Elastáza a exacerbácia prirodzenej imunity neutrofilov sa podieľajú na multiviscerálnych prejavoch COVID-19

Abstraktné

Pozadie:

Mnohé argumenty naznačujú, že neutrofily by mohli zohrávať významnú úlohu pri COVID-19. Úloha kľúčových zložiek vrodenej imunity neutrofilov pri ťažkých formách COVID-19 si však nezaslúžila dostatočnú pozornosť. Zamerali sme sa na vyhodnotenie zapojenia neutrofilnej elastázy, histónovej DNA a DNáz v systémových a multiorgánových prejavoch COVID-19.

Počet a aktivita neutrofilov sú dôležité ukazovatele odzrkadľujúce imunitný stav organizmu. Keď je telo stimulované infekciou alebo zápalom, neutrofily sa rýchlo zvýšia a dostanú sa do poškodeného tkaniva alebo zápalového miesta, pričom sa uvoľní dostatok enzýmov a bielkovín na odstránenie škodlivých látok. Táto schopnosť rýchlej reakcie robí neutrofily dôležitou súčasťou imunitnej obrany tela. Súčasne sa neutrofily podieľajú aj na procese imunitnej regulácie. Dokážu spolupracovať s inými imunitnými bunkami pri regulácii imunitnej odpovede organizmu a udržiavaní rovnováhy imunitného systému. Pri niektorých chorobných stavoch, ako sú autoimunitné ochorenia, alergické reakcie atď., abnormálne zvýšenie alebo aktivita neutrofilov negatívne ovplyvní imunitný systém tela, čo spôsobí zbytočné zápalové reakcie a poškodenie tkaniva. V každodennom živote musíme dbať aj na svoju imunitu. Cistanche môže posilniť našu imunitu v každodennom živote. Polysacharidy v mäse môžu regulovať imunitnú odpoveď ľudského imunitného systému a zvyšovať stres imunitných buniek. Schopnosť zvýšiť baktericídny účinok imunitných buniek.

Kliknite na zdravotné prínosy cistanche

Metódy:

Uskutočnili sme multicentrickú štúdiu markerov vrodenej imunity neutrofilov v 155 prípadoch postupne prijatých do skríningového centra, miestnych nemocníc a dvoch regionálnych univerzitných nemocníc. Prípady boli hodnotené podľa klinických a biologických markerov závažnosti a multiorgánových prejavov a porovnané s 35 zdravými kontrolami.

Výsledky:

Krvná neutrofilná elastáza, histón-DNA, myeloperoxidáza-DNA a voľná dsDNA sa dramaticky zvýšili a aktivita DNázy sa znížila 10--krát v porovnaní s kontrolami. Neutrofilná elastáza a histónová DNA boli spojené s prijatím na intenzívnu starostlivosť, telesnou teplotou, poškodením pľúc, markermi kardiovaskulárnych výsledkov, zlyhaním obličiek a zvýšeným množstvom interleukínu-6 (IL-6), IL-8 a CXCR2. Neutrofilná elastáza bola nezávislým prediktorom skóre počítačovej tomografie poškodenia pľúc COVID{8}} a počtu postihnutých orgánov v multivariačných analýzach. Zvýšené koncentrácie NE a extracelulárnych pascí neutrofilov v krvi súviseli s exacerbáciou stimulácie neutrofilov prostredníctvom zvýšených koncentrácií IL-8 a CXCR2 a zvýšených sérových DAMP a so zhoršenou degradáciou NET v dôsledku dramatického poklesu DNázy v krvi činnosť.

Záver:

Naše výsledky poukazujú na kľúčovú úlohu exacerbácie neutrofilnej vrodenej imunity pri COVID-19. Neutrofilná elastáza a DNáza by mohli byť potenciálnymi biomarkermi a terapeutickými cieľmi pre závažné systémové prejavy COVID-19.

GRAFICKÝ ABSTRAKT

Hladiny neutrofilnej elastázy a histónovej DNA v krvi sú spojené so závažnými a systémovými a multiorgánovými prejavmi COVID-19. Zvýšené koncentrácie neutrofilnej elastázy a neutrofilných extracelulárnych pascí v krvi súvisia s exacerbáciou neutrofilnej stimulácie prostredníctvom aktivovanej dráhy IL-8/CXCR2. Neutrofilná elastáza a DNáza by mohli byť potenciálnymi biomarkermi a terapeutickými cieľmi pre závažné systémové prejavy COVID-19.

1|ÚVOD

Coronavirus disease 2019 (COVID{1}}) spôsobuje tromboembolické príhody a multiorgánové prejavy vrátane srdca, pečene a obličiek.1,2 Čiastočne sú výsledkom nadmerného zapojenia vrodenej imunity3 a cytokínovej búrky produkovanej lymfocytmi a aktivácia makrofágov.4–6 Argumenty naznačujú, že neutrofily zohrávajú významnú úlohu aj pri ťažkých a život ohrozujúcich formách ochorenia.6–9 Účasť neutrofilov na systémových a multiorgánových dôsledkoch COVID-19 si zaslúžil nedostatočnú pozornosť.8

Neutrofily majú arzenál obranných stratégií, ktoré zahŕňajú uvoľňovanie antimikrobiálnych granúl a neutrofilnej elastázy (NE) a tvorbu neutrofilných extracelulárnych pascí (NET).6,8 NET sú histónové-DNA zložky umierajúcich neutrofilov zapojených do obrany hostiteľa proti patogény.6,8 Štúdia uvádza, že dva markery NET, bezbunková DNA a myeloperoxidáza (MPO)-DNA, boli zvýšené u hospitalizovaných pacientov s COVID-19 v porovnaní s 30 kontrolami a korelovali s C-reaktívnym proteínom, D-dimér, laktátdehydrogenáza a absolútny počet neutrofilov.9

Ďalšia štúdia z našej skupiny ukázala, že hladina MPO-DNA je zvýšená vo včasnej fáze infekcie koronavírusom 2 (SARS-CoV-2) závažného akútneho respiračného syndrómu v ambulantných prípadoch.10 Homeostáza cirkulujúcich NET závisí od NE a DNáza 1 a DNáza 11L3.6 Nadmerné NE a NET v krvi spôsobujú vaskulárne a tkanivové lézie pri akútnej vírusovej pneumónii, ktoré sa podobajú tým, ktoré sa pozorovali pri infekcii COVID-19.6,11,12 Napriek týmto dôkazom, či už NE, DNázy a histónová DNA sa podieľajú na multiviscerálnych prejavoch COVID{15}} doteraz nebola vyhodnotená.

Táto štúdia je prvou, ktorá študovala NE, celkovú aktivitu DNázy a histónovú DNA v prípadoch COVID{1}} prijatých v skríningových centrách, miestnych nemocniciach a regionálnych nemocniciach s cieľom vyhodnotiť ich podľa závažnosti ochorenia a multiorgánového prejavov. Zistili sme, že NE bol nezávislým prediktorom poškodenia viacerých orgánov spôsobeného COVID-19. Uvoľňovanie NE a NET súviselo s aktiváciou neutrofilov prostredníctvom molekulárnych vzorov spojených s poškodením séra (DAMP) a dráhy IL-8/CXCR2.

2|MATERIÁLY A METÓDY

2,1|Nábor pacientov a klinické charakteristiky študovanej populácie

Štúdiu NICO (Neutrofilná innate Immunity in COvid-19) zaregistrovala Institutional Review Board of Clinical Research (DRCI) Univerzitnej nemocnice v Nancy (č. 2020PI087) a schválila ju Etická komisia. Uskutočnili sme prierezovú následnú štúdiu so 155 pozitívnymi pacientmi prijatými po informovanom súhlase do skríningového centra, miestnych nemocníc a oddelení medicíny a jednotiek intenzívnej starostlivosti dvoch univerzitných nemocničných centier v období najvyššej pandémie COVID-19 v r. Francúzsko. Pri oznamovaní klinických a biologických údajov a používaní biologických vzoriek sme postupovali podľa smerníc EQUATOR a BRISQ. Infekcia bola charakterizovaná pomocou RT-PCR na vzorkách nazálnych výterov. 34 po sebe idúcich ambulantných subjektov navštevovalo skríningové centrum v prvom týždni choroby, ako už bolo opísané.10 Prijali sme ďalších 121 pacientov hospitalizovaných pre COVID{10}} v lekárskych oddeleniach miestnych nemocníc v regióne Tours (n { {11}}) a Regionálne univerzitné nemocnice v Marseille a Nancy (n=78).

Z nich 13 ošetrili na jednotkách intenzívnej starostlivosti. Medián oneskorenia medzi nástupom symptómov a odberom krvi bol 7 dní (IQR: 4–13) na lekárskych oddeleniach a 13 dní (IQR: 4–14) na jednotkách intenzívnej starostlivosti. Uviedli sme klinické charakteristiky a výsledky hospitalizovaných pacientov uvedené v tabuľke S1. Skóre poškodenia pľúc bolo hodnotené pomocou počítačovej tomografie v 5 stupňoch (CT skóre), ako je opísané.13 Kontrolná skupina zahŕňala zdravých jedincov bez hláseného kontaktu s infikovanými prípadmi a negatívna na skríning COVID{10}}.

2,2|Odber krvi a biologické vyšetrenie

Séra boli použité po dokončení biochemického testovania nariadeného klinickým lekárom. Zostávajúce vzorky boli skladované za rovnakých podmienok medzi skupinami, pri -20 stupňoch počas 24 hodín po odbere krvi. Rutinné biochemické markery boli testované v analyzátoroch Cobas 8000 (Roche Diagnostics, Švajčiarsko) a Atellica (Eschborn, Nemecko).

2,3|Meranie elastázy, MPO-DNA, DNAhistónových komplexov, dsDNA a cytokínov v sére

Cirkulujúce hladiny komplexov histón-DNA sa merali v sére pomocou súpravy Cell Death Detection ELISA Kit (Roche Diagnostics, Sigma-Aldrich, USA), ako bolo opísané vyššie.14 Hodnoty boli uvedené v jednotkách absorbancie 450 nm. Komplexy DNA-MPO sa merali nahradením anti-histónovej protilátky králičou polyklonálnou protilátkou proti myeloperoxidáze (Merck, Darmstadt, Nemecko). Koncentrácia NE bola stanovená pomocou súpravy Neutrofil Elastase Human ELISA Kit (Invitrogen, Carlsbad, USA). Hodnoty boli uvedené v ng/ml. Bezbunková dsDNA sa kvantifikovala pomocou súpravy Quant-iT PicoGreen® dsDNA Assay Kit po odčítaní pozadia (Invitrogen). IL-6, IL-8 a CXCR2 boli testované pomocou súprav ELISA od spoločnosti Reagentbio Ireland Ltd, Dublin, Írsko, IL{11}} od spoločnosti Invitrogen, HMGB1 od spoločnosti Novus Biologicals (Centennial, USA) a TNF- pomocou súpravy ELISA od R&D Systems Inc. (Minneapolis, USA).

2,4|Celková deoxyribonukleázová (DNázová) aktivita v sére pomocou jednoduchého radiálneho enzýmového difúzneho testu (SRED)

Aktivita DNázy sa kvantifikovala na agarózovom géli obsahujúcom 0,13 mg. ml-1 DNA z lososích spermií v pufri obsahujúcom 100 mM MES pH 6,5, 20 mM MgCl2, 2 mM CaCl2 a SYBR Safe DNA Gel Stain (Invitrogen, Life Technology), ako je opísané.15,16 Dva mikrolitre séra boli lokalizované v studne. Gély sa inkubovali 24 hodín pri 37 stupňoch vo vlhkej komore. Fluorescencia DNA-SYBR sa zaznamenala fluorescenčným skenerom.

2,5|Kvantifikácia bunkovo ​​viazaných NET v neutrofiloch inkubovaných so sérom pacienta

Aby sa určilo, či sérum pacientov s COVID{0}} ovplyvňuje NET viazané na bunky, krv od jedného zdravého darcu sa zmiešala (1:1 obj./obj.) so sérom pacienta pred liečbou PMA a inkubovala sa 6 hodín, ako je opísané.14 Lýza červených krviniek bola dosiahnutá pridaním 1 ml FACS Lyse reagens (BD Biosciences; riedenie 1:10) počas 5 minút. Potom sa pridal hovädzí sérový albumín (BSA, 1 ml pri 2 percentách) vo fosfátom pufrovanom fyziologickom roztoku (PBS) a zmes sa centrifugovala pri 1000 g počas 10 minút. Peleta resuspendovaná v PBS sa analyzovala pomocou prietokového cytometra Gallios (Beckman Coulter, Villepinte, Francúzsko). Stratégia hradlovania sa postupne zamerala na (i) CD66-pozitívne bunky a potom (ii) H3Cit-pozitívne a MPO-pozitívne bunky.

2,6|Test na in vitro uvoľňovanie NET DNA neutrofilov sérom pacienta

Izolované neutrofily sa resuspendovali v RPMI 1640 a 1 x 105 buniek sa naočkovalo na 96-jamkové doštičky pre tkanivové kultúry, ako je opísané.14 Platne sa inkubovali pri 37 stupňoch, aby sa umožnilo bunkám priľnúť. Po stimulácii 100 ul 0,1 ng/ml PMA počas 4 hodín sa jamky inkubovali s 1 U/ml MNázy alebo DNázy 1 (obe od Worthington) počas 10 minút alebo 10 ul pacienta alebo kontrolného séra počas 6 hodín a potom 2 mM Na zastavenie nukleázovej aktivity sa pridala EDTA. Obsah DNA uvoľnený v supernatante sa kvantifikoval pomocou súpravy Quant-iT PicoGreen® dsDNA Assay Kit (Invitrogen). Množstvo uvoľnenej DNA sa považovalo za 100 percent v nestimulovaných neutrofiloch zdravých darcov.

2,7|Štatistické analýzy

Všetky kvantitatívne premenné sú zobrazené ako medián a interkvartilový rozsah (IQR, 25-75. percentil) a kvalitatívne premenné ako percentá a 95-percentný interval spoľahlivosti (95 percent CI). Neparametrické testy sa použili, keď rozdelenie údajov nebolo normálne. Univariačné analýzy sa uskutočňovali pomocou chí-kvadrát testu alebo Fisherovho exaktného testu pre kategorické premenné a Mann-Whitneyho U a Kruskal-Wallisovho testu a Spearmanovej poradovej korelácie pre spojité premenné. Post hoc párové porovnania medzi podskupinami sa uskutočnili pomocou Conoverovho testu. Následne sme vykonali analýzu prevádzkových charakteristík prijímača (ROC), aby sme hľadali optimálne prahy súvisiace s výsledkami ochorenia.17 Následne sme vykonali analýzu prevádzkových charakteristík prijímača (ROC), aby sme hľadali optimálny prah spojený s výsledkami ochorenia, podľa DeLong et al.17 Klasifikačná premenná použitá v ROC analýze bol študovaný výsledok ochorenia.

For each ROC analysis, we reported the area under the receiver operating characteristic curve (AUROC) and the associated p-value. The exact binomial method was applied to estimate the 95% confidence intervals (CIs) of the AUROC. The optimal diagnostic cutoff was defined using the Youden index J. Bias-corrected and accelerated (BCa) bootstrap interval after 10,000 iterations for the Youden index and its associated values was performed.18 Clinical and biological criteria were used to define organ injuries (see the Methods section in this article's Online Repository at www.jacionline.org). Bias-corrected and accelerated (BCa) bootstrap interval after 10,000 iterations for the Youden index and its associated values were performed.18 In step #2, using multivariable logistic regression analysis, we assessed whether the ROC-defined threshold defined for elastase (>593 ng/l) bolo spojené s „početom postihnutých orgánov väčším alebo rovným 2“ po zohľadnení potenciálnych mätúcich faktorov. Posúdili sme diskrimináciu modelu pomocou analýzy ROC (AUROC a 95 percent CI) a kalibráciu modelu pomocou testu dobrej zhody Hosmera a Lemeshowa a štatistiky Nagelkerke R2.19

In step #3, we assessed the association between elastase level (>alebo menej alebo rovné 593 ng/l) a demografické údaje pacienta, anamnézu a výsledky ochorenia. Veľkosť vzorky 7 pacientov na skupinu bola potrebná na zistenie zvýšenia väčšieho alebo rovného 200 percentám a 38 pacientov na zistenie nárastu väčšieho alebo rovného 100 percent v strednej hodnote elastázy medzi skupinami , s 1- na 80 percent a na 0,05. Štatistické analýzy sa uskutočnili pomocou MedCalc, verzia 19.1 (MedCalc Software, Ostend, Belgicko) a Stata SE, verzia 12.1 (College Station, Texas, USA), na základe obojstrannej chyby typu I s hladinou alfa 0,05.

3|VÝSLEDKY

3.1|NE, MPO-DNA a histón-DNA sú dramaticky zvýšené a aktivita DNázy bola dramaticky znížená v COVID-19 ambulantných a hospitalizovaných

pacientov

34 ambulantných prípadov malo priemerný vek (plus /-SD) 42 plus /-17 rokov a pomer pohlaví (M/F) 0,88. Všetci mali najmenej dva symptómy vrátane horúčky, suchého kašľa a dyspnoe po dobu kratšiu ako jeden týždeň. Žiadny nemal v tomto štádiu ochorenia ťažkú ​​formu. Klinické charakteristiky 122 hospitalizovaných prípadov sú uvedené v tabuľke S1, ich biologické markery vrátane IL-6, IL-8, CXCR2, TNF-, IL-1 a HMGB1 sú uvedené v tabuľke S2 ​​a charakteristiky 35 zdravých kontrol sú uvedené v tabuľke S3. Krvné hladiny NE, MPO-DNA, histónovej DNA a dsDNA ambulantných a hospitalizovaných pacientov s COVID{19}} sú uvedené v tabuľke S4. Boli dramaticky vyššie ako tie, ktoré boli hlásené u kontrolných subjektov. Na rozdiel od toho bola globálna aktivita DNázy 10-krát nižšia v prípadoch COVID{22}} (obrázok 1A, B).

Sérová koncentrácia NE a NET zložiek nesúvisela s vekom a pohlavím medzi skupinami a sérová koncentrácia 1 antitrypsínu (AAT), hlavného inhibítora NE v krvi, bola normálna (tabuľka S2). Koncentrácia NE bola významne vyššia u hospitalizovaných oproti ambulantným prípadom a u pacientov liečených na jednotke intenzívnej starostlivosti oproti miestnym nemocniciam a lekárskym oddeleniam univerzitných nemocníc (obrázok 1A). NE bol distribuovaný v dvoch zhlukoch vysokých a nižších koncentrácií u ambulantných prípadov a pacientov hospitalizovaných na lekárskych oddeleniach krajských fakultných nemocníc. Zhluky s najvyššími koncentráciami mali podobné hodnoty ako na jednotkách intenzívnej starostlivosti (obrázok 1A). Ako bolo pozorované pre zložky NE a NET, koncentrácia dsDNA bola vyššia u pacientov prijatých na jednotky intenzívnej starostlivosti (obrázok 1B). Okrem toho sérová koncentrácia zložiek NE a NET bola spojená s počtom postihnutých orgánov (obrázok 1C).

3,2|NE, histón-DNA a celková aktivita DNázy sú spojené so závažnosťou a multiviscerálnymi prejavmi COVID-19

Študovali sme asociácie medzi elastázou, myeloperoxidázou konjugovanou DNA, komplexom histón-DNA a klinickými a biologickými charakteristikami pacientov (tabuľka 1). Uviedli sme významné korelácie NE s histónovou-DNA, MPO-DNA, biomarkermi závažnosti ochorenia, SaO2 pri prijatí do nemocnice, leukocytmi, neutrofilmi, pomerom neutrofilov k lymfocytom, LDH, markermi kardiovaskulárneho a trombotického rizika, vrátane troponínu-T ( cTnT), fibrinogén a D-dimér a markery zlyhania obličiek, vrátane močoviny a kreatinínu (tabuľka 1 a obrázok 2). Pozorovali sme tiež významnú asociáciu NE s IL-6, IL-8 a CXCR2, ale nie s TNF, IL-1 a HMBG1 (obrázok 3). Bola hlásená významná asociácia histón-DNA so skóre počítačovej tomografie (CT skóre) poškodenia pľúc,13 markerov kardiovaskulárneho a trombotického rizika13 (tabuľka 1) vrátane cTnT a fibrinogénu, markerov zlyhania obličiek vrátane močoviny a kreatinínu a markery zápalu, vrátane C-reaktívneho proteínu, feritínu a telesnej teploty (obrázok S1). Naproti tomu MPO-DNA bola spojená iba s leukocytmi (p=0,005) a neutrofilmi (p=0,004) a v menšej významnosti s D-dimérom (p=0 0.045) a fibrinogén (p=0.047). Celková aktivita DNázy bola spojená s alkalickou fosfatázou (PAL) a celkovým bilirubínom, zatiaľ čo dsDNA bola spojená iba s feritínom (tabuľka 1).

OBRÁZOK 1 Neutrofilná elastáza (NE), myeloperoxidáza-DNA (MPO-DNA), histónová-DNA a (B) bezbunková dsDNA a celková aktivita DNázy v sére 155 pozitívnych prípadov COVID{6}}. Symptomatické ambulantné prípady (n=34) boli prijaté v skríningových centrách a hospitalizovaní pacienti (n=122) ​​v miestnych nemocniciach (n=43) a lekárskych oddeleniach (n=65) a jednotky intenzívnej starostlivosti (n=13) dvoch regionálnych univerzitných nemocníc. Hodnoty p koncentrácií NE medzi skupinami boli nasledovné: zdravý verzus ambulantný<0.0001; healthy versus proximity hospital <0.0001; healthy versus medical department <0.0001; healthy versus intensive care <0.0001; ambulatory versus proximity hospital 0.7870; ambulatory versus medical department 0.0028; ambulatory versus intensive care <0.0001; proximity hospital versus medical department 0.0003; proximity hospital versus intensive care <0.0001; and medical department versus intensive care 0.0239. The p-values of MPO concentrations between groups were healthy versus ambulatory <0.0001; healthy versus proximity hospital <0.0001; healthy versus medical department <0.0001; healthy versus intensive care <0.0001; ambulatory versus proximity hospital 0.1237; ambulatory versus medical department 0.8589; ambulatory versus intensive care 0.1276; proximity hospital versus medical department 0.1463; proximity hospital versus intensive care 0.5811; and medical department versus intensive care 0.1482. 

Hodnoty p histónovej_DNA medzi skupinami boli zdravé oproti ambulantným<0.0001; healthy versus proximity hospital <0.0001; healthy versus medical department <0.0001; healthy versus intensive care <0.0001; ambulatory versus proximity hospital 0.0013; ambulatory versus medical department 0.0525; ambulatory versus intensive care <0.0001; proximity hospital versus medical department 0.2740; proximity hospital versus intensive care 0.0.0033; and medical department versus intensive care 0.0003. The thresholds (dotted lines) were evaluated in healthy controls recruited several months before the epidemy. 

Prah NE bol odhadnutý na 73 ng/ml a prah MPO-DNA na 0,562 AU (450 nm absorbančných jednotiek), histón-DNA na 0,591 AU, celková aktivita DNázy pri 9,94 U/ml a sérovej dsDNA pri 95,60 ng/ml (C) NE, MPO-DNA a histónovej DNA podľa počtu orgánov zasiahnutých COVID-19. Údaje z (A), (B) a (C) boli porovnané Mann-Whitney testom. Prerušované čiary predstavujú medzné hodnoty definované ako priemer plus 2 štandardné odchýlky pre NE, MPO-DNA, histón-DNA a bezbunkovú DNA a priemer – 2 štandardné odchýlky pre aktivitu DNázy.

3,3|Diagnostická presnosť NE, MPO-DNA, histónovej DNA, dsDNA, aktivity DNázy a príbuzných cytokínov na zisťovanie výsledkov ochorenia v analýzach prevádzkových charakteristík prijímača (ROC)

Vykonali sme ROC analýzy na posúdenie diagnostickej presnosti NE, MPO-DNA a histónovej DNA na predpovedanie výsledkov súvisiacich s ochorením (tabuľka S5 a lesný graf na obrázku 4). NE mala významné prahy pre prijatie na jednotky intenzívnej starostlivosti, výskyt respiračného zlyhania, saturáciu krvi kyslíkom<85%, and the presence of at least two affected organs (Figure 4). The latter was best predicted with a cutoff at 593 ng/ml of NE. Histone-DNA had significant thresholds for admission into intensive care units, kidney injury, and blood oxygen saturation <85%. MPO-DNA had significant thresholds for heart decompensation, kidney injury, respiratory failure, and blood oxygen saturation <85%. The ROC analyses identified also very significant cutoffs for IL-6, IL-8, and CXCR2 for admission into intensive care units, heart decompensation, kidney injury, and respiratory failure. In contrast, we did not observe these associations with IL-1β and TNF-α.

3.4  |  Associations between NE >593 ng/ml a charakteristiky a výsledky pacientov

In univariate analyses, NE >593 ng/ml was significantly associated with CT score, blood oxygen saturation, respiratory failure, presence of at least two affected organs, and admission into the intensive care unit (Table S6). We retained chronic kidney disease, diabetes, and hypertension as potential confounders in multivariable analyses (Table S7). In the multivariable models that were used to account for the collinearity issue, NE >593 ng/ml bolo nezávisle spojené s CT skóre a prítomnosťou aspoň dvoch postihnutých orgánov (tabuľka S8). Optimálny model s viacerými premennými mal oblasť pod prevádzkovými charakteristikami prijímača (AUROC) 0,876 (95 percent CI, 0,758–0,950) a percento prípadov správne klasifikovaných 85 percent. Vykonali sme analýzy zhody medzi medznými hodnotami NE a cytokínmi pri predikcii najmenej dvoch postihnutých orgánov. Uviedli sme 70,4-percentnú a 72,7-percentnú zhodu NE s CXCR2 a IL-6, v tomto poradí (obrázok 3).

3,5|Séra pacienta znižujú retenciu NET a zvyšujú uvoľňovanie dsDNA v izolovaných kontrolných neutrofiloch

Študovali sme bunkovo ​​viazané NET kontrolných neutrofilov inkubovaných so sérom pacienta pomocou prietokovej cytometrie. Pozorovali sme zníženú retenciu NET viazaných na bunky, čo odrážalo zvýšené uvoľňovanie, z buniek inkubovaných s pacientom oproti kontrolným séram (obrázok 5A). Ďalej sme študovali uvoľňovanie dsDNA z kontrolných neutrofilov produkovaných sérom pacienta. Pozorovali sme zvýšené uvoľňovanie dsDNA z neutrofilov inkubovaných s pacientom oproti kontrolným séram (obrázok 5B). Inhibícia NE a iných sérových serínových proteáz pomocou 10 uM aprotinínu mala slabý inhibičný účinok na uvoľňovanie dsDNA (obrázok 5C). Celkovo tieto údaje naznačujú, že séra od pacientov zvýšili uvoľňovanie zložiek NET s obmedzenou úlohou NE.

