Účinky Cistanche Deserticola na proliferáciu, apoptózu a migráciu bunkovej línie rakoviny prsníka T-47D reguláciou LncRNA LIFR-AS1

[Abstrakt]Cieľ Skúmať účinky Cistanche deserticola na proliferáciu, apoptózu a migráciu bunkovej línie rakoviny prsníka T-47D a jej reguláciu na nekódujúcej (Lnc) RNA antisense RNA receptora leukémie s dlhým reťazcom-1 (LIFR-AS1). Metóda T-47D bunky boli kultivované v rôznych koncentráciách (100, 200, 400 μ Kultivujte vodný extrakt z Cistanche deserticola v kultivačnom médiu g/ml počas 24 hodín, rozdelené do skupín s nízkou, strednou a vysokou dávkou Cistanche deserticola. Súčasne sa ako kontrolná skupina použili normálne kultivované bunky. Transfektujte si-NC a si-LIFR-AS1 do T-47D buniek a pridajte 400 μ Kultivujte s g/ml kultúry Cistanche deserticola médium počas 24 hodín, vrátane skupiny Cistanche deserticola s vysokou dávkou plus si-NC a skupiny s vysokou dávkou Cistanche deserticola plus si-LIFR-AS1. Na detekciu expresie sa použila fluorescenčná kvantitatívna polymerázová reťazová reakcia v reálnom čase (qRT PCR). hladina LIFR-AS1; Detekčná schopnosť bunkovej proliferácie pomocou testu klonovania doštičiek; Použitie prietokovej cytometrie na detekciu bunkového cyklu a rýchlosti apoptózy; Schopnosť bunkovej migrácie bola testovaná testom scratch. Výsledky V porovnaní s kontrolnou skupinou bola úroveň expresie a rýchlosť apoptózy LIFR-AS1 v skupinách so strednou a vysokou dávkou Cistanche deserticola sa výrazne zvýšil, počet klonov sa výrazne znížil, podiel G0-G1 buniek sa výrazne zvýšil a podiel S buniek a hojenia škrabancov sadzba bola výrazne znížená (P<0 05); Compared with Cistanche deserticola high-dose+si NC group, the number of clones formed in Cistanche deserticola high-dose+si LIFR-AS1 group was significantly increased, the proportion of G0-G1 cells and the apoptosis rate were significantly reduced, and the proportion of S cells and the scratch healing rate were significantly increased (P<0 05). Conclusion Cistanche deserticola can induce cell cycle arrest by up-regulating the expression of LIFR-AS1, thereby reducing the proliferation of breast cancer cells, inducing apoptosis, and inhibiting cell migration.

[Kľúčové slová] Cistanche deserticola; Nekódujúca (Lnc) RNA antisense RNA receptora leukémie s dlhým reťazcom -1 (LIFR-AS1); Rakovina prsníka; Proliferácia; apoptóza; prevod

Rakovina prsníka patrí medzi bežné zhubné nádory na klinikách. Miera výskytu rakoviny prsníka v Číne je až 12,5 percent 2 percentá, miera vyliečenia včasnej rakoviny prsníka je vyššia ako 86 percent, ale stále neexistuje účinný marker na včasnú diagnostiku rakovina prsníka. Rádiochemické · 624 · Chinese Journal of Gerontology Vol.43, január 2023 a ďalšie komplexné liečby môžu zlepšiť liečebný efekt pacientov, ale prognóza pacientov je zlá. V súčasnosti nie je objasnená patogenéza rakoviny prsníka. Predchádzajúce štúdie ukázali, že hyperozid, apigenín a iné lieky majú účinky proti rakovine prsníka, avšak špecifický mechanizmus ich účinku ešte nebol objasnený [1-4].

Účinky Cistanche-Antitumor

Cistanche deserticola patrí medzi trvácu rastlinu viniča z čeľade Rubiaceae, ktorá má účinky na tonizáciu jangu obličiek a rozptyľovanie vetra a vlhkosti. Štúdie ukázali, že Cistanche deserticola má farmakologické účinky, ako sú protinádorové a antioxidačné účinky [5]. Terapeutický účinok Cistanche deserticola na rakovinu prsníka a jeho možný mechanizmus však nebol objasnený. Antisense RNA -1 (LIFR-AS1) s dlhým reťazcom nekódujúcej (Lnc) RNA inhibičného faktora receptora leukémie je pri rakovine prsníka málo exprimovaná a môže regulovať bunkovú proliferáciu a migráciu [6]. Nie je však známe, či sa LIFR-AS1 môže použiť ako terapeutický cieľ Cistanche deserticola proti rakovine prsníka. Táto štúdia mala preskúmať, či by Cistanche deserticola mohla ovplyvniť proliferáciu, apoptózu a migráciu buniek rakoviny prsníka T-47D reguláciou LIFR-AS1.

1 Materiál a metódy

1.1 Materiály a činidlá

Cistanche deserticola (20190203) bola zakúpená od Bozhou Baichuan Pharmaceutical Co., Ltd; Bunka rakoviny prsníka T-47D bola zakúpená od Guangzhou Saiku Biotechnology Co., Ltd; Lipofectamine2000 (20190412) a súprava na detekciu apoptózy (20181223) boli zakúpené od Beijing Solaybao Technology Co., Ltd; Trizolové činidlo (20181203) bolo zakúpené od Beijing Quanshijin Biotechnology Co., Ltd; Činidlá na detekciu reverznej transkripcie (20181103) a fluorescenčnej kvantitatívnej polymerázovej reťazovej reakcie (PCR) (20181116) boli zakúpené od Beijing Tiangen Biochemical Technology Co., Ltd; Si-NC a si-LIFR-AS1 boli zakúpené od Shanghai Jima Pharmaceutical Technology Co., Ltd; Králičie protilátky proti ľudskému B-bunkovému lymfómu (Bcl) -2 a Bcl{13}} súvisiace s proteínom X (Bax) boli zakúpené od spoločnosti Santa Cruz Company v Spojených štátoch; Kozia anti-králičia IgG sekundárna protilátka značená chrenovou peroxidázou (HRP) bola zakúpená od Wuhan Doctor Bioengineering Co., Ltd. StepOnePlus fluorescenčný kvantitatívny PCR prístroj v reálnom čase bol zakúpený od ABI Corporation v Spojených štátoch; Prietoková cytometria FACS Calibur bola zakúpená od Beckman Kurt Company v Spojených štátoch.

Zdravotné prínosy prášku Cistanche - Protinádorové

Kliknite sem pre zobrazenie produktov Cistanche

【Požiadať o viac】 E-mail:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

1.2 Experimentálne zoskupovanie

Vodný extrakt z Cistanche deserticola [7]: Odvážte 100 g lieku Morinda officinalis, namočte na 30 minút do vody a potom 60 minút odvarujte. Vodný odvar prefiltrujte a znova odvarujte 45 minút. Filtrát sa dvakrát odoberie a koncentruje sa pri zníženom tlaku na objem 160 ml. Ochlaďte a inkubujte v chladničke 24 hodín. Po centrifugácii pri 3000 ot./min. odoberte supernatant s koncentráciou liečiva 2 g/ml. Kultivačný roztok zrieďte na požadovanú koncentráciu 100, 200 a 400 μg/ml. T-47D bunky sa kultivovali v rôznych koncentráciách (100, 200, 400 μ Vodný extrakt z Cistanche deserticola kultivujte 24 hodín v kultivačnom médiu g/ml, rozdelené do skupín s nízkou, strednou a vysokou dávkou Cistanche deserticola. Súčasne sa ako kontrolná skupina použili normálne kultivované bunky. Transfektujte si-NC a si-LIFR-AS1 do T-47D buniek a pridajte 400 μ kultivačného média g/ml Cistanche deserticola sa kultivovala 24 hodín, vrátane skupiny Cistanche deserticola s vysokou dávkou plus si-NC a skupiny s vysokou dávkou Cistanche deserticola plus si-LIFR-AS1.

1.3 Detekcia úrovne expresie LIFR AS1 pomocou fluorescenčnej kvantifikácie v reálnom čase (qRT) - PCR

Celková RNA T-47D buniek v každej skupine bola extrahovaná pomocou metódy Trizol a reverzne transkribovaná, aby sa syntetizovala cDNA. Pridal sa enzým DeRNA (DEPC) a zriedil sa 20-krát vo vode a potom sa skladoval v chladničke -20 stupňov. Systém qRT-PCR a reakčný postup sa uskutočňovali podľa pokynov súpravy na kvantitatívnu detekciu fluorescencie a detegovala sa relatívna expresia LIFR-AS1 (vnútorná referenčná GAPDH) v bunkách.

1.4 Experiment klonovania platní

Naočkujte T-47D bunky v každej skupine na 6-jamkovú platňu (1 x 103 buniek/jamku) a potom ich umiestnite do inkubátora na ďalšiu kultiváciu počas 14 dní. Premyte vopred vychladeným fosfátovým tlmivým roztokom (PBS) a pridajte metanol (500 μl) Umiestnite do chladničky -20 stupňov na 20 minút, zlikvidujte metanol a pridajte 1 % roztok na farbenie kryštálovou violeťou (400 μl) Inkubujte pri izbovej teplote počas 15 minút a premyte destilovanou vodou. Po vysušení sledujte počet vytvorených klonov.

1.5 Experiment detekcie bunkového cyklu

T-47D bunky v každej skupine (1 × naočkujte 105 kusov/ml na 96-jamkové platne (100 μl/jamku), centrifugujte pri rýchlosti 3000 ot./min. počas 5 minút, odstráňte supernatant a pridajte pre - ochladené PBS resuspendované bunky (500 μl) Pridajte predchladený etanol (70 percent ) k bunkovej suspenzii, odstráňte supernatant a pridajte RNázuA (50 μl) Pridajte farbiaci roztok propidium jodid (PI) (450) po { {13}}minútový vodný kúpeľ pri 37 stupňoch μl) Inkubujte ho v 4-stupňovej chladničke počas 30 minút a analyzujte podiel bunkových cyklov v každej skupine pomocou prietokovej cytometrie FACS Calibur a softvéru Flowjoy.

Púštna živá cistanche

1.6 Detekcia rýchlosti apoptózy buniek prietokovou cytometriou

Pridajte predchladený PBS k T-47D bunkám na premytie, zlikvidujte supernatant a pridajte 500 μl k bunkovej zrazenine μ Resuspenzné bunky s tlmivým roztokom, pracujte podľa súpravy na detekciu apoptózy a zistite rýchlosť apoptózy buniek.

1.7 Skúška škrabancov

Naočkujte T{{0}}D bunky na 6-jamkovú doštičku (1 × 103/jamku), po spracovaní každej skupiny nakreslite čiaru v horizontálnom smere na dno kultivačnej platne ako referencia. Po 48 hodinách kultivácie znova nakreslite čiaru a pozorujte šírku škrabanca v dvoch bodoch, aby ste vypočítali rýchlosť hojenia škrabancov [(šírka škrabanca 0 h - šírka vrypu 48 h)/šírka škrabnutia 0 h × 100 percent 〕.

1.8 Western blot detekcia expresie proteínu Bax a Bcl{2}}

Po extrakcii celkového proteínu z T{0}}D buniek zistite koncentráciu proteínu a odoberte vhodné množstvo vzoriek proteínu na reakciu SDS PAGE. Po prenose membrány a utesnení pridajte prvé riedidlo protilátky (1:1000) a druhé riedidlo protilátky (1:5000) a pomocou automatického gélového zobrazovacieho systému analyzujte sivú hodnotu každého proteínového pruhu. 1.9 Štatistické spracovanie pomocou SPSS 21 Vykonajte t-test a jednosmernú ANOVA pomocou softvéru 0.

Experimentálna štúdia na Cistanche deserticola

2 Výsledky

2.1 Účinky Cistanche deserticola na proliferáciu T-47D a expresiu LIFR-AS1

V porovnaní s kontrolnou skupinou bola hladina expresie LIFR-AS1 v skupinách so strednou a vysokou dávkou Cistanche deserticola významne vyššia, počet klonov bol významne znížený, podiel buniek fázy G0-G1 bol významne vyšší a podiel buniek S fázy bol významne nižší a rozdiely každého indexu medzi skupinami so strednou a vysokou dávkou Cistanche deserticola deserticola boli štatisticky významné (všetky P<0. 01) 05), but there was no statistically significant difference in the proportion of G2-M phase cells among the groups (P>0 05), pozrite si tabuľku 1.

2. 2 Účinok Cistanche deserticola na apoptózu T-47D

V porovnaní s kontrolnou skupinou sa rýchlosť apoptózy a hladina proteínu Bax v skupinách so strednou a vysokou dávkou Cistanche deserticola významne zvýšili, zatiaľ čo hladina proteínu Bcl-2 významne klesla. Rozdiely v rôznych ukazovateľoch medzi skupinami so strednou a vysokou dávkou Cistanche deserticola boli štatisticky významné (všetky P<0. 05) 05), as shown in Table 1, Figure 1, and Figure 2

Tabuľka 1 Účinky Cistanche deserticola na tvorbu klonov bunkového cyklu T-47D, expresiu LIFR-AS1 a apoptózu buniek (x ± s, n=3)

V porovnaní s kontrolnou skupinou: 1) P<0 05; Compared with the low-dose group of Cistanche deserticola: 2) P<0 05; Compared with the medium and low dose group of Cistanche deserticola: 3) P<

