Účinky Glyeosides Of Cistanche na učenie kognície a synaptickú plasticitu u modelových potkanov s nedostatkom spánku

ABSTRAKT

Cieľ: „Preskúmať, čiglykozidy cistanchemôže zlepšiťučenie a kognitívna funkcia nedostatku spánkumodel potkanov odregulácia synaptickej plasticity. Metódy: Päťdesiat samcov potkanov Wistar bolo náhodne rozdelených do slepej kontrolnej skupiny (kontrola), kontrolnej skupiny platformy (PC), modelovej skupiny (model),glykozidy skupiny cistanche(GCs) a estazolamová skupina (Est). Model spánkovej deprivácie potkanov bol pripravený modifikovanou multiplatformovou metódou vodného prostredia. Morrisovo vodné bludisko a test na otvorenom poli sa použili na detekciu potkanovpriestorová kognitívna funkcia aa emocionálne zmeny. Farbenie Nissl sa použilo na pozorovanie zmien vmorfológia a množstvo nervových buniekv hipokampálnej CAl oblasti potkanov. Western blot a R'T-PCl sa použili na detekciu hladín expresie synaptofyzínu (SYN), substancie 95 s hustotou postsynaptickej membrány (PSD - 95) a neurotrofického faktora odvodeného z mozgu (BDNF). Výsledky: Výsledky Morrisovho vodného bludiska ukázali, že v porovnaní s kontrolnou skupinou,učenie a kognitívne schopnostipočet potkanov v modelovej skupine sa výrazne znížil (P<0. 05 ), and thefunkcia učenia a pamäte potkanovbola zlepšená liečba GC (P<0. 05). The results of the open field test showed that compared with the Control group, the movement distance and standing times of the Model group were significantly increased ( P <0. 05 ), the resting time was significantly shortened( P <0.05), and the anxiety was increased, while after GCs treatment, the movement distance and standing times decreased ( P <0. 05), the resting time increased ( P<0. 05), and the anxiety was improved. The results of Western blot and R'T' - PCR showed that the protein and gene expression levels of BDNF, SYN, and PSD -95 in the Model group were significantly decreased ( P <0. 05), while after treatment with GCs, the expression levels of BDNF, SYN and PSD -95 were significantly up-regulated ( P <0.05).

Záver: Glykozidy cistanchemôže ovplyvniť synaptickú plasticitu reguláciou expresie synaptických markerov, čím sa zlepší učenie a kognitívna funkcia modelových potkanov s depriváciou spánku.

KĽÚČOVÉ SLOVÁGlykozidy cistanche; hippocampus; Nedostatok spánku; Učenie a pamäť; úzkosť; Synaptická plasticita

PREDÁM VYSOKOÚROVNE GLYKOZIDY CISTANCHE

Porucha spánku (SD)je afunkčná porucha spánkuspôsobené sériou zložitých faktorov, ako je nespavosť, časté sny a ľahké prebudenie. Výskyt SD sa v posledných rokoch postupne zvyšuje. Súvisiace štúdie uvádzajú, že SD môže spôsobiťkardiovaskulárnych ochorení, metabolická dysfunkcia, imunitné ochoreniaa degeneratívne ochorenia centrálneho nervového systému, ako je Alzheimerova choroba [1]. SD môže spôsobiť oxidačné poškodenie hipokampálnych neurónov, spôsobiť kognitívnu dysfunkciu a spôsobiť zmeny nálady, ako je úzkosť a depresia [2]. Cistanche deserticola je vzácny čínsky liečivý materiál, ktorý možno použiť ako liek a potravinu. Má účinky na tonizáciu obličiek a dopĺňanie qi, zvlhčuje črevá podporujúce pohyby čriev a posilňuje jang. Hlavný extrakt z Cistanche deserticola, glykozidy cistanche (GC), má antioxidačné, antiapoptotické, pečeňové a neuroprotektívne účinky [3]. Náš predchádzajúci výskum zistil, že GC môžu zlepšiť učenie a kognitívne funkcie myší SAMP8 tým, že hrajú antioxidačnú a antiapoptotickú úlohu [4]. Súvisiace štúdie ukázali, že kognitívna dysfunkcia spôsobená SD úzko súvisí so synaptickou plasticitou [5]. Existuje však málo správ o mechanizme, ktorým GC regulujú synaptickú plasticitu a zlepšujú poškodenie učenia a pamäti a kognitívny pokles u potkanov vyvolaný depriváciou spánku. Cieľom tejto štúdie je preto preskúmať, či GC ovplyvňujú synaptickú plasticitu reguláciou expresie synaptických markerov, čím zlepšujú učenie a kognitívne funkcie potkanov v modeli spánkovej deprivácie a poskytujú nové liečebné nápady a plány na liečbu učenia a kognitívne poruchy spôsobené poruchami spánku s GC.

1 Materiály a metódy

1. 1 Pokusné zvieratá

Samce potkanov Wistar vo veku 6 až 8 týždňov s hmotnosťou 280 až 300 g boli zakúpené od Pekingu Sibeifu s licenciou na živočíšnu výrobu [SCXK (Peking) 2019-0010]. Všetky zvieratá boli chované v Animal Experiment Center of Baotou Medical College za nasledujúcich podmienok: teplota (24 ± 1) stupeň, vlhkosť 50 % až 55 %, 12 hodín svetlo a 12 hodín tma a žiadne obmedzenia týkajúce sa potravy a vody. Tento experiment schválila školská etická komisia [Baoyi Lunshen 2022 č. (63)].

1. 2 Hlavné činidlá a prístroje

Celkové glykozidy Cistanche deserticola boli zakúpené od Shaanxi Baoji Cosmeceuticals Development Co., Ltd. (číslo šarže: KSM20220609011); Estazolamové tablety boli zakúpené od CSPC Pharmaceutical Group Ouyi Pharmaceutical (číslo šarže: 044220343); proteínový nanášací pufor (P1015), RIPA lýzový pufor (R0010), chemiluminiscenčný roztok (PE0010) atď. boli zakúpené od Beijing Solebao; protilátka postsynaptic density substance 95 (PSD{6}}) (AB192757), protilátka synaptofyzín (SYN) (ab32127), zakúpená od Abcam, USA; neurotrofický faktor odvodený od mozgu (BDNF) (48503-2), -aktín (52901), zakúpený od SAB, USA; kozia anti-králičia IgG sekundárna protilátka (SA00001-20), zakúpená od Proteintech, USA; potkaní melatonín (MT), súprava ELISA (MM-0657R1), zakúpená od Jiangsu Enzyme Immunity Industry Co., Ltd. Parafínový krájač (Leica, Nemecko); optický mikroskop (Leica, Nemecko); Morrisov vodný labyrint, testovací box v otvorenom poli (Shanghai Xinruan); prístroj na vertikálnu elektroforézu

(spoločnosť Peking Liuyi); odfarbovacia trepačka (Beijing Liuyi Company); proteínový zobrazovací analytický systém (Shanghai Tanon Technology); fluorescenčný kvantitatívny PCR prístroj (Xi'an Tianlong Technology Co., Ltd.).

1. 3 Experimentálne metódy

1. 3. 1 Zoskupovanie zvierat a podávanie liečiv

50 samcov potkanov Wistar bolo náhodne rozdelených do slepej kontrolnej skupiny (kontrolná skupina), kontrolnej skupiny platformy (kontrola na platforme, skupina PC), modelovej skupiny (skupina modelov), celkových glykozidov skupiny Cistanche deserticola (skupina GCs 50 mg/kg) a skupina estazola (skupina Est, 0,54 mg/kg), pričom v každej skupine bolo 10 potkanov. Kontrolnej skupine a skupine PC bol podávaný 0,9 % fyziologický roztok žalúdočnou sondou. Všetky skupiny dostali sondu každý deň o 7:00 ráno po začatí modelovania a sonda trvala 21 dní.

1. 3. 2. Príprava zvieracieho modelu s depriváciou spánku

Model spánkovej deprivácie bol vytvorený pomocou modifikovanej metódy vodného prostredia s viacerými platformami [6]. Experimentálnym zariadením bola obdĺžniková nádrž na vodu z polyetylénovej živice s rozmermi 130 cm × 50 cm × 45 cm. Do vodnej nádrže bola umiestnená malá plošina s priemerom 5 cm a výškou 20 cm. Plošina PC skupiny mala priemer 10 cm a výšku 20 cm. Nádrž na vodu sa naplnila vodou do hĺbky asi 18 cm a teplota vody sa udržiavala na (20 ± 1) stupni. Týždeň pred začiatkom experimentu boli potkany umiestnené každý deň do boxu na depriváciu spánku na 60 minút, aby sa zoznámili s prostredím. Po vytvorení modelu, s výnimkou kontrolnej skupiny, boli potkany každej skupiny umiestnené na malú plošinu v čase od 8:00 do 20:00 každý deň kvôli nedostatku spánku počas 21 po sebe nasledujúcich dní. Všetkým potkanom sa umožnilo voľne jesť a piť a voľne sa pohybovať po plošine s 12 hodinami striedania svetla a tmy každý deň.

1.3.3 Experiment s Morrisovým vodným bludiskom

Morrisovo vodné bludisko bolo rozdelené na 4 oblasti, naplnené vodou a platforma bola umiestnená v 4. kvadrante. Vodná plocha bola asi 2 cm nad plošinou. Do vody sa pridal potravinársky jedlý melanín a teplota vody sa udržiavala na (25 ± 1) stupni. (1) Experiment s polohovaním: Vybral sa stred každej oblasti a potkany sa jemne umiestnili do vody. Bolo im dovolené voľne skúmať. Zaznamenal sa čas, ktorý potkanom trvalo nájsť cieľovú platformu do 60 sekúnd. Potkany, ktoré nenašli plošinu, boli navedené na plošinu a zostali tam 20 sekúnd. Školenie pokračovalo 5 dní. (2) Test priestorového prieskumu: Na 6. deň sa plošina odstránila a potkany sa umiestnili do vody zo stredu 2. kvadrantu oproti stene. Zaznamenal sa počet, koľkokrát potkany prešli platformou v priebehu 120 s a čas, keď zostali v 4. kvadrante.

1.3. 4 Experiment v otvorenom poli

Použila sa experimentálna krabica s rozmermi 100 cm × 100 cm × 50 cm a dno krabice bolo rozdelené na 9 mriežok. Každá skupina potkanov bola vopred umiestnená do experimentálnej miestnosti na otvorenom poli, aby sa adaptovala na vnútorné prostredie na 60 minút. Na začiatku experimentu boli testované potkany postupne umiestnené do pevných rohov otvoreného experimentálneho boxu a pomocou softvéru na analýzu správania sa zaznamenal počet státí, vzdialenosť pohybu a statický čas potkanov v priebehu 5 minút. . Počas experimentu sa vyžadovalo, aby bolo prostredie tiché a experimentálne zariadenie sa medzi dvoma experimentmi utrelo čistou vodou a alkoholom, aby sa zabránilo tomu, že pach predchádzajúceho potkana ovplyvní úsudok o správaní ďalšieho potkana.

1. 3. 5 Enzymovo viazaný imunosorbentový test (ELISA)

Detekcia hladín MT v sére u potkanov Potkany sa anestetizovali intraperitoneálnou injekciou a z brušnej aorty sa odobralo 5 ml krvi. Po 30 minútach čakania pri teplote miestnosti bola krv centrifugovaná, aby sa získalo sérum. Do každej jamky sa pridalo 40 μl riedidla vzorky a potom sa pridalo 10 μl vzorky, ktorá sa mala testovať. Po uzavretí tesniacou fóliou inkubujte pri 37 stupňoch 30 minút. Premyte 5-krát, pridajte 50 μl roztoku na značenie enzýmov a po uzavretí tesniacou fóliou inkubujte pri 37 stupňoch 30 minút. Premyte 5-krát, potom postupne pridajte roztok vyvolávajúci farbu a roztok na zastavenie reakcie. Hodnota OD každej jamky sa merala prístrojom na značenie enzýmov pri vlnovej dĺžke 450 nm.

１. ３. ６ Farbenie Nissl

Z každej skupiny sa odobrali tri potkany a mozgové tkanivo sa odstránilo dekapitáciou. Mozgové tkanivo sa fixovalo 4% roztokom polymetylmetakrylátu a tkanivo sa dehydratovalo, ponorilo do voskového roztoku a zalialo a tkanivo sa narezalo bežnými metódami. Plátky boli udržiavané s hrúbkou 5 μm, opláchnuté PBS, zafarbené 0. 1 % toluidínová modrá pre 0. 5 h, diferencované 95% alkoholom, dehydratované 100% alkoholom, transparentné xylénom a utesnené neutrálnou gumou. Zmeny v morfológii a počte neurónov v oblasti CA1 potkanieho hipokampu sa pozorovali pod mikroskopom a zozbierali sa obrázky.

１. ３. 7 Experiment Western blot

Z každej skupiny sa vybrali štyri potkany a hipokampus sa izoloval dekapitáciou. Tkanivo hipokampu sa zmiešalo s RIP A lyzačným pufrom v prostredí ľadového kúpeľa a centrifugovalo sa, aby sa získal supernatant. Koncentrácia proteínu bola detekovaná metódou BCA. 20 ug proteínu sa pridalo s proteínovým nanášacím pufrom na elektroforézu. Po dokončení elektroforézy proteínov sa membrána preniesla pri konštantnom prietoku 300 mA, blokovala sa 5% práškovým odstredeným mliekom, primárna protilátka sa inkubovala pri 4 stupňoch cez noc a sekundárna protilátka sa inkubovala pri teplote miestnosti počas 2 hodín. Po použití roztoku na vývoj farby sa na štatistickú analýzu proteínových pásov použil systém chemiluminiscenčnej zobrazovacej analýzy.

1. 3. 8 experiment RT-PCR

Z každej skupiny sa vybrali tri potkany, aby sa pripravil homogenát tkaniva hipokampu. Celková RNA v tkanivovej tekutine sa extrahovala metódou Trizol a merala sa koncentrácia. Súprava na syntézu cDNA nalačno sa použila na reverznú transkripciu a fluorescenčná kvantitatívna amplifikačná reakcia sa použila na detekciu relatívnej hladiny expresie mRNA synaptického proteínu pomocou fluorescenčnej kvantitatívnej súpravy. Výsledky sa analyzovali s použitím 2-AACt a sekvencie primérov sú uvedené v tabuľke 1.

1.4 Štatistické metódy

Výsledky údajov, ktoré zodpovedali normálnej distribúcii, boli vyjadrené ako priemer ± štandardná odchýlka (x ± s) a štatistická analýza sa uskutočnila pomocou softvéru GraphPad Prism 9.5. Na porovnanie medzi viacerými vzorkami sa použila jednofaktorová analýza rozptylu a P < 0,05 indikovala, že rozdiel bol štatisticky významný.