4|DISKUSIA

Our study showed that NE, global DNase activity, and components of NETs are involved in the early and later steps of COVID-19. NE and histone-DNA were associated with clinical manifestations and biomarkers related to pulmonary damage, cardiovascular manifestations, renal insufficiency, and inflammation. Elastase >593 ng/ml bolo nezávislým prediktorom multiorgánového poškodenia v multivariačnej analýze.

Dramatické zvýšenie krvných hladín NE a NET v ambulantných prípadoch ukazuje ich účasť na včasnej reakcii hostiteľa na SARS-CoV-2, ako bolo predtým pozorované pri iných vírusových pneumóniách.4,6,11,20 Zvýšenie NE a NETs sa stále pozoruje v neskoršej fáze infekcie, čo dokazujú hospitalizované prípady, najmä tie, ktoré boli prijaté na jednotku intenzívnej starostlivosti dva týždne po nástupe symptómov. Alveolárne epitelové bunky z pľúc infikovaných vírusom chrípky stimulujú NETózu.21 Existuje však diskusia o škodlivých verzus ochranných účinkoch NET pri syndróme akútnej respiračnej tiesne (ARDS).22,23 Citrulinovaná H3 a bezbunková DNA odrážajú produkcia extracelulárnych pascí neutrofilmi, granulocytmi a monocytmi.23,24 Dramatický nárast koncentrácie NE v krvi špecifickejšie odráža aktiváciu neutrofilov.24,25 Treba poznamenať, že koncentrácia NE koreluje lepšie s alveolárnym zápalom ako počet neutrofilov, pri akútnych syndróm respiračnej tiesne.25,26.

NE, ale nie histónová DNA a MPO-DNA, bola nezávislým prediktorom multiorgánového poškodenia u pacientov s COVID-19. Tento výsledok odráža významnú úlohu NE pri uvoľňovaní zložiek NET a mechanizmoch prirodzenej imunity neutrofilov.24 NE sa uvoľňuje do tkanív a krvi degranuláciou alebo uvoľňovaním pomocou NET.24,27–29 Indukcia ROS vírusovou infekciou aktivuje MPO , čo potom aktivuje uvoľňovanie NE.29,30 Veľmi významná korelácia medzi NE a histónovou-DNA a MPO-DNA ilustruje úlohu NE pri tvorbe NET. Po stimulácii neutrofilmi sa NE translokuje do jadra, kde sa zúčastňuje na degradácii histónov predtým, ako sa uvoľní s DNA/chromatínovým materiálom NETs.6,30 Dôležité je, že NE asociovaný s NET zostáva aktívny a uniká endogénnej antiproteázovej aktivite AAT. 31 NE môže spôsobiť poškodenie tkaniva v pľúcach, srdci, pečeni, cievach a obličkách a má protrombotické účinky pri vírusovej infekcii.6,26,31–37

Degradácia zložiek extracelulárnej matrice (ECM) prostredníctvom NE spôsobuje rovnaké poranenia pľúc a ciev, aké boli pozorované v pitevných vzorkách pacientov s COVID{0}}.34–39 Asociácie NE a histónovej DNA so SaO2 pri prijatí do nemocnice a CT skóre poškodenia pľúc COVID-18 je v súlade s ich účinkami pri iných pľúcnych vírusových infekciách.6,12,40 Ich asociácie s troponínom-T, D-dimérom a fibrinogénom naznačujú ich úlohu v protrombotických účinkoch uvádzaných v COVID-19.39–41 Poranenie myokardu počas COVID{14}} nie je jasne pochopené.42–44 Mechanizmy zahŕňajú priamu vírusovú infekciu, trombózu, mikrovaskulárne poškodenie a poškodenie myokardu súvisiace so zníženým prísunom kyslíka a uvoľňovaním cytokíny.34,43,45 Zvýšené cTnT spojené s NE by mohlo byť sekundárne pri koronárnej trombóze a infarkte myokardu a/alebo myokarditíde.34,43,44 NE a NET by tiež mohli prispieť k asociácii poškodenia srdca prostredníctvom systémových účinkov v obličkách a iné orgány.2,45,46 Asociácie NE a histónovej DNA s močovinou a kreatinínom naznačujú ich účasť na akútnom poškodení obličiek hlásenom u približne 30 percent pacientov s COVID-19.33,{30}} .

Naša štúdia prispieva k lepšiemu pochopeniu patologických mechanizmov COVID{0}} tým, že poukazuje na kľúčovú úlohu narušenia prirodzenej imunity neutrofilov počas vírusovej replikácie a po nej, ako je zhrnuté v grafickom abstrakte. IL-6, IL-8 a TNF – zodpovedajú za cytokíny spojené prevažne so závažnosťou COVID-19.50 Túto súvislosť sme potvrdili pre IL-6 a IL{{7} }. Zvýšené koncentrácie IL-1 v niekoľkých štúdiách pozitívne korelovali so závažnosťou ochorenia.51 Nezistili sme však žiadnu súvislosť IL-1 s výsledkami závažnosti COVID{11}}, ako už bolo uvedené v nedávna metaanalýza.52 Tieto výsledky sú v súlade s nedávnou rozsiahlou štúdiou, v ktorej bola IL-1 slabo detekovaná a v dôsledku toho mala len okrajovú predikčnú hodnotu závažnosti ochorenia.50 IL{17 }} a IL-8 sú produkované po aktivácii NF-κB infikovaných alveolárnych makrofágov prostredníctvom mechanizmov, ktoré pravdepodobne zahŕňajú Brutonovu tyrozínkinázu (BTK).53 Ilustrujú to sľubné klinické účinky vyvolané inhibítorom BTK acalabrutinibom u pacientov s ťažký COVID-19.53 IL-8 pôsobí ako chemokín aktivujúci neutrofily prostredníctvom svojej väzby na CXCR2, ktorý je hlavným chemokínovým receptorom neutrofilov.15 Preto dramatický nárast NE u ťažkého COVID{{27 }} môže súvisieť s aktiváciou neutrofilov dráhami IL-8/CXCR2.16 LDH, feritín a D-dimér vysoko korelujú s NE a môžu odrážať aktiváciu makrofágov COVID-19.49, 54

Naopak, NE a NET by tiež mohli hrať úlohu pri aktivácii makrofágov a spracovaní prozápalových cytokínov.3,6,36–38 Uviedli sme dramatický pokles globálnej aktivity DNázy v sére, ktorá by sa mohla podieľať na NETóze prostredníctvom zníženej degradácie fragmenty cirkulujúcej chromatínovej DNA (grafický abstrakt).55–58 Je pozoruhodné, že myšací model Dnase1–/– Dnase1 l3–/– vystavený patogénom produkuje pľúcne lézie podobné tým, ktoré sa pozorujú u pacientov s respiračnou tiesňou a/alebo sepsou a pri pitve Pacienti s COVID{10}}.40,59 Nedávna štúdia konzistentne uvádzala zníženú aktivitu DNázy I pri bakteriálnej a vírusovej pneumónii u detí.60.

Séra pacientov s COVID{0}} znížili retenciu buniek NET a zvýšili uvoľňovanie dsDNA neutrofilov od zdravých darcov. Podobné výsledky boli predtým získané so sérom COVID{1}} s použitím bunkového farbiva SYTOX Green na kvantifikáciu NETs.9 Tieto výsledky ukazujú, že NETózu môžu spustiť endogénne stimuly uvoľnené v krvi poranenými tkanivami, ako sú DAMP, vrátane voľnej dsDNA .61 Zdá sa, že HMGB1 nie je zapojený do zvýšenej NETózy, pretože jeho koncentrácia nebola zvýšená v prípadoch COVID-19, ako sa uvádzalo predtým.62

Naša štúdia otvára terapeutické perspektívy. Nadmerná aktivita NE uvádzaná v našej štúdii naznačuje zhodnotenie používania silných inhibítorov NE novej generácie, vrátane lonodelestatu (POL6014), alvelestatu, CHF6333 a elafinu pri COVID-19.8,27 Dramatický pokles DNázy hlásený v r. naša štúdia tiež navrhuje hodnotenie použitia rekombinantnej deoxyribonukleázy I (dornáza alfa) a/alebo DNázy 1L3.63–65 Jedným z očakávaných účinkov je uvoľňovanie NE z degradovaných NET so zvýšeným voľným NE v krvi a následne zlepšenou účinnosťou inhibítorov NE. 30 Z tohto dôvodu si myslíme, že pri liečbe COVID-19 by sa malo zvážiť spojenie inhibítorov DNázy s inhibítormi NE. Ďalšou terapeutickou možnosťou, ktorá by sa mala zvážiť, by mohlo byť použitie inhibítorov CXCR2 na blokovanie náboru a aktivácie neutrofilov. Zhoršenie NE a/alebo uvoľnenie NET v ranej fáze COVID{13}} by mohlo priniesť výhody, ale aj riziká súvisiace so znížením vrodenej imunity hostiteľa. Na rozdiel od toho predpokladáme, že táto stratégia by mohla znížiť systémové prejavy COVID{14}} v postreplikačnej fáze ochorenia.

Naša štúdia mala obmedzenia. Nemohli sme systematicky hlásiť všetky biomarkery u všetkých pacientov. Nábor a prierezové hodnotenie nám neumožnili študovať kinetiku NE a NET pri sledovaní pacientov. Podarilo sa nám však porovnať koncentráciu NE a NET u ambulantných symptomatických pacientov prijatých počas prvého týždňa COVID-19 a pacientov hospitalizovaných počas druhého až štvrtého týždňa ochorenia. Multicentrický nábor v miestnych nemocniciach a regionálnych univerzitných nemocniciach bol silnou stránkou našej štúdie na hodnotenie prípadov s rozdielnou závažnosťou ochorenia. Vyčerpávajúce zaznamenávanie klinických údajov nám umožnilo vykonať mnohorozmernú analýzu asociácie NE a NET so závažnosťou a multiorgánovým poškodením COVID-19 po vynútenej úprave pre anamnézu.

Na záver naša štúdia poukazuje na dramatický nárast NE, aktivity DNázy a NET počas prvej fázy COVID-19 a ich kľúčovú úlohu v závažnosti syndrómu akútnej respiračnej tiesne a kardiovaskulárnych, renálnych a zápalových systémových prejavy v neskoršom štádiu ochorenia. Navrhujú hodnotenie NE, DNázy 1 a NET ako potenciálnych terapeutických cieľov.

POĎAKOVANIE

Štúdiu NICO zaregistrovala Institutional Review Board of Clinical Research (DRCI) Univerzitnej nemocnice v Nancy (č. 2020PI087) a schválila ju Etická komisia Univerzitnej nemocnice v Nancy. Autori nemali žiaden konflikt záujmov, ktorý by mohli deklarovať.

KONFLIKT ZÁUJMOV

Žiadny z autorov nemal žiadne finančné vzťahy so sebou samým a so svojou najbližšou rodinou/významnými osobami.

AUTORSKÉ PRÍSPEVKY

JL Guéant mal úplný prístup ku všetkým údajom, dohliadal na štúdiu a preberá zodpovednosť za integritu a presnosť analýzy údajov. Štúdiu navrhli a navrhli JL Guéant a V Regnault. JL Guéant, V Regnault, RM Guéant-Rodriguez, A Oussalah a P Lacolley získali údaje, analyzovali údaje alebo ich interpretovali. JL Guéant bol zapojený do hlavného návrhu rukopisu. V Regnault, RM Guéant-Rodriguez a A Oussalah sa podieľali na čiastočnom návrhu konkrétnych častí. Všetci autori rukopis kriticky prepracovali. RM Guéant-Rodriguez, Julien Fromonot a A Oussalah sa podieľajú na správe databáz. RM Guéant-Rodriguez a A Oussalah boli zapojení do štatistických analýz.

LITERATÚRA

1. Zhou P, Yang XL, Wang XG a kol. Prepuknutie zápalu pľúc spojené s novým koronavírusom pravdepodobne netopierieho pôvodu. Príroda. 2020; 579:270-273.

2. Grasselli G, Zangrillo A, Zanella A, a kol. Základné charakteristiky a výsledky 1 591 pacientov infikovaných SARS-CoV-2 prijatých na JIS v regióne Lombardia v Taliansku. JAMA. 2020; 323 (16): 1574.

3. Azkur AK, Akdis M, Azkur D, a kol. Imunitná odpoveď na SARS-CoV-2 a mechanizmy imunopatologických zmien pri COVID-19. Alergia. 2020; 75:1564-1581.

4. McGonagle D, Sharif K, O'Regan A, Bridgewood C. Úloha cytokínov vrátane interleukínu-6 pri COVID-19-indukovanej pneumónii a chorobe podobnej syndrómu aktivácie makrofágov. Autoimmun Rev. 2020;19:102537.

5. Mo P, Xing Y, Xiao YU a kol. Klinické charakteristiky refraktérnej pneumónie COVID{1}} vo Wu-chane, Čína. Clin Infect Dis. 2020:ciaa270. [Epub pred tlačou]. https://doi.org/10.1093/cid/ ciaa270

6. Papayannopoulos V. Neutrofilné extracelulárne pasce v imunite a chorobe. Nat Rev Immunol. 2018; 18:134-147.

7. Lagunas-Rangel FA. Pomer neutrofilov k lymfocytom a pomer lymfocytov k C reaktívnemu proteínu u pacientov s ťažkým koronavírusovým ochorením 2019 (COVID-19): metaanalýza. J Med Virol. 2020;92(10):{13}}.

8. Barnes BJ, Adrover JM, Baxter-Stoltzfus A, a kol. Zacielenie na potenciálnych pôvodcov COVID-19: extracelulárne pasce neutrofilov. J Exp Med. 2020;217:e20200652.

9. Zuo Y, Yalavarthi S, Shi H a kol. Neutrofilné extracelulárne pasce v COVID-19. JCI. Náhľad. 2020;5:e138999.

10. Gueant JL, Fromonot J, Gueant-Rodriguez RM, Lacolley P, Guieu R, Regnault V. Krvná myeloperoxidáza-DNA, biomarker včasnej odpovede na infekciu SARS-CoV-2? Alergia. 2020. [Epub pred tlačou]. https://doi.org/10.1111/all.14533

11. Cortjens B, de Boer OJ, de Jong R, et al. Neutrofilné extracelulárne pasce spôsobujú obštrukciu dýchacích ciest počas respiračného syncyciálneho vírusového ochorenia. J Pathol. 2016; 238:401-411. 12. Twaddell SH, Baines KJ, Grainge C, Gibson PG. Vznikajúca úloha neutrofilných extracelulárnych pascí pri respiračných ochoreniach. Hrudník. 2019;156:774-782.

13. Li K, Fang Y, Li W a kol. Vizuálne kvantitatívne vyhodnotenie CT obrazu a klinická klasifikácia koronavírusového ochorenia (COVID-19). Eur Radiol. 2020; 30:4407-4416.

14. Popovic B, Zannad F, Louis H a kol. Endotelom riadené zvýšenie tvorby plazmatického trombínu charakterizujúce nový hyperkoagulačný fenotyp pri akútnom srdcovom zlyhaní. Int J Cardiol. 2019; 274:195-201.

15. Uddin M, Watz H, Malmgren A, Pedersen F. NETopatický zápal pri chronickej obštrukčnej chorobe pľúc a ťažkej astme. Front Immunol. 2019;10:47.

16. Hyperzápal Didangelos A. COVID-19: čo neutrofily? mSphere. 2020;5:e00367-e00420.

17. DeLong ER, DeLong DM, Clarke-Pearson DL. Porovnanie plôch pod dvomi alebo viacerými korelovanými krivkami prevádzkových charakteristík prijímača: neparametrický prístup. Biometria. 1988;44:837-845. 18. Efron B, Tibhirani RJ. Úvod do bootstrapu. CRC Press 1994.

19. Nagelkerke NJD. Poznámka k všeobecnej definícii koeficientu determinácie. Biometrika. 1991;78:691-692.

20. Funchal GA, Jaeger N, Czepielewski RS, a kol. Fúzny proteín respiračného syncyciálneho vírusu podporuje tvorbu extracelulárnych pascí neutrofilov závislých od TLR -4- ľudskými neutrofilmi. PLoS One. 2015;10:e0124082.

21. Pillai PS, Molony RD, Martinod K, a kol. Mx1 odhaľuje vrodené cesty k antivírusovej rezistencii a smrteľnému chrípkovému ochoreniu. Veda. 2016;352:463-466.

22. Bendib I, de Chaisemartin L, Mekontso Dessap A, Chollet-Martin S, de Prost N. Pochopenie úlohy neutrofilných extracelulárnych pascí u pacientov s ťažkou pneumóniou a ARDS. Hrudník. 2019;156:1278-1280.

23. Granger V., Faille D., Marani V. a kol. Monocyty ľudskej krvi môžu vytvárať extracelulárne pasce. J Leukoc Biol 2017;102:775-781.

24. Kettritz R. Neutrálne serínové proteázy neutrofilov. Immunol Rev. 2016;273:232-248.

25. Lengas A, Poletti V, Pacifico L, di Domizio C, Patelli M, Spiga L. Akútny zápal pľúc: elastáza neutrofilov verzus neutrofily v bronchoalveolárnej laváži – elastáza neutrofilov odráža lepšiu intenzitu zápalu. Intensive Care Med. 1994; 20:354-359.

26. Polverino E, Rosales-Mayor E, Dale GE, Dembowsky K, Torres A. Úloha inhibítorov neutrofilnej elastázy pri pľúcnych ochoreniach. Hrudník. 2017;152:249-262.

27. Korkmaz B, Moreau T, Gauthier F. Neutrofilná elastáza, proteináza 3 a katepsín G: fyzikálno-chemické vlastnosti, aktivita a fyziopatologické funkcie. Biochimie. 2008; 90:227-242.

28. Faurschou M, Borregaard N. Neutrofilné granule a sekrečné vezikuly pri zápale. Mikróby infikujú. 2003;5:1317-1327.

29. Papayannopoulos V, Metzler KD, Hakkim A, Zychlinsky A. Neutrofilná elastáza a myeloperoxidáza regulujú tvorbu neutrofilných extracelulárnych pascí. J Cell Biol. 2010;191:677-691.

30. Kolaczkowska E, Jenne CN, Surewaard BGJ a kol. Molekulárne mechanizmy tvorby a degradácie NET odhalené intravitálnym zobrazením v pečeňovej vaskulatúre. Nat Commun. 2015;6:6673.

31. Taylor S, Dirir O, Zamanian RT, Rabinovič M, Thompson AAR. Úloha neutrofilov a neutrofilnej elastázy pri pľúcnej arteriálnej hypertenzii. Front Med (Lausanne). 2018;5:217.

32. Nakazawa D, Marschner JA, Platen L, Anders HJ. Extracelulárne pasce pri ochorení obličiek. Kidney Int. 2018; 94:1087-1098.

33. Doring Y, Libby P, Soehnlein O. Neutrofilné extracelulárne pasce sa podieľajú na kardiovaskulárnych ochoreniach: nedávne experimentálne a klinické poznatky. Circ Res. 2020;126:1228-1241.

34. Bronze-da-Rocha E, Santos-Silva A. Inhibítory neutrofilnej elastázy a chronické ochorenie obličiek. Int J Biol Sci. 2018; 14:1343-1360.

35. Alam SR, Newby DE, Henriksen PA. Úloha endogénneho inhibítora elastázy, elafínu, pri kardiovaskulárnom poškodení: od epitelu po endotel. Biochem Pharmacol. 2012;83:695-704.

36. Clancy DM, Henry CM, Sullivan GP, ​​Martin SJ. Neutrofilné extracelulárne pasce môžu slúžiť ako platformy na spracovanie a aktiváciu cytokínov rodiny IL-1. FEBS J. 2017;284:1712-1725.

37. Alfaidi M., Wilson H., Daigneault M. a kol. Neutrofilná elastáza podporuje sekréciu interleukínu-1beta z ľudského koronárneho endotelu. J Biol Chem. 2015; 290:24067-24078.

38. Korkmaz B, Horwitz MS, Jenne DE, Gauthier F. Neutrofilná elastáza, proteináza 3 a katepsín G ako terapeutické ciele pri ľudských chorobách. Pharmacol Rev. 2010;62:726-759.