Obrázok 1: Účinok Cistanche deserticola na apoptózu T-47D v každej skupine

1-4: Kontrolná skupina, skupina s nízkou dávkou Cistanche deserticola, skupina so strednou dávkou Cistanche deserticola, skupina s vysokou dávkou Cistanche deserticola

Obrázok 2 Účinok Cistanche deserticola na expresiu T-47D apoptotického proteínu

2.3 Účinok Morinda officinalis na migráciu T-47D

V porovnaní s kontrolnou skupinou [({{0}} ± 1,39) percentuálne porovnanie, stredná dávka Cistanche deserticola [(43 56 ± 1.00 percent a miera hojenia škrabancov v skupine s vysokou dávkou Cistanche deserticola [(23 87 ± 0,72 percent ] významne klesla a skupina s vysokou dávkou Cistanche deserticola bola výrazne nižšia ako skupina so strednou dávkou Cistanche deserticola (P<0 05).

2.4 Účinokinterferencia s LIFR-AS1 pri proliferácii T-47D liečenej Cistanche deserticola

V porovnaní so skupinou Cistanche deserticola s vysokou dávkou plus si NC sa počet klonov vytvorených v skupine s vysokou dávkou Cistanche deserticola plus si LIFR-AS1 výrazne zvýšil, podiel G0-G1 buniek sa výrazne znížil a podiel S buniek sa zvýšil (P<0 There was no statistically significant difference in the proportion of G2-M phase cells between the two groups (P>0. 05) 05), pozri tabuľku 2.

Tabuľka 2 Účinky interferujúceho LIFR-AS1 na T-47D bunkový cyklus, klonogenézu, apoptózu a migráciu pri liečbe Cistanche deserticola (x ± s, n=3)

2. 5 Účinok interferencie LIFR-AS1 na apoptózu T-47D indukovanú liečbou Cistanche Deserticola

V porovnaní so skupinou Cistanche deserticola s vysokou dávkou plus si-NC bola miera apoptózy, hladina proteínu Bax a hladina proteínu Bcl{2}} u skupiny Cistanche deserticola s vysokou dávkou plus si-LIFR-AS1 významne znížená (P<0 05), see Table 2, Figure 3, and Figure 4.

Účinok interferencie 2.6 s LIFR-AS1 na migráciu T-47D a expresiu LIFR-AS1 v bunkách ošetrených Cistanche deserticola

V porovnaní so skupinou Cistanche deserticola s vysokou dávkou plus si-NC bola miera hojenia škrabancov v skupine Cistanche deserticola s vysokou dávkou plus si-LIFR-AS1 významne zvýšená a expresia LIFR-AS1 bola významne znížená (P<0 05), see Table 2.

Obrázok 3 Vplyv interferencie LIFR-AS1 na apoptózu T-47D pri liečbe Cistanche deserticola

1-2, Cistanche deserticola s vysokou dávkou plus skupina si-NC, Cistanche deserticola s vysokou dávkou plus skupina si-LIFR-AS1

Obrázok 4: Účinok interferujúceho LIFR-AS1 na expresiu proteínu apoptózy T-47D pri liečbe Cistanche deserticola

3 Diskusia

Čínska bylinná medicína má protiinfekčné, protinádorové a iné účinky. Je mierna a dokáže u pacientok účinne zmierniť niektoré symptómy, patogenéza rakoviny prsníka je však zložitejšia. Molekulárny mechanizmus čínskej bylinnej medicíny proti rakovine prsníka ešte nebol objasnený [8~10]. Cistanche deserticola má účinky na zlepšenie imunity, antioxidáciu a účinnú liečbu osteoporózy, ale jej špecifický mechanizmus účinku zatiaľ nie je známy [11,12]. Výsledky tejto štúdie naznačujú, že Cistanche deserticola môže znížiť proliferáciu buniek rakoviny prsníka vyvolaním zastavenia bunkového cyklu a môže podporiť apoptózu buniek rakoviny prsníka a inhibovať migráciu buniek buniek rakoviny prsníka.

Výhody cistanche tubulosa-Protinádorové

Znížená regulácia expresie LIFR-AS1 je spojená so slabým prežitím pri rakovine žalúdka [13]. LIFR-AS1 inhibuje inváziu a metastázy nemalobunkového karcinómu pľúc prostredníctvom osi miR-942-5p/zinc finger protein (ZNF) 471 [14]. Tieto výsledky naznačujú, že interferencia s expresiou LIFR-AS1 môže významne zvrátiť účinky Cistanche deserticola na proliferáciu, apoptózu a migráciu buniek rakoviny prsníka.

