Účinky štyroch čínskych bylinných extraktov na bunky malobunkového karcinómu pľúc citlivé na liečivá a rezistentné voči viacerým liečivám

Dávid SadavaJulie Ahn Mei Zhan Mei-Lin PangJane DingSusan E. Kane

Abstraktný účel:Preskúmali sme farmakológiu, bunkovú biológiu a molekulárnu biológiu buniek malobunkového karcinómu pľúc liečených štyrmi extraktmiČínske bylinné lieky. Mnoho pacientov s rakovinou užíva tieto lieky, ale ich účinky na bunkovej úrovni sú do značnej miery neznáme. Zaujímali sme sa najmä o účinky na bunky odolné voči liekom, pretože rezistencia je významným klinickým problémomrakovina pľúcr. Metódy: Epitelové bunky citlivé na liečivo (H69), rezistentné voči viacerým liečivám (H69VP) a normálne bunky pľúcneho epitelu (BEAS-2) boli vystavené pôsobeniu extraktov z dvoch rastlín používaných v čínskej bylinnej medicíne.rakovina pľúc: Glycyrrhiza glabra (GLYC) a Olenandria difluusa (OLEN) a na extrakty z dvoch komerčne dostupných kombináciíČínske bylinné lieky, SPES (15 bylín) a PC-SPES (8 bylín). Cytotoxicita sa merala v zmysle inhibície bunkového rastu (IC50). Kinetika fragmentácie DNA po expozícii rastlinným extraktom sa merala pomocou značenia BudR a následne ELISA. Apoptóza sa merala testom TUNEL, po ktorom nasledovala prietoková cytometria. Expresia génov súvisiacich s apoptózou a bunkovým cyklom sa merala reverznou transkripciou mRNA, po ktorej nasledovala filtračná hybridizácia na polia sond a detekcia chemiluminiscenciou. Výsledky: V každom prípade boli štyri bylinné extrakty rovnako cytotoxické pre H69 a H69VP a menej cytotoxické pre BEAS-2. Všetky štyri extrakty vyvolali fragmentáciu DNA v bunkách karcinómu pľúc. Kinetika ukázala, že fragmenty DNA uvoľnené do média (indikácia nekrózy) v kultúrach exponovaných GLYC, ale vo vnútri buniek (indikácia apoptózy) v kultúrach exponovaných OLEN, SPES a PC-SPES. Analýza TUNEL potvrdila, že expozícia posledným trom extraktom, ale nie GLYC, viedla k apoptóze. V porovnaní s neošetrenými bunkami a bunkami ošetrenými GLYC, bunky H69 a H69VP ošetrené OLEN, SPES a PC-SPES vykazovali zvýšenú expresiu množstva génov zapojených do apoptickej kaskády, podobne ako bunky ošetrené etopozidom a vinkristínom.

Záver:TheČínska bylinná medicínaextrakty OLEN, SPES a PC-SPES sú cytotoxické voči liekom rezistentným aj voči liekom citlivýmrakovina pľúcbunky, vykazujúce určitú špecifickosť nádorových buniek v porovnaní s ich účinkom na normálne bunky, a sú proapoptotické, ako sa meria zlommi DNA a génovou expresiou. Reakcia nádorových buniek na tieto extrakty bola podobná ich reakcii na konvenčné chemoterapeutické liečivá.

Cistanche, vzácnyČínska bylinná medicína, má účinok na posilnenie imunity arakovina pľúc. Cistanche má dlhú históriu medicínskeho použitia. Prvýkrát to bolo zaznamenané v "Shen Nong's Materia Medica". Shennong ochutnal všetky druhy bylín. Účinnosť a úloha Cistanche je významná pri povzbudzovaní obličiek a výživnej esencii, zmierňovaní únavy, zvlhčovaní čriev a vyprázdňovaní, vyživovaní jangu a vyživovaní jinu atď., tak to bolo zaznamenané v knihe. Počas dynastie Tang bola Cistanche uvedená ako jeden z deviatich čínskych rozprávkových druhov trávy. Moderný výskum na ňom prebieha už viac ako 60 rokov. , Anti-aging, pomáha zlepšovať pamäť a imunitu atď.