39. Ackermann M, Verleden SE, Kuehnel M, et al. Pľúcna vaskulárna endoteliálnaitída, trombóza a angiogenéza u Covid-19. N Engl J Med. 2020; 383:120-128.

40. Bikdeli B, Madhavan MV, Jimenez D, a kol. COVID-19 a trombotické alebo tromboembolické ochorenie: dôsledky pre prevenciu, antitrombotickú terapiu a následné sledovanie: najnovší prehľad JACC. J Am Coll Cardiol. 2020; 75:2950-2973.

41. Driggin E, Madhavan MV, Bikdeli B, a kol. Kardiovaskulárne aspekty pre pacientov, zdravotníckych pracovníkov a zdravotnícke systémy počas pandémie COVID-19. J Am Coll Cardiol. 2020; 75:2352-2371.

42. Babapoor-Farrokhran S, Gill D, Walker J, Rasekhi RT, Bozorgnia B, Amanullah A. Poranenie myokardu a COVID-19: možné mechanizmy. Life Sci. 2020;253:117723. 43. Doyen D, Moceri P, Ducreux D, Dellamonica J. Myokarditída u pacienta s COVID-19: príčina zvýšených zmien troponínu a EKG. Lancet. 2020;395:1516.

44. Renu K, Prasanna PL, Valsala GA. Patogenéza koronavírusu, komorbidity a poškodenie viacerých orgánov – prehľad. Life Sci. 2020;255:117839. https://doi.org/10.1016/j.lfs.2020.117839

45. Libby P. Srdce v COVID-19: primárny cieľ alebo sekundárny okoloidúci? JACC Basic Transl Sci. 2020;5(5):537-542.

46. ​​Cheng Y, Luo R, Wang K, a kol. Ochorenie obličiek je spojené so smrťou pacientov s COVID v nemocnici-19. Kidney International. 2020. 97:829-838.

47. Oussalah A, Gleye S, Clerc Urmes I, a kol. Dlhodobé užívanie ACE inhibítora/ARB je spojené s ťažkou renálnou dysfunkciou a akútnym poškodením obličiek u pacientov s ťažkým COVID-19: výsledky zo skupiny odporúčacích centier v severovýchodnom Francúzsku. Clin Infect Dis. 2020;71(9):2447-2456.

48. Cheng Y, Luo R, Wang K, a kol. Ochorenie obličiek je spojené so smrťou pacientov s COVID v nemocnici-19. Kidney Int. 2020; 97:829-838.

49. Liu T, Zhang J, Yang Y, a kol. Úloha interleukínu-6 pri monitorovaní závažných prípadov koronavírusovej choroby 2019. EMBO Mol Med. 2020;12:e12421.

50. Del Valle DM, Kim-Schulze S, Hsin-Hui H, a kol. Zápalový cytokínový podpis pomáha predpovedať závažnosť a smrť COVID-19. Nat Med. 2020; 26:1636-1643.

51. Gao YD, Ding M, Dong X a kol. Rizikové faktory pre ťažkých a kriticky chorých pacientov s COVID-19: prehľad. Alergia. 2020; https://doi. org/10.1111/all.14657.

52. Akbari H., Tabrizi R., Lankarani KB, a kol. Úloha cytokínového profilu a podskupín lymfocytov v závažnosti koronavírusovej choroby 2019 (COVID-19): systematický prehľad a metaanalýza. Life Sci. 2020;258:118167.

53. Roschewski M, Lionakis MS, Sharman JP a kol. Inhibícia Bruton tyrozínkinázy u pacientov s ťažkým COVID-19. Sci Immunol. 2020;5(48):eabd0110.

54. Colafrancesco S, Alessandri C, Conti F, Priori R. COVID-19 sa pokazil: nová postava v spektre syndrómu hyperferritinémie? Autoimmun Rev. 2020;19:102573.

55. Takeshita H, Yasuda T, Nakajima T, Hosomi O, Nakashima Y, Kishi K. Myšia deoxyribonukleáza I (DNáza I): biochemická a imunologická charakterizácia, štruktúra cDNA a distribúcia tkanív. Biochem Mol Biol Int. 1997;42:65-75.

56. Ueki M, Takeshita H, Fujihara J, et al. Kaukazská špecifická alela v nesynonymných jednonukleotidových polymorfizmoch génu kódujúceho deoxyribonukleázu I-like 3, potenciálne relevantná pre autoimunitu, produkuje inaktívny enzým. Clin Chim Acta. 2009;407:20-24.

57. Ueki M, Kimura-Kataoka K, Takeshita H, a kol. Vyhodnotenie všetkých nesynonymných jednonukleotidových polymorfizmov (SNP) v génoch kódujúcich ľudskú deoxyribonukleázu I a I-like 3 ako funkčný SNP potenciálne zapojený do autoimunity. FEBS Journal. 2014; 281:376-390.

58. Keyel PA. DNAs v zdraví a chorobe. Dev Biol. 2017;429:1-11.

59. Jiménez-Alcázar M, Rangaswamy C, Panda R a kol. Hostiteľské DNázy zabraňujú vaskulárnej oklúzii neutrofilnými extracelulárnymi pascami. Veda. 2017;358:1202-1206.

60. Chen D, Yang XL, Shen ZB a kol. Význam neutrofilnej extracelulárnej pasce a jej markerov vo včasnej diagnostike komunitne získanej pneumónie u detí. Zhongguo Dang Dai Er Ke Za Zhi. 2019; 21:868-875.

61. Denning NL, Aziz M, Gurien SD, Wang P. DAMP a NET v sepse. Front Immunol. 2019;10:2536.

62. Chen L, Long X, Xu Q a kol. Zvýšené sérové ​​hladiny S100A8/A9 a HMGB1 pri prijatí do nemocnice korelujú s horšími klinickými výsledkami u pacientov s COVID{5}}. Cell Mol Immunol. 2020; 17:992-994.

63. Zitter JN, Maldjian P, Brimacombe M, Fennelly KP. Inhalačná dornáza alfa (Pulmozyme) ako neinvazívna liečba atelektázy u mechanicky ventilovaných pacientov. J Crit Care. 2013;28(218):e1-e7.

64. Pottecher J, Noll E, Borel M, a kol. Protokol pre TRAUMADORNÁZU: prospektívna, randomizovaná, multicentrická, dvojito zaslepená, placebom kontrolovaná klinická štúdia aerosólovej dornázy alfa na zníženie výskytu stredne ťažkej až ťažkej hypoxémie u pacientov s ventilovanou traumou. Skúšky. 2020; 21:274.

65. Fuchs TA, Jimenez-Alcazar M, Göbel J, Englert H.Engineered DNAse enzymes and use in the therapy. 2019.

PODPORUJÚCE INFORMÁCIE

Ďalšie podporné informácie možno nájsť online v časti Podporné informácie.

Pre viac informácií: 1950477648@nn.gmail.com