Stručne povedané, Cistanche deserticola môže vyvolať zastavenie bunkového cyklu, oslabiť schopnosť proliferácie buniek rakoviny prsníka, podporovať bunkovú apoptózu a inhibovať migráciu buniek. Jeho mechanizmus súvisí s upreguláciou expresie LIFR-AS1.

Čínska bylina cistanche-Protinádorová

4 Referencie

1 Si L, Fu J, Liu W a spol. Silibinín inhibuje migráciu a inváziu buniek MDA-MB{2}} rakoviny prsníka prostredníctvom indukcie mitochondriálnej fúzie〔J〕．Mol Cell Biochem, 2020; 463( 1-2): 189-201．

2 Qiu J, Zhang T, Zhu X, et al．Hyperozid indukuje apoptózu buniek rakoviny prsníka prostredníctvom ＲOS-sprostredkovanej NF-κB signálnej dráhy〔J〕．Int J Mol Sci, 2019; 21(1): 131-41．

3 Vyhral YS,Seo KI. Lupiwighteón indukuje apoptózu závislú od kaspázy a nezávislú na ľudských bunkách rakoviny prsníka prostredníctvom inhibície dráhy PI3K/Akt/mTOＲ〔J〕Ｒ. Food Chem Toxicol, 2020; 135 (1): 110863-9.

4 Bauer D, Mazzio E, Soliman KFA. Celková transkriptomická analýza apigenínu na TNF-imunoaktivovaných MDA-MB-231 bunkách rakoviny prsníka〔J〕．Cancer Genomics Proteomics, 2019; 16(6): 421-31．

5 Lai Manxiang, Ruan Zhiyan, Xu Yiping Pokrok vo výskume farmakologických účinkov tonizácie obličiek tradičnej čínskej medicíny Cistanche deserticola [J]. Ázijsko-pacifická tradičná medicína, 2017; 13(1): 63-4．

6 Xu F,Li H,Hu C. LIFＲ-AS1 moduluje Sufu, aby inhiboval bunkovú proliferáciu a migráciu miＲ-197-3p pri rakovine prsníka〔J〕．Biosci Ｒep, 2019; 39( 7): 1-9．

7 Ilizati Khalifu Vplyv vodného extraktu Cistanche deserticola na expresiu proteínov EGFR a HER{1}} v bunkách osteosarkómu in vitro [D]. Peking: Lekárska univerzita v Pekingu, 2019

8 Kushwaha PP, Vardhan PS, Kapewangolo P, et al．Fytochemikália Bulbine frutescens inhibuje signálnu dráhu notch a indukuje apoptózu v trojnásobne negatívnych a luminálnych bunkách rakoviny prsníka〔J〕．Life Sci, 2019; 234(1): 116783-9．

9 Zhao Z, Jin G, Ge Y a spol. Naringenín inhibuje migráciu buniek rakoviny prsníka prostredníctvom signálnych dráh zápalových a apoptóznych buniek 〔J〕．Inflammopharmacology, 2019; 27(5): 1021-36．

10 Zan L, Chen Q, Zhang L a spol. Epigalokatechín galát (EGCG) potláča rast a tumorigenicitu v bunkách rakoviny prsníka znížením miＲ-25〔J〕．Bioengineered, 2019; 10(1): 374-82．

11 Zhang Xuexin, Xiao Liuying, Pan Jingqiang Účinok Cistanche deserticola na proliferáciu myších nádorových buniek a expresiu Bax a Bcl{1}} proteínov [J]. Tradičná čínska medicína, 2011; 34(4): 598-601．

12 Li Yimin, Chen Jian, He Jianquan a kol. Účinok liečivého séra Cistanche deserticola na expresiu mRNA proto onkogénu a jadrového väzbového faktora 1 v systéme kokultúry osteoblastov s osteoklastmi ［ J ］. Chinese Journal of Gerontology, 2015; 35( 9): 2328-31．

13 Wang HF,Lv JQ,Li HH, et al．Vysoká dlhá nekódujúca expresia LIFＲ-AS1 koreluje so zlým prežitím pri karcinóme žalúdka〔J〕． Eur Ｒev Med Pharmacol Sci, 2020; 24( 10): 5378-84．

14 Wang Q, Wu J, Huang H, et al．lncＲNA LIFＲ-AS1 potláča inváziu a metastázy nemalobunkového karcinómu pľúc prostredníctvom osi miＲ-942- 5p/ZNF471〔J〕．Cancer Cell Int,2020; 20(1): 180190.