Kľúčové slová:Rakovina pľúc, Odolnosť voči liekom,Čínske bylinné lieky,cistanche

Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com

Úvod

Malobunkovýrakovina pľúc(SCLC) predstavuje asi 20 percent všetkýchrakoviny pľúca je agresívny, s 5-ročnou mierou prežitia pri diagnóze menej ako 10 percent [19]. U pacientov sa bežne vyskytuje diseminované ochorenie, a preto je liečba chemoterapiou s kombináciami bežne zahŕňajúcimi cisplatinu, etoposid, doxorubicín, 5-fluóruracil a taxol [12]. Bohužiaľ, táto liečba sa nakoniec stane neúčinnou, pretože väčšina nádorov SCLC si vyvinie multirezistenciu [18]. Keďže existuje veľa mechanizmov rezistencie [15], prekonanie rezistencie je hlavnou klinickou výzvou.

Tvárou v tvár paliatívnej starostlivosti mnoho pacientov s rakovinou používa alternatívne lieky, vrátane bylinných terapií [6, 23]. Spomedzi týchto terapií je pravdepodobne najlepšie zavedená a kodifikovaná tradičná čínska medicína, ktorá sa datuje niekoľko tisíc rokov dozadu. Teoretický základ tohto medicínskeho systému sa týka protichodných síl jin a jang, generatívnych a deštruktívnych cyklov a životnej sily alebo qi [2]. Špecifické bylinné extrakty a kombinácie boli navrhnuté na liečbu špecifických chorôb vrátane rakoviny [11, 27]. Hoci existujú určité empirické dôkazy, že bylinky sú účinné pri liečbe rakoviny, ich mechanizmus účinku na bunkovej úrovni je do značnej miery neznámy. Toto naberá na dôležitosti, ak pacienti kombinujú svoje použitie s konvenčnou chemoterapiou. Neboli hlásené ani účinky bylinných extraktov na liekovú rezistenciu.

Skúmali sme účinky štyrochČínske bylinné liekyna troch bunkových líniách: SCLC, multirezistentný SCLC a normálny pľúcny epitel. Dva zo štyroch extraktov boli z jednotlivých rastlín často predpisovaných na rakovinu pľúc, Glycyrrhiza glabra (GLYC) a Olenandria diffusa (OLEN). Ďalšie dve boli z komerčne dostupných kombinácií bylín s názvom SPES a PC-SPES. OLEN (čínsky názov Bai Hua she cao) má protinádorové, antimutagénne a imunostimulačné účinky [1, 25, 29]. GLYC (čínsky názov gan car) je protizápalový, protinádorový a antimutagénny [7, 11]. SPES, vyvinutý spoločnosťou BotanicLabs (Brea, Kalifornia), je vo forme kapsúl obsahujúcich lyofilizované extrakty z 15 čínskych bylín a ukázalo sa, že znižuje bolesť u pacientov s pokročilými rakovinami [14]. Medzi bylinami v SPES patrí stimulant imunityCistanchedeserticola, protinádorové činidlo Rabdosia rubescens a protizápalové činidlo Zanthoxylum iridium [1, 11]. PC-SPES, tiež pripravený BotanicLabs, obsahuje osem bylín, vrátane antiandrogénnej Serenoa repens, ktorá inhibuje hyperpláziu prostaty [21], inhibítor proteínkinázy C Scutellaria baicalensis [13], protinádorovú látku Panax ginseng [30] a Glycyrrhiza glabra ( viď vyššie). Zatiaľ čo presné dôkazy o klinickej protinádorovej účinnosti GLYC, OLEN a SPES chýbajú, existujú určité dôkazy o účinnosti PC-SPES. V bunkách rakoviny prostaty aj na zvieracích modeloch je PC-SPES proapoptotický a cytotoxický [8, 9, 10, 28]. Klinické štúdie ukázali, že je účinný pri znižovaní hladín prostatického špecifického antigénu a pri zastavení rastu nádoru u androgén-dependentného aj androgén-nezávislého karcinómu prostaty [4, 5, 17, 20, 26].

Hoci pacienti s rakovinou nepochybne používajú rastlinné extrakty, existuje len málo predklinických alebo klinických údajov o účinkoch týchto extraktov na SCLC. Naším cieľom bolo začať túto analýzu skúmaním farmakológie (cytotoxicita), bunkovej biológie (metóda bunkovej smrti) a molekulárnej biológie (génová expresia) v bunkách SCLC citlivých na lieky a rezistentných na lieky.

Materiály a metódy

Výťažky a chemikálie

GLYC a OLEN boli získané ako sušené rastliny od Jen-On Medical Group (Monterey Park, Kalifornia). Na prípravu extraktu sa 0,5 g rozdrvilo na jemný prášok v trecej miske s tĺčikom a suspendovalo sa v 3 0 ml destilovanej vody. V čínskej medicíne sa výťažky z rastlín po zahriatí konzumujú ako čaje. Preto bola suspenzia inkubovaná za trepania pri teplote 70 stupňov počas 18 hodín. Po centrifugácii pri 1500 g počas 10 minút sa supernatant sterilizoval prefiltrovaním cez 0,{9}} lm filter pomocou injekčnej striekačky. Výsledný extrakt bol upravený destilovanou vodou na 17 mg/ml vzhľadom na pôvodný rastlinný materiál. Extrakty sa skladovali pri 4 stupňoch až 1 týždeň až do použitia.

SPES a PC-SPES boli získané od BotanicLabs (Brea, CA) ako kapsuly. Použitá extrakčná metóda bola použitá v predchádzajúcich štúdiách týchto prípravkov [8, 9, 10]. Obsah jednej kapsuly (320 mg) sa rozpustil v 1 ml 95 % etanolu a suspenzia sa inkubovala za trepania pri teplote 37 stupňov počas 1 hodiny. Po centrifugácii pri 3000 g počas 10 minút sa supernatant filtračne sterilizoval, ako je uvedené vyššie. Konečná koncentrácia bola 300 mg/ml, vztiahnuté na pôvodný rastlinný materiál. Extrakty sa skladovali pri -20 stupňoch až 1 týždeň až do použitia.

Bunkové kultúry a meranie cytotoxicity

Bunky NCI-H69 SCLC rástli pri 37 stupňoch v atmosfére obsahujúcej 5 percent C02 ako suspenzia v médiu bez séra AIM-V (Life Technologies, Grand Island, NY). Bunková línia rezistentná voči viacerým liečivám (H69VP) selektovaná v etoposide [16] bola tiež pestovaná v AIM-V a vykazovala skríženú rezistenciu voči etopozidu (9-násobne), doxorubicínu (20-násobne) a vinkristínu (10-násobok) (údaje nie sú zobrazené). Tieto bunky majú viacero mechanizmov liekovej rezistencie, vrátane zmien v topoizomeráze II a expresie membránových púmp, MDR1 a MRP. Normálne pľúcne epitelové bunky BEAS{16}} [22] sa pestovali v DMEM-F12 doplnenom 10 percentným fetálnym hovädzím sérom.

Na testovanie cytotoxicity sa pridali extrakty, ako je uvedené, k logaritmicky rastúcim bunkám v 1-ml kultúrach obsahujúcich 6000 buniek/ml. Po 4 dňoch nepretržitej expozície sa bunky spočítali v čítači Coulter Z-1. Počty boli potvrdené mikroskopicky hemocytometrom po farbení trypánovou modrou. Všetky experimenty sa uskutočnili trojmo a opakovali sa aspoň trikrát. Hodnoty IC50, definované ako koncentrácia extraktu, ktorý znížil počet buniek na 4. deň o 50 percent, sa vypočítali v porovnaní s kontrolami s rozpúšťadlom. Vypočítali sa priemerné hodnoty a porovnali sa pomocou ANOVA pre tri bunkové línie pre tento extrakt.

