Elastín tvorí elastický proteín epidermálnych spojivových tkanív s kolagénom

Prosím kontaktujteoscar.xiao@wecistanche.comPre viac informácií

Abstrakt:Nový xantónglykozid,135,6-tetrahydroxyxantón-C-4-D-glukopyranozid bol izolovaný z metanolového extraktu listov Mangifera Indica (Anacardiaceae) rastúcich v Egypte. Štruktúra bola objasnená pomocou 1D a 2D-NMR spektroskopických údajov. Fyzikálno-chemické vlastnosti zlúčeniny, ako je lipofilita, rozpustnosť a úvahy o formulácii, boli predpovedané pomocou techniky in silico ADMET s použitím servera SwissADME. Táto technika poskytla Lipinského pravidlo piatich, ako je absorpcia, distribúcia, metabolizmus a kožná permeácia GIT. Hodnotili sa in vitro inhibičné aktivity proti enzýmom sprostredkovaným starnutím, ako je kolagenáza, elastáza, hyaluronidáza a tyrozináza. Zlúčenina vykazovala pozoruhodné antikolagenázové, antielastázové, antihyaluronidázové a antityrozinázové účinky s hodnotami IC50 1,06, 419,10, 1,65 a 0,48 ug/ml, v tomto poradí, v porovnaní s pozitívnou kontrolou. Zlúčenina vykazovala sľubnú predpokladanú rozpustnosť vo vode a primeranú penetráciu pokožkou, čo naznačuje vhodnosť zlúčeniny na topickú formuláciu ako činidlo proti starnutiu v kozmetických prípravkoch.

Kľúčové slová:xantón; Mangifera indica; starnutie; celagenáza; elastázu; tyrozináza; hyaluronidáza; in silico ADMET

1. Úvod

Proces starnutia je komplexný biochemický proces spojený s oxidačným stresom poháňaným endogénnymi kyslíkovými a dusíkovými voľnými radikálmi generovanými počas očakávanej dĺžky života, čo môže prispieť k progresii prejavov spojených s vekom [1]. Patológie starnutia pokožky, ako sú vrásky, hyperpigmentácia, starecké škvrny, vrásky, melazma, pehy, lentigo, ephelides, nevus, hnednutie a melanóm, sú spôsobené aktiváciou reaktívnych foriem kyslíka (ROS) [2]. Voľné radikály alebo ROS by mohli potenciálne vyvolať zmenu v štruktúrnom zložení kožných buniek a poškodiť bunkové membrány stimuláciou oxidácie lipidov a proteínov, čo vedie k poškodeniu DNA a bunkovej smrti [3,4]. Okrem toho ROS hrajú významnú úlohu v procese starnutia pokožky tým, že poškodzujú hlavné kožné proteíny, ako je kolagén a elastín, aktiváciou enzýmov kolagenázy a elastázy. Voľné radikály navyše spôsobujú degradáciu kyseliny hyalurónovej aktiváciou hyaluronidáz, čo vedie k nesprávnej hydratácii pokožky [5,6]. Predvídanie týchto dynamických procesov sa považuje za kľúčový problém v oblasti dermokozmetiky a na objavenie nových ochranných formulácií sa vynakladá značné množstvo výskumnej práce[7]. Antioxidanty sú prirodzené obranné enzýmy prítomné v pokožke a pôsobia proti nadmernej tvorbe voľných radikálov v tele. Oxidatívnu rovnováhu však môže narušiť niekoľko faktorov vrátane stravy a znečistenia ovzdušia, ktoré vedú k oxidačnému stresu. Pri tomto oxidačnom strese je zaťaženie organizmu voľnými radikálmi výrazne vyššie ako prírodnými antioxidantmi. Preto je veľmi dôležité používať externé antioxidanty zo zdrojov, ako je strava, kozmetika alebo liečivá, na neutralizáciu voľných radikálov a proti procesu starnutia pokožky [5,8]. Moderné štúdie odhalili, že viaceré prirodzené sekundárne metabolity, najmä flavonoidy a polyfenoly, významne prispievajú k celkovej antioxidačnej aktivite mnohých rastlín [9]. To viedlo k záujmu o skúmanie antioxidačnej aktivity mnohých rastlín [10]. Ovocie bolo hlásené pre svoje bohatstvo na tieto fenoly a flavonoidy, ako aj vitamíny [11].

Ak chcete vedieť viac, kliknite sem

Elastín predstavuje elastický proteín epidermálnych spojivových tkanív s kolagénom a predstavuje podstatnú úlohu pri prevencii vrások a pevnosti pokožky[12]. Počas starnutia buniek dochádza k zvýšenej regulácii matrixových metaloproteináz, ako je kolagenáza, elastáza a hyaluronidáza [13]. Potlačenie týchto enzýmov je jednou z najúčinnejších terapeutických stratégií na zvládnutie zhoršovania kožných stavov počas starnutia [14]. Fenolové zlúčeniny rastlinného pôvodu boli opísané ako silné bieliace mediátory vďaka svojim vlastnostiam inhibujúcim tyrozinázu [15] a niektoré (z nich by mohli hrať úlohu pri remodelácii matrice prostredníctvom inhibičného účinku na elastázu [16].

Mangifera indica L. je jednou z najdôležitejších jedlých rastlín, ktorá patrí do čeľade Anacardiaceae rozšírená v mnohých krajinách, najmä v tropických oblastiach [17]. Ovocie manga má významnú úlohu v poľnohospodárstve, potravinárstve, farmácii a výžive už viac ako 4000 rokov [18]. Okrem toho, mango je na 2. mieste medzi priemyselnými plodinami, po balane, čo sa týka produkcie a pokryvnosti [19]. Rôzne časti Mangifera indica predstavujú bohatý zdroj rôznych fytozložiek vrátane flavonoidov, xantonoidov, fenolových kyselín a triterpenoidov s potenciálnou hodnotou ako funkčné molekuly [18]. Okrem toho ovocie dodáva ľudskému telu životne dôležité zložky, ako sú sacharidy, bielkoviny, tuky, minerály, vitamíny, esenciálne aminokyseliny, karotenoidy, vláknina a fenoly [20]. Tradične rôzne kultúry uvádzali, že infúzia listov sa využívala pri niekoľkých ochoreniach, ako je hnačka, krvavá dyzentéria, anémia, astma, bronchitída, hypertenzia, nespavosť, reumatizmus, poruchy trávenia, hepatitída, tetanus, potrat a krvácanie [21]. Ďalej boli vdychované výpary z horiacich listov pri čkaní a chorobách hrdla [18]. Kôra sa používala ako diuretikum a do protireumatických obkladov. Semená sú dobre známe na liečbu prechladnutia, astmy, hnačky a krvácania. Bola hlásená antioxidačná aktivita, vysoký celkový obsah fenolov (TPC), celkový obsah flavonoidov (TFC), zachytávacia aktivita 2,2-difenyl-1-pikrylhydrazyl (DPPH) a inhibičná kapacita linoleovej kyseliny v častiach rastlín Mangifera indica [ 22].

Cistanche môže proti starnutiu

Táto štúdia bola navrhnutá na skúmanie in vitro inhibičných vlastností novej xantónovej zlúčeniny získanej zo 70 percent metanolového extraktu listov Mangifera indica L. proti kolagenáze, elastáze, tyrozináze a hyaluronidáze. Ďalej, farmakokinetické vlastnosti, ako je absorpcia, distribúcia, metabolizmus a toxicita (predikcia in silico ADMET) sa uskutočňovali pomocou SwissADME a Lipinského pravidla päť na posúdenie rozpustnosti liečiva, permeability a nevyhnutnosti formulácie.

2.Výsledky a diskusia

2.1. Objasnenie štruktúry izolovanej zlúčeniny

Získa sa zlúčenina vo forme žltých kryštálov (18,29 mg). Chromatografická analýza odhalila svetlo-oranžovo-žltú škvrnu na TLC pod dlhým UV svetlom (365 nm) v systéme rozpúšťadiel DCM:MeOH (7:3) a BAW. Keď sa škvrna ošetrila 1% metanolickým roztokom chloridu železitého, zmenila sa na tmavozelenú a rozprášeným roztokom amoniaku získala žltú. 1H-NMR, APT a HMBC spektrálne údaje zlúčeniny sú zhrnuté v tabuľke 1. 1H-NMR spektrálna analýza (DMSO-dg, izbová teplota) (obrázky SI a S2) odhalila prítomnosť dvoch downfield aromatických dubletových signálov pri OH. 7,57 a 6,79 s interakčnou konštantou 8,24 Hz, čo naznačuje prítomnosť dvoch orto-spojených protónov. Okrem toho aromatická oblasť H-NMR spektra ukázala prítomnosť singletového signálu pri Su 5,96, čo naznačuje prítomnosť jediného protónu v aromatickom kruhu. Anomérny protón C-glukozylovej jednotky bol detekovaný pri Su 4,60 ppm s hodnotou interakčnej konštanty 7 Hz priradenou pre -anomér. Tento vzor aromatických protónov v H-NMR spektre izolovanej zlúčeniny pripomína štruktúru xantónu. Okrem toho prítomnosť anomérneho protónu pri ou 4,60 s charakteristickým chemickým posunom glukózy pri 3,21 až 4,60 1H-NMR (cukrová oblasť) indikovala, že medzi cukrom a xantónom existuje C-glykozidická väzba. Ako je znázornené na obrázku S3, spektrum APT zlúčeniny odhalilo prítomnosť devätnástich uhlíkových signálov, ktoré predstavujú štruktúru xantónu a C-glukozidu.cistanche tubulosa recenzieExperiment APT identifikoval tri skupiny CH (C-8,131,95;C-7,115,10;C-2, 95,35 ppm) v xantónovej skupine a anomérnej C-1' C-glukózy pri SH75,13 ppm. Uskutočnili sme dvojrozmerné NMR experimenty (HMBC; obrázok S4), aby sme potvrdili glykozidickú väzbu C-glukózy na C-4xantónu. Bohaté korelačné signály 2,3JCH log-rozsahu potvrdili xantónovú kostru s pozorovanými krížovými vrcholmi od H-1'(6) 4,60) do C-4(6c 104,13 ppm) a C-3 (6c 158,95).citrusové bioflavonoidyPre xantónovú skupinu bola tiež detekovaná 2,3JCH korelácia s dlhým dosahom od H-2(8) po C-4(6c 104,13 ppm), C-3 (8c 158,95), a C-4b(6c 107,45). Okrem toho bola zistená 2-37-korelácia s dlhým dosahom od H-8(8)7,57) ku karbonylovej skupine C-9( 6c 195,14), C-8a(6c 131,22) a C-6 （6c161,87）. Pre ten istý kruh aJcH signály od H-7（6μ 6,79） do C{ {39}}a（6c 131,22） boli pozorované. Tieto korelácie sú znázornené v štruktúre zlúčeniny na obrázku 1. HSQC zlúčeniny ukázala 1JcH korelácie medzi každým protónom a jeho lokalizovaným uhlíkom, ako je znázornené na obrázku S5. Experiment H,H COZY (obrázok S6) odhalil silnú krížovú koreláciu medzi H-7 （δu 6,79）a H-8（8H7,57）. Ďalej zlúčenina odhalila pík pseudomolekulového iónu [MH]- pri m/z 421, čo ukazuje na molekulový vzorec CgHngOrin v negatívnom režime analýzy ESI-MS (obrázok S7). Údaje z 1H-NMR, APT, IH, H COSY, HMBC a HSQC nás viedli k predpokladu, že zlúčeninou by mohol byť 1,3,5,6-tetrahydroxyxantón-C-4- -D-glukopyranozid. Toto bolo potvrdené porovnaním s NMR údajmi o izomangiferíne uvádzanými v literatúre [23,24].

2.2. Predikcia farmakokinetiky in Silico izolovanej zlúčeniny

Online server SwissADME sa použil na posúdenie liekovej schopnosti izolovanej zlúčeniny odhadom Lipinského päťročného pravidla (RO5) pre podobnosť s liekom[25]. Lipinski uviedol, že 90 percent perorálne aktívnych liekov, ktoré dosiahli klinický stav fázy II, má MWT menšie alebo rovné 500,logp menšie alebo rovné 5, donory H väzby menšie alebo rovné 5 a akceptory H väzby menšie ako alebo rovná 10[26].SwissADME predpovedá ďalších šesť fyzikálno-chemických parametrov spojených s podobnosťou lieku, ako je lipofilita [27], veľkosť, polarita [28], rozpustnosť [29,30], flexibilita a saturácia [31,32]. ako je znázornené na obrázku 2 a tabuľke 2.cistanche UKGraf SWISSADME liekovej podobnosti izolovanej zlúčeniny ukázal, že väčšina fyzikálno-chemických vlastností zlúčeniny je v požadovanom rozsahu [33] s výnimkou počtu akceptorov H-väzieb, donorov H-väzieb a polarity zlúčeniny, pretože hodnota PSA je 201,28 A2 (požadovaný rozsah (medzi 20 a 130 A2)[28]. Túto vysokú polaritu možno pripísať prítomnosti cukrovej skupiny. Izolovaná zlúčenina vykazovala sľubnú predpovedanú topologickú rozpustnosť vo vode log S(Ali)[29 ] a Log S (ESOL)[30]. To uľahčí budúcu formuláciu tejto zlúčeniny. Predpokladaná farmakokinetika ukázala, že zlúčenina má nízku predpokladanú absorpciu GIT bez permeácie do BBB podľa modelu vareného vajíčka Dania [34] prijatého online server SwissADME[33].cistanche wirkungOkrem toho zlúčenina nevykazovala žiadne inhibičné účinky na päť izoforiem cytochrómu P450 (1A2,2C19,2C9,2D6 a 3A4) [35], čo poukazuje na nízku možnosť liekových interakcií. Predpokladaná permeácia kožou sa vypočíta pomocou viacnásobného lineárneho regresného modelu, ktorý koreluje veľkosť molekuly a lipofilitu s permeabilitou kože [36]. Čím negatívnejší je log Kp (s Kp v cm/s), tým je molekula menej priepustná pre kožu [33,36].extrakt z cistanche tubulosaPredpokladaný logaritmus permeácie kožou Kp v cm/s je -9,14 cm/s.

2.3. Hodnotenie vlastností proti starnutiu pokožky

2.3.1. Stanovenie anti-kolagenázových a anti-elastázových aktivít

Kolagén a elastín sú životne dôležité štrukturálne proteíny epidermis, ