyl-1-pikrylhydrazyl (DPPH) bol získaný od Sigma (St. Louis, MO, USA). Metanol a kyselina 4-(2-hydroxyetyl)-1-piperazínetánsulfónová (HEPES) boli tiež zakúpené od spoločnosti Sigma. Dulbeccovo modifikované Eagle médium/F12 a trypsín-EDTA boli získané od GIBCO (New York, NY, USA). 3-(4, 5-dimetyltiazol-2-yl)-2, 5-difenyltetrazóliumbromid (MTT), dichlór-dihydro-fluoresceín diacetát (DCFH-DA), dimetylsulfoxid (DMSO) a tetrazóliová nitromodrá (NBT) boli zakúpené od spoločnosti Sigma. Glukózové enzymatické súpravy boli získané z Kyokutoseiyaku, Tokio, Japonsko. Súpravy inzulínovej ELISA boli zakúpené od Mercodia AB Inc., Sylveniusgatan 8A (Uppsala, Švédsko). Extrakčné činidlo T-PER tkanivového proteínu bolo získané od Thermo Scientific (Chicago, IL, USA). Polyklonálne protilátky NF-KB proti ľudskému/myšiemu/potkanemu jadrovému faktoru-kappa B boli zakúpené od Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA. Polyklonálne protilátky proti myším/krysím receptorom pre koncové produkty pokročilej glykácie (RAGE), polyklonálne protilátky proti ľudským/myším/potkaním StAR a monoklonálne protilátky proti ľudskému/myšiemu/krysímu cytochrómu P450 17A1 boli zakúpené od spoločnosti Gene Tex (Irvine, CA, USA). Polyklonálne protilátky proti ľudskému/myšiemu/potkanému CYP11A1 sa získali od spoločnosti Cell Signaling Technology (Beverly, PA, USA). Činidlo Easy-Blue bolo zakúpené od Invitrogen, Thermo Fisher Scientific (Carlsbad, CA, USA). Agaróza a DNA marker 100 bp boli získané od Promega, Corporation (Madison, WI, USA). RNeasy Lipid Tissue Mini Kit bola zakúpená od QIAGEN, Hilden, Nemecko.

PRÍRODNÁ CISTANCHE TUBULOSA NA ZLEPŠENIE SEXUÁLNEJ FUNKCIE PHGS75% ECH 30% ACT 12%

2.2. Metódy

2.2.1. In vitro analýza

Bunková kultúra LC{{0}} a TM3: Bunkové línie LC{2}} sa kultivovali pri 37 ◦C v médiu Earle's Balanced Salt Solution (EBSS) doplnenom hydrogénuhličitanom sodným (1,5 g/l), L-glutamín (2 mM), neesenciálne aminokyseliny (0,1 mM), pyruvát sodný (1.0 mM) a fetálne hovädzie sérum (FBS) (10 %) v 5% CO2 inkubátor (CO2 inkubátor, Napco 5410, Taiwan). Bunková línia TM3 bola kultivovaná v Dulbeccovom modifikovanom Eagle médiu (DMEM) doplnenom glukózou (4,5 g/l), pyruvátom sodným (0,5 mM), L-glutamínom (2,5 mM), hydrogénuhličitanom sodným (1,2 g/l), {{ 28}}(2-hydroxyetyl)-1-piperazínetánsulfónová kyselina (HEPES, 15 mM) a fetálne teľacie sérum (FCS, 10 %) alebo konské sérum (5 %) pri 37 ◦C v 5 % CO2 inkubátor.

Stanovenie životaschopnosti buniekEchinakozid (ECH): Na test životaschopnosti buniek sa použilo činidlo 3-(4, 5-dimetyltiazol-2-yl)-2,5- difenyltetrazóliumbromid (MTT). Koncentrácia buniek bola upravená na 2 x 105 buniek/ml v 96-jamkovej platni. Potom sa pridalo 20 ul ECH (zriedeného v 2 % média) a inkubovalo sa 24 hodín pri 37 °C v 5 % C02 inkubátore. Neskôr sa pridalo 100 ul MTT činidla a inkubovalo sa 4 hodiny pri 37 °C v tmavých podmienkach. Absorbancia sa merala pri 570 nm (ELISA čítačka, Dynatech MR5000, Kloten, Švajčiarsko).

Relatívna životaschopnosť buniek (%)=[(vzorka pri 570 nm – slepá pri 570 nm)]/[(kontrolná pri 570 – slepá pri 570)] × 100.

Nitroblue tetrazolium (NBT) redukčný test a 2,2-difenyl-1-pikrylhydrazyl (DPPH) test: Počet buniek bol upravený na 1× 1{{10}}6 buniek/ ml. Potom sa pridalo 50 mg/ml ECH, resveratrol (RES) a konečné produkty pokročilej glykácie (AGE) (kontrola) a kokultivovali sa 18 hodín pri 37 ◦C. Potom sa pridalo 0,3 ml roztoku NBT (0,1 mg/ml NBT, 5 % FBS a 3 % dimetylsulfoxid (DMSO) rozpustené v 10 ml DMEM) a inkubovalo sa pri 37 °C v 5 % C02 počas 1 hodiny. Po centrifugácii (pri 800 x g počas 3 minút) sa supernatant odstránil a pridalo sa 200 ul DMSO a zmes sa pretrepávala počas 5 minút v ultrazvukovom oscilátore (Delta Ultrasonic Cleaner D 200, Keelung, Taiwan). Absorbancia sa merala pri 630 nm. Pre radikálový test DPPH sa ako štandard použil Trolox (v 95% alkohole). Potom sa 75 ul 0,5 mM roztoku DPPH zmiešalo s 25 ul vzoriek a nechalo sa reagovať pri teplote miestnosti na tmavom mieste počas 30 minút. Zmes sa pretrepala a zmerala sa absorbancia pri 517 nm.

Analýza obsahu druhov reaktívneho kyslíka (ROS): Počet buniek sa upravil na 2 x 105 buniek/ml v 12-jamkovej platni obsahujúcej 2 % FBS. Potom sa na platňu pridalo 50 ul/ml ECH, RES a AGE a inkubovalo sa pri 37 °C počas 24 hodín. Po 24 hodinách sa pridalo 20, 70 -dichlórfluoresceín-diacetát (DCFH-DA) a inkubovalo sa pri 37 °C počas 30 minút. Po centrifugácii (400 x g, 5 minút) sa supernatant odstránil a bunky sa dvakrát premyli fyziologickým roztokom pufrovaným fosfátom (PBS). Potom sa bunky suspendovali v 1 ml PBS a hladiny ROS sa stanovili pomocou prietokového cytometra (Flow Cytometer, Becton Dickinson, CA, USA).

Identifikácia a kvantitatívna analýza proteínu: Proteíny sa extrahovali pomocou proteínového extrakčného činidla (T-PER). Hustota buniek sa upravila na 2 x 105 buniek/ml v 12-jamkovej platni a 50 ul/ml ECH, RES a receptor pre antagonistu pokročilého glykačného koncového produktu (RAGE) a pridali sa AGE a inkubovali sa pri 37 ◦C v 5% CO2 inkubátore počas 24 h. Potom sa pridalo 400 ul T-PER, bunky sa zoškrabali a centrifugovali pri 125,000x g počas 20 minút (4 ◦C). Supernatant sa zhromaždil a skladoval pri -80 °C (-80 °C mraznička, Nuaire, Plymouth, MN, USA) na ďalšiu analýzu. Na kvantifikáciu proteínov sa použila súprava kyseliny bicinchonínovej (BCA). Potom sa 10 ul štandardného bunkového roztoku a 200 ul BCA činidla pridalo do 8-jamkových platní a inkubovalo sa pri 37 °C v 5% CO2 inkubátore počas 30 minút. Absorbancia sa merala pri 562 nm. Analýza proteínovej identifikácie sa uskutočnila elektroforézou na dodecylsulfát sodný (SDS)-polyakrylamidový gél (SDS-PAGE). Vzorky sa pripravili pridaním proteínového lyzátu do proteínového nanášacieho pufra a na detekciu špecifických proteínov sa uskutočnila analýza Western blot.

2.2.2. In vivo analýza

Návrh zvieracieho modelu: Šesťdesiat {{0}}týždňových samcov potkanov Sprague–Dawley (SD) bolo zakúpených od National Laboratory Animal Center (Taipei, Taiwan). Každý potkan bol umiestnený individuálne v dezinfekčných klietkach z nehrdzavejúcej ocele pri kontrolovanej teplote (23 ± 1 ◦C) a vlhkosti (40–60 %) s cyklom 12 h svetlo/12 h tma. Potrava a voda boli poskytované ad libitum. Každá krysa bola domestikovaná v prvom týždni a ako hlavná strava bola podávaná laboratórna strava pre hlodavce 5001. Všetky postupy sa riadili štandardom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC Approval č. 101026) National Taiwan Ocean University, Taiwan. Po domestikácii boli potkany rozdelené do dvoch skupín: kontrolná skupina (Con), ktorá bola kŕmená laboratórnou stravou 5001, a diabetická skupina, ktorá bola kŕmená stravou s vysokým obsahom tukov (HFD, 40 %) počas celého experimentu. Po kŕmení HFD počas 4 týždňov bola diabetická skupina potkanov injikovaná streptozotocínom (65 mg/kg) (STZ) na vyvolanie diabetes mellitus (DM). Do 15 minút po injekcii STZ sa vstrekol nikotínamid (230 mg/kg telesnej hmotnosti). Týždeň po injekcii sa uskutočnil orálny glukózový tolerančný test (OGTT), aby sa určila úspešná indukcia diabetes mellitus (DM). Potom boli zvieratá rozdelené do šiestich skupín: kontrola (kŕmená laboratórnou stravou 5001); skupina DM (DM + 45 % HFD); skupina DMR (DM + rosiglitazón: 0,571 mg/kg telesnej hmotnosti) + 45% HFD; skupina DME1 (DM + CTE: 80 mg/kg telesnej hmotnosti) + 45% HFD; skupina DME2 (DM + CTE: 160 mg/kg telesnej hmotnosti) + 45% HFD; a skupina DME4 (DM + CTE: 320 mg/kg telesnej hmotnosti) + 45% HFD. Rosiglitazón (RSG) sa použil ako pozitívna kontrola. Tri dávky CTE (80, 160 a 320 mg/kg) sa použili podľa odporúčaní Taiwanského úradu pre kontrolu potravín a liečiv (TFDA) na funkčné hodnotenie zdravej výživy. Ošetrenia sa podávali až do konca experimentu. Všetky experimentálne potkany boli usmrtené po 6 týždňoch. Krv odobratá z potkanov sa centrifugovala pri 3000 ot./min. počas 15 minút pri 4 °C. Supernatant sa skúmal na nasledujúcu analýzu:

Stanovenie celkovej glukózy, triglyceridov a cholesterolu: Stanovenie glukózy sa uskutočnilo pomocou glukózových enzymatických súprav. Potom sa k činidlám pridalo 20 ul vzoriek krvnej plazmy a udržiavali sa pri 37 °C počas 5 minút. Celkové triglyceridy a koncentrácia celkového cholesterolu sa stanovili pomocou triglyceridových a cholesterolových enzymatických súprav. Potom sa k reakčným činidlám pridalo 10 ul krvnej plazmy a experiment sa uskutočnil podľa pokynov výrobcu. Absorbancia sa merala pri 510 nm.

Celková glukóza/triglycerid/cholesterol v plazme (mg/dl)=(vzorka – ABlank)/(štandardná – ABlank) × 200.

Vzorka: Absorbancia vzoriek krvi, ABlank: Hodnota absorbancie súprav bez vzorky, Štandard: Hodnota absorbancie štandardného činidla, 200: štandardné činidlá s koncentráciou 200 mg/dl.

Hodnotenie inzulínu, leptínu a homeostatického modelu – stanovenie inzulínovej rezistencie (HOMA-IR):Hladina inzulínu bola stanovená pomocou súprav inzulínovej ELISA. Tu, 25µL krvnej plazmy sa pridalo doreagencie a absorbancia sa merala pri 450 nm. Celkový obsah leptínu bol stanovený pomocou aleptínový enzýmový imunometrický test kit.Potom, 100µL plazmy sa analyzovala a absorbanciabola meraná pri 450 nm pomocou čítačky ELISA. Celý experiment prebiehal podľapokyny výrobcu. Hodnota HOMA-IR bola stanovená z modelu homeostázyhodnotiaca rovnica=Koncentrácia inzulínu v plazme nalačno (mg/ml)× plazmatická glukóza nalačnokoncentrácie (mmol/l)/22,5.

Peroxidácia lipidov v plazme: Tu sa {{0}}.5 ml krvnej plazmy zmiešalo s 1 ml činidla (15%, hmotn./obj. kyselina trichlóroctová v 0.25N kyseline chlorovodíkovej (HCl) ) a 0,375 %, hmotn./obj. kyseliny tiobarbiturovej v 0,25 N HCl) a umiestnili sa do vodného kúpeľa (Vodný kúpeľ, BUCHI 461, Zürich, Švajčiarsko) pri 100 °C na 15 minút. Po ochladení sa pridal 1 ml n-butanolu, dôkladne sa pretrepal a centrifugoval pri 1500 x g počas 10 minút. Odobral sa supernatant a merala sa absorbancia pri 532 nm [12].

Koncentrácia malondialdehydu (MDA) (nM/ml)=[(vzorka pri 532 nm – slepý pokus pri 532 nm)/ (štandard pri 532 nm – slepý pokus pri 532 nm)] × 5.

štandard pri 532 nm − Ablank pri 532 nm)] × 5. Stanovenie hladín testosterónu a luteinizačného hormónu (LH) v plazme: Na meranie hladiny testosterónu v krvnej plazme sa použila súprava testosterónu ELISA. Na stanovenie koncentrácie LH bola použitá súprava RIA. Potom sa pridalo 50 ul plazmy a výpočty boli založené na koncentrácii hormónu LH-RP-3 (štandard). Ďalšie kroky sa uskutočnili podľa pokynov výrobcu.

Stanovenie koncentrácie faktora nekrotizujúceho nádory (TNF) a interleukínu-6 (IL-6): Zachytená protilátka sa zriedila 250-krát v poťahovacom pufri a pridala sa do 96- doštička s jamkami (100 ul/jamka) a udržiavaná pri 4 °C cez noc. Supernatant bol odsatý a päťkrát premytý premývacím pufrom (1-krát PBS, 0,05 % Tween 20). Po inkubácii (1 h) s 200 ug testovacieho riedidla sa bunky 5-krát premyli premývacím pufrom a do každej jamky sa pridalo 100 ul TNF-štandardného roztoku alebo testovaných vzoriek a inkubovali sa 2 hodiny. Po premytí sa pridalo 100 ul IL-6-detegovaných protilátok a inkubovalo sa 1 hodinu pri teplote miestnosti. Supernatant sa odsal a premyl 5-krát. Potom sa pridalo 480 ul enzýmu avidín-chrenová peroxidáza (HRP) a inkubovalo sa 30 minút pri teplote miestnosti. Supernatant bol odsatý a päťkrát premytý premývacím pufrom. Potom sa pridalo 100 ul roztoku substrátu a inkubovalo sa 15 minút pri teplote miestnosti. Neskôr sa do každej jamky pridalo 50 ul stop roztoku (1M kyselina fosforečná) a merala sa absorbancia pri 450 nm.

PRÍRODNÁ CISTANCHE TUBULOSA NA OPRAVU SEXUÁLNYCH FUNKCIÍ PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Analýza parametrov spermií a semenníkov

Odber vzoriek spermií: Odber vzoriek spermií sa uskutočnil podľa metódy predtým uvedenej v [13]. Spermie sa odobrali zo supernatantu a použili sa na ďalšiu analýzu.

Počet spermií, pohyblivosť spermií a abnormálne spermie: Počet spermií sa vypočítal pomocou hemocytometra a roztoku trypánovej modrej. Potom sa 100 µl tekutiny zo spermií zmiešalo s roztokom trypánovej modrej a pomocou hemocytometra a mikroskopu sa vypočítal počet spermií, pohyblivosť a abnormálne spermie [14].

Nitromodrá tetrazolium Redukcia NBT a lipidová peroxidácia spermií a semenníkov: Lipidová peroxidácia a redukcia NBT sa analyzovali podľa rovnakého postupu analýzy plazmy.

Stanovenie aktivity superoxiddismutázy (SOD) a katalázy: Aktivita superoxiddismutázy (SOD) sa analyzovala pomocou súpravy RANSEL. Tu, {{0}}.05 ml testikulárnych homogenátov sa pridalo k 1,7 ml reakčného roztoku (0,05 mM xantín, 0,025 mM 2- ({ {9}}jódfenyl)- 3-(4-nitrofenol)-5-fenyltetrazóliumchlorid (INT)). Po zmiešaní sa pridalo 0,25 ml xantínoxidázy (80 U/l) a nechalo sa reagovať pri teplote miestnosti počas 30 sekúnd. Absorbancia sa merala pri 505 nm. Koncentrácia proteínu v testikulárnom homogenáte sa stanovila pomocou súpravy Bio-Rad DC na stanovenie proteínu a vypočítala sa jej špecifická aktivita (U/mg proteínu). Aktivita katalázy (CAT) sa stanovila podľa predtým opísanej metódy [15].

Farbenie H&E (hematoxylín a eozín).

Semenník bol namočený v 10% formalíne na 24 hodín a skladovaný pri 4 ◦C. Tkanivá boli v mikroveľkosti a pripevnené na sklíčko. Po fixácii (95% metanol + 5% kyselina octová) sa sklíčka ponorili do hematoxylínu na 3 minúty, premyli sa tečúcou vodou na 5 minút a potom sa namočili do 50%, 70% a 90% alkoholu. jednu minútu. Potom boli sklíčka zafarbené eozínom na 10 s a namočené v 100% alkohole na jednu minútu, kým nevybledli. Nakoniec bolo sklíčko namočené v xyléne na jednu minútu. Neskôr sa sklíčko vysušilo na vzduchu a utesnilo. Zafarbená skúmavka sa umiestnila do inverzného fázového kontrastného mikroskopu (Inverted Phase Difference Microscope, Olympus CK-2, Tokio, Japonsko), aby sa pozorovala morfológia.

Analýza hypotalamu

Myšia sekvencia génu KISS1, receptor spojený s G-proteínom (GPR) 54, supresor cytokínovej signalizácie 3 (SOCS-3) a sirtuín 1 (SIRT1) boli identifikované z génovej databázy NCBI (Národné centrum pre biotechnologické informácie). a špecifický primer bol navrhnutý pomocou Primer 5.{8}} PREMIER Biosoft, Palo Alto, CA, USA.). Priméry použité v experimente sú uvedené v tabuľke 1.

Extrakcia kyseliny ribonukleovej (RNA) z hypotalamu. Extrakcia RNA z hypotalamu mozgu sa uskutočnila pomocou súpravy RNeasy Lipid Tissue Mini Kit. Získané mRNA boli kvantitatívne merané reverznou transkripciou (RT) a polymerázovou reťazovou reakciou (PCR). Komplimentová DNA získaná z RT analýzy bola uložená pri -20 ◦C na neskoršie použitie. Extrahovaná DNA bola podrobená analýze polymerázovej reťazovej reakcie (PCR) s použitím Taq polymerázy. Potom sa odobralo 5~10 ul produktu PCR a analyzovalo sa elektroforézou na 1,5% agarovom koloide. Snímka bola urobená v zobrazovacom systéme UVP BioDoc-It. Odobrala sa reverzne transkribovaná komplementárna deoxyribonukleová kyselina (cDNA) a uskutočnila sa PCR s použitím súpravy IQ SYBR Green Supermix Kit. Neskôr bol analyzovaný pomocou softvéru optického systému iQTM 5. Proteíny boli extrahované pomocou proteínového extrakčného činidla (T-PER). Potom sa 20 mg testikulárneho homogenátu pridalo k 400 µl T-PER a odstredilo sa (vysokorýchlostná centrifúga, Hettich ČR-12, Tuttlingen, Nemecko) pri 4 °C (125,000× g ) počas 20 min. Nasledujúca metóda bola podobná "identifikačnej a kvantifikačnej analýze proteínu" v in vitro analýze.

2.3. Štatistická analýza

Experimentálne výsledky boli vyjadrené ako priemer ± štandardná odchýlka (priemer ± SD) a údaje boli analyzované pomocou softvéru Statistical Product & Service Solutions (SPSS) 11.0, IBM, Armonk, New York, NY, USA. Rozdiely medzi skupinami boli analyzované jednosmernou analýzou rozptylu (ANOVA). Viacnásobné porovnania rôznych skupín boli analyzované Duncanovým testom pri hodnote p < 0,05 ako významnej úrovni.

3. Výsledky

3.1. In vitro analýza

3.1.1. Porovnanie antioxidačných aktivít ECH, CTE a RES

Dlhodobá hvysoký oxidačný stres a chronický zápal sú hlavnými príčinami cukrovkykomplikácie [16]. CTE obsahujú rôznefenyletanoidové glykozidy, ako je echinakozid(ECH) a akteozids potenciálom antioxidačnej aktivity [17]. Vychytávanie radikálov DPPHbol uskutočnený test na vyhodnotenie antioxidačnej aktivity ECH. Trolox a resveratrol(3,5,4'-trihydroxystilbén, RES) boli použité ako štandardná a pozitívna kontrola. Ako je znázornenéna obrázku1, ECH vykazovala lepšiu aktivitu vychytávania radikálov a aktivita bola výrazne vyššiaako pozitívna kontrola (RES).

3.1.2. Životaschopnosť buniek ECH na LC-540 a TM3 Leydig Cells

MTT test sa uskutočnil na vyhodnotenie životaschopnosti buniek rôznych koncentrácií ECH. LC-540 Leydigove bunky a TM3 Leydigove bunky vykazovali po ošetrení ECH viac ako 80 % životaschopnosti (obrázok 2). V porovnaní s inými koncentráciami, koncentrácia 100-uM (riedenia 100 uM v 2% FBS) ECH vykazovala lepšiu životaschopnosť buniek v TM3 Leydigových bunkách. Výsledok ukázal, že zvýšená koncentrácia ECH neprispieva k žiadnej významnej toxicite pre bunky.

3.1.3. Účinok ECH na produkciu superoxidu indukovanú AGE pomocou testu NBT v LC-540 a TM3 Leydigových bunkách

AGE spôsobujú oxidačné poškodenie v tele v dôsledku oxidácie glukózy a tvorby voľných radikálov, ako sú O2-, hydroxylové radikály a karbonylové skupiny [18]. Po stimulácii 50 ug/ml AGEs boli bunky LC-540 (obrázok 3a) a TM3 (obrázok 3b) ošetrené ECH a RES (5 uM a 10 uM každý). Výsledky ukázali, že produkcia superoxidového aniónu bola zvýšená v kontrolnej skupine (stimulované AGE), ale produkcia superoxidového aniónu bola znížená po kontrolnej skupine (stimulované AGE), ale produkcia superoxidového aniónu sa po produkcii superoxidu znížila a chránila bunky pred oxidačným poškodením. V prípade LC-540 buniek vykazoval 10 uM ECH takmer podobnú aktivitu ako normálna skupina. Produkcia superoxidu v oboch bunkách bola znížená so zvýšením koncentrácie ECH aj RES.

PRÍRODNÁ CISTANCHE TUBULOSA NA ZLEPŠENIE SEXUÁLNEJ FUNKCIE PHGS75% ECH 30% ACT 12%

3.1.4. Účinok ECH na produkciu H2O2 v AGE-stimulovaných LC-540 Leydigových bunkách

Na detekciu prítomnosti oxidačných druhov sa uskutočnil test DCFH-DA. Po vstupe do buniek sa fluorescenčné farbivo DCFH-DA oxiduje intracelulárnym H2O2 a vytvára dichlórfluoresceín (DCF). Ako je znázornené na obrázku 4, došlo k významnému zvýšeniu intracelulárnej produkcie H202 v skupine stimulovanej AGE (kontrola), zatiaľ čo pridanie 10 uM ECH a RES významne znížilo produkciu H202 v bunkách. Podávanie 10 uM ECH malo za následok len asi 47,1 % produkcie H202, čo je výrazne nižšie ako v kontrolnej skupine.

3.1.5. Účinok ECH na hladiny expresie RAGE a NF-κB proteínu v AGE-stimulovaných LC-540 Leydigových bunkách

Na potvrdenie prítomnosti RAGE v LC-540 Leydigových bunkách sa uskutočnila analýza Western blot. Účinok ECH na hladiny expresie proteínov RAGE (obrázok 5a) a NF-KB (obrázok 5b) v AGEs stimulovaných Leydigových bunkách je znázornený na obrázku 5. Výsledky ukázali, že koncentrácia AGE 50 ug/ml indukovala vyššie RAGE a NF- Expresia κB v LC-540 Leydigových bunkách a 10 uM koncentrácia ECH a RES významne znížili expresiu RAGE a NF-κB. Expresia NF-KB bola významne nižšia v RES a ECH ako v antagonistoch RAGE. Výsledky teda potvrdili, že ECH znížilo úroveň zápalu znížením hladiny RAGE a NF-KB.

3.1.6. Účinok ECH na dráhu syntézy testosterónu v AGE-stimulovaných LC-540 Leydigových bunkách.

Proces spermatogenézy a mužskej neplodnosti závisí od prítomnosti testosterónu. Ako je znázornené na obrázku 6, expresia proteínov StAR (obrázok 6a), CYP11A1 (obrázok 6b), CYP17A1 (obrázok 6c) a HSD17 3 (obrázok 6d) bola významne znížená v AGE stimulovaných LC{11 }} Leydigove bunky (kontrolná skupina). Expresia proteínov StAR, CYP11A1, CYP17A1 a HSD17 3 sa významne zvýšila, keď sa pridal antagonista RAGE, RES a ECH. Zvýšená expresia proteínov StAR a CYP11A1 bola pozorovaná v skupinách liečených ECH aj RES. Úroveň expresie CYP17A1 bola takmer podobná v skupinách RES a ECH. Expresie proteínu HSD17 3 v Leydigových bunkách ošetrených ECH boli oveľa vyššie ako v bunkách ošetrených antagonistom RES a RAGE. Zvýšená expresia proteínov StAR, CYP11A1, CYP17A1 a HSD17 3 indikovala normálnu produkciu testosterónu.