Testy bunkovej smrti

Mechanizmus cytotoxicity sa skúmal pomocou kinetiky fragmentácie bunkovej DNA (súprava Boehringer-Mannheim, Indianapolis, Ind.). Stručne, 5.105 buniek/ml sa inkubovalo 16 hodín pri 37 stupňoch v atmosfére obsahujúcej 5 percent C02 v médiu AIM-V obsahujúcom 10 1M BudR. Bunky sa premyli a resuspendovali v koncentrácii 105/ml v médiu bez BudR a 200 ul tejto kultúry sa inkubovalo s bylinným extraktom pri 2, IC50 počas uvedenej doby, potom sa 100 ul kultivačného média odstránilo na kvantifikáciu DNA. fragmenty pomocou ELISA. Toto je miera bunkovej nekrózy. Fragmenty DNA v bunkách, vytvorené apoptózou, sa merali po lýze buniek v bovinnom sérovom albumíne (BSA)/Tween 20 pri 21 stupňoch počas 30 minút. Po centrifugácii sa lyzát použil na ELISA.

ELISA sa uskutočnila na mikrotitračnej doštičke s okrúhlym dnom potiahnutej anti-DNA protilátkou (myšacia anti-ľudská DNA monoklonálna, klon MCA-33) cez noc pri 4 stupňoch. Po blokovaní pomocou BSA sa do potiahnutých jamiek pridalo 100 ul roztoku značeného fragmentu DNA a nasledovala inkubácia počas 90 minút pri 21 °C. DNA bola fixovaná a denaturovaná mikrovlnným ožiarením pri 500 W počas 5 minút. Pridala sa myšacia anti-BudR (myšia monoklonálna BMG 6HB) konjugovaná s peroxidázou a po inkubácii v tme počas 120 minút pri 21 stupňoch sa reakcia zastavila pridaním 500 ul koncentrovanej H2S04. Výsledná farba sa kvantifikovala absorbanciou pri 450 nm. Vzorky ošetrené extraktom sa porovnávali s neošetrenými kontrolami ako pozadie.

Apoptóza bola potvrdená analýzou TUNEL. Logaritmicky rastúce bunky boli vystavené bylinnému extraktu pri 1 · IC50 počas 3 hodín. Potom boli dvakrát premyté vo fosfátom pufrovanom fyziologickom roztoku (PBS) obsahujúcom 1 percento BSA a resuspendované v PBS/BSA pri 5,1 05 buniek/ml. K 500 ul buniek sa pridalo 100 ul 4% paraformaldehydu a bunky sa fixovali pri 21 stupňoch počas 1 hodiny. Po premytí v PBS boli bunky resuspendované v 100 ul studeného permeabilizačného pufra (0,1 percenta Triton X-100, 0,1 percenta citrátu sodného) počas 2 minút pri 4 stupňoch. Bunky sa dvakrát premyli v PBS a potom sa resuspendovali v 50 ul zmesi TUNEL obsahujúcej terminálnu deoxyribonukleotid-idyltransferázu (TdT) a fluoresceín-dUTP (súprava Boehringer-Mannheim). Po inkubácii v tme pri 37 stupňoch počas 1 hodiny boli bunky kontrastne zafarbené propídiumjodidom a analyzované prietokovou cytometriou.

Analýza génovej expresie

Kultúry (6 ml) logaritmicky rastúcich buniek (5,105 buniek/ml) sa inkubovali v médiu obsahujúcom bylinný extrakt pri 1,IC50 pri 37 stupňoch v atmosfére obsahujúcej 5 percent CO2 počas 3 hodín. Po dvojnásobnom premytí v PBS sa bunkové pelety zmrazili pri teplote -70 stupňov cez noc. RNA bola izolovaná protokolom RNeasy Mini (Qiagen, Valencia, CA). Vo všeobecnosti táto metóda poskytla 0,5 LG RNA. Toto množstvo RNA bolo reverzne transkribované do cDNA a značené biotínom-dUTP a hybridizované s denaturovanými sondami na gény súvisiace s apoptózou a bunkovým cyklom na filtroch. Hybridizácia sa detegovala naviazaním alkalickej fosfatázy-streptavidínu na cDNA pomocou chemiluminiscenčného substrátu CDP-Star (SuperArray, Bethesda, MD), po čom nasledovalo vystavenie röntgenovému filmu, zvyčajne na 1–2 minúty.

Ciele kontrolného génu na každom filtri zahŕňali b-aktín a GAP-DH ako pozitívne kontroly a pUC18 ako negatívnu kontrolu. Hybridizačnými cieľmi boli nasledujúce gény súvisiace s bunkovým cyklom a apoptózou: bad, bcl-2, BCL-w, BCL-x, kaspázy 1–10, c-myc, E2F, fas, fas ligand, gadd45, iNOS , mdm2, NFkB, p21Waf1, p53, pig7, pig8, Rb, DR5, trail, Casper, CRADD, DAXX, IAP-1, IAP-2, NIK, TNFR2, TRAF2, TRAF3, TRAF5 a DR5. IntenzitaHybridizácia bola hodnotená vizuálne v tandemových duplikátnych škvrnách na filtri vo vzťahu k pozitívnym kontrolám.

Výsledky

Naše počiatočné experimenty testovali cytotoxicitu extraktov z čínskych bylín na bunkách SCLC citlivých na lieky a rezistentných na lieky, ako aj na normálnych bunkách pľúcneho epitelu. Ako je uvedené v tabuľke 1, štyri bylinné extrakty boli cytotoxické pri nízkych koncentráciách. Tieto zistenia sú podobné tým, ktoré sa našli pre SPES a PC-SPES v iných nádorových bunkových líniách [8]. V každom prípade sa hodnoty IC50 pre bunky odolné voči viacerým liečivám (H69VP) nelíšili od hodnôt pre bunky citlivé na liečivo (H69). Hodnoty IC50 pre normálne pľúcne epitelové bunky boli tiež výrazne vyššie ako hodnoty pre nádorové bunkové línie.

Potom sme skúmali mechanizmus cytotoxicity pomocou kinetiky fragmentácie DNA ako indikácie apoptózy (fragmenty sa pomaly tvoria v bunkách) alebo nekrózy (fragmenty sa rýchlo tvoria a uvoľňujú z poškodených buniek). Bunky sa inkubovali v bylinnom extrakte počas 30 minút až 8 hodín a potom sa fragmenty DNA odhadli pomocou ELISA v kultivačnom médiu aj v bunkových lyzátoch. Obrázok 1 ukazuje reprezentatívne údaje pre bunky H69 vystavené štyrom extraktom počas 90 minút. Pri troch extraktoch (SPES, PC-SPES, OLEN) väčšina fragmentov DNA pochádzala z buniek (lyzáty), čo naznačuje apoptózu. Avšak s GLYC boli fragmenty uvoľnené do média z poškodených buniek, čo naznačuje nekrózu. Podobné výsledky sa získali s bunkami H69VP (údaje nie sú uvedené).

Po týchto experimentoch cytotoxicity nasledovali TUNEL testy zlomov DNA in situ. V porovnaní s neošetrenými kontrolami (1–3 percentá apoptotických buniek v štyroch experimentoch), bunky SCLC ošetrené SPES (58–85 percent), PC-SPES (63–77 percent) a OLEN (49–81 percent) vykazovali TUNEL pozitivitu, zatiaľ čo bunky ošetrené GLYC nie (1–2 percentá) (obr. 2). Podobné výsledky sa získali s bunkami H69VP (údaje nie sú uvedené).

Analyzovali sme génovú transkripciu v reakcii na bylinné extrakty pomocou GeneArrays. Tieto polia majú tandemovo usporiadané gény súvisiace s bunkovým cyklom a apoptózou. Tieto experimenty sme vykonali dvakrát s podobnými výsledkami. Obrázok 3 ukazuje reprezentatívne diagramy arrayautora buniek H69 vystavených etopozidu alebo SPES. Naše výsledky pre bunky H69 sú zhrnuté v tabuľke 2. Zatiaľ čo neošetrené kontroly mali detegovateľnú expresiu len niekoľkých skúmaných génov, bunky ošetrené konvenčnými chemoterapeutickými liekmi (etoposid a vinkristín) vykazovali silné signály pre množstvo génov zapojených do bunkového cyklu. regulácia a apoptóza. Bunky ošetrené OLEN, SPES a PC-SPES vykazovali vzor podobný tým, ktoré sa získali s týmito dvoma liekmi. Vo všeobecnosti sa nezdalo, že by bunky ošetrené GLYC vykazovali tento transkripčný vzor a namiesto toho vykazovali silnú expresiu antiapoptózového génu, BCL-2.

Diskusia

Tieto štúdie sme vykonali z dvoch dôvodov. Po prvé, existuje starodávna tradícia čínskej bylinnej medicíny, ktorá je založená na jej vlastných teóriách a filozofii [2] a my sme chceli začať chápať v západných lekárskych pojmoch účinky bylinných liečiv. Tieto byliny sa používajú ako zmesi, a hoci sa dosiahol určitý pokrok v ich rozdeľovaní na jednotlivé chemické zložky[11], naše štúdie sa zamerali na ne, keďže sa používajú v tradičnej praxi. Našou druhou motiváciou bolo, že mnoho pacientov s rakovinou používa tieto bylinky spolu s konvenčnou liečbou [6, 23] a pochopenie bunkových účinkov bylín by mohlo poskytnúť dôležité informácie pre klinické rozhodovanie.

Údaje o cytotoxicite (tabuľka 1) ukázali, že štyri bylinné extrakty boli skutočne cytotoxické pre nádorové bunky, viac na základe dávkovania ako pre normálne bunky pľúcneho epitelu, čo naznačuje určitú nádorovú špecifickosť a možno aj priaznivý terapeutický index. Podobnosti v IC50 medzi bunkami citlivými na liečivo a bunkami odolnými voči viacerým liečivám naznačujú, že tieto extrakty nie sú ovplyvnené mechanizmami rezistencie voči liečivám zobrazeným v bunkách H69VP, vrátane nadmernej expresie dvoch transportérov liečiv, MDR1 a MRP.

Kinetika fragmentácie DNA ukázala, že extrakty SPES, PC-SPES a OLEN boli proapoptotické, zatiaľ čo GLYC bol náchylný na erotiku (obr. 1). Toto bolo potvrdené farbením TUNEL in situ (obr. 2). Väčšina konvenčných chemoterapeutických liekov je proapoptotická [3] a skupina apoptotických génov a regulačných génov bunkového cyklu je v bunkách v reakcii na lieky upregulovaná [24]. Zistili sme, že vzor expresie niektorých génov exprimovaných v reakcii na tri profesionálne aplikácie na bylinné extrakty bol podobný vzoru pozorovanému v týchto bunkách po expozícii konvenčným chemoterapeutickým liekom (obr. 3, tabuľka 2). Reakcia na samotný GLYC sa zdala byť odlišná, aspoň v časovom bode analyzovanom v týchto experimentoch. Je zaujímavé, že GLYC je súčasťou PC SPES, ktorý bol proapoptotický, zatiaľ čo samotný GLYC nebol. Možno sú za jeho proapoptotickú aktivitu zodpovedné iné zložky PC-SPES. Aj keď tieto výsledky neukazujú, ako bylinné extrakty poškodzujú bunky, naznačujú, že bunky H69 reagujú na poškodenie na molekulárnej (transkripcia) a bunkovej (apoptóza) úrovni podobným spôsobom ako ich odpoveď na chemoterapiu.

Naše štúdie naznačujú potenciálnu užitočnosť týchto čínskych bylinných extraktov pri liečbe SCLC, najmä choroby rezistentnej na lieky.

PoďakovanieĎakujeme L. Brownovi za neoceniteľnú pomoc pri cytometrii a R. Lingemanovi za pomoc s protokolmi molekulárnej biológie. Bunky BEAS-2 veľkoryso dodal Dr. I. Laird-Offringa z University of Southern California, Norris Cancer Center. SPES a PC-SPES boli darom od Dr. S. Chena z New York Medical College. Tento výskum podporili Pritzker Family Foundation a WM KeckFoundation.

Cistanche ako čínsky bylinný liek môže zlepšiť imunitu a bojovať proti rakovine, kliknite sem a dozviete sa viac

Referencie

1. Boik J (1996) Rakovina a naturálna medicína: učebnica základnej vedy a klinického výskumu. Oregon Medical Press, Princeton, s. 221

2. Chan K (1995) Pokrok v tradičnej čínskej medicíne. Trends Pharmacol Sci 16:182-187

3. Chu E, DeVita V Jr (2001) Princípy manažmentu rakoviny: chemoterapia. In: DeVita V Jr, Hellman S, Rosenberg SA (eds) Rakovina: princípy a praktiky onkológie. Lippincott Williams a Wilkins, Philadelphia, s. 289–306

4. De la Taille A, Hayek OR, Buttyan R, Bagiella E, Burchart M, Katz AE (1999) Účinky fytoterapeutického činidla, PC-SPES, na rakovinu prostaty. BJU Int 84:845–850

5. DiPaola RS, Zhang H, Lambert G, Meeker R, Licitra E, Rafi M, Spaulding H, Goodin S, Toledano M, Gallo M (1998) Klinická a biologická aktivita estrogénovej bylinnej kombinácie (PC-SPES) v prostate rakovina. New Engl J Med 339:785–791

6. Eisenberg DM, Davis RB, Ettner SL (1998) Trendy v používaní alternatívnej medicíny v USA: 1990–1997: výsledky následného národného prieskumu. JAMA 280:1569–1575

7. Fenwick GR, Lutomski J, Nieman C (1990) Glycyrrhiza glabra: zloženie, použitie a analýza. Food Chem 38:119-143

8. Halicka HD, Ardelt B, Juan G, Mittleman A, Chen S, Traganos F, Darzynkiewicz Z (1997) Účinky apoptózy a bunkového cyklu vyvolané extraktmi z čínskeho bylinného prípravku PC-SPES. Int J Oncol 11:437-448

9. Hsieh T, Chen SS, Wang X, Wu J (1997) Regulácia expresie androgénneho receptora a prostatického špecifického antigénu v androgén-responzívnych ľudských prostatických LNCaPbunkách pomocou etanolových extraktov z čínskeho bylinného prípravku PC-SPES. Biochem Mol Biol Int 42:535-544

10. Hsieh T, Ng C, Chang, C, Chen SS, Mittleman, A, Wu J (1998) Indukcia apoptózy a down-regulácia BCL-6 v bunkách Mutu ošetrených etanolovými extraktmi čínskeho bylinného doplnku PC-SPES. Int J Oncol 13:1199-1202

11. Huang KC (1999) Farmakológia čínskych bylín, 2^ndedn. CRC Press, Boca Raton

12. Kalemkerian GP, ​​Worden FP (2000) Terapeutické pokroky v SCLC. Expert Opin Invest Drugs 9:65–79

13. Kimura Y, Okuda H, Yokio K, Matsushita N (1997) Účinky baicaleínu izolovaného zo Scutellaria baicalensis na produkciu tkanivového aktivátora plazminogénu indukovaného interleukínom 1b a TNF a inhibítora aktivátora plazminogénu -1 v kultivovaných endotelových bunkách pupočníkovej žily . Phytother Res 11:363–367

14. Lin C (1996) Pozorovanie o kombinovanom použití chemoterapie a tradičnej čínskej medicíny na zmiernenie bolesti pri rakovine. J Tradit Chin Med 16:267–269

15. Mattern J, Volm M (1995) Mechanizmy rezistencie u ľudskej rakoviny pľúc. Invázne metastázy 15:81–94

16. Minato K, Kanzawa F, Nishio K, Nakagawa K, Fujiwara Y, Saijo N (1990) Charakterizácia etopozid-rezistentnej ľudskej malobunkovej rakoviny pľúc. Cancer Chemother Pharmacol 26:313-327

17. Moyad MA, Pienta KJ, Montie JE (1999) Použitie PC-SPES, komerčne dostupného doplnku na liečbu rakoviny prostaty, u pacienta s hormonálne naivnou chorobou. Urológia 54:319–324

18. Nishio K, Nakamura T, Koh Y, Suzuki H, Fukumoto N, Saijo N (1999) Drug resistance in lung cancer. Curr Opin Oncol 11:109–115

19. Pass H, Mitchell JB, Johnson DH, Turrisi AT, Minna J (2000) Rakovina pľúc: princípy a prax. Lippincott, Philadelphia

20. Pfeifer BL, Pirani JF, Hamann SR, Klippel KF (2000) PC SPES: doplnok stravy na liečbu rakoviny prostaty odolnej voči hormónom. BJU Int 85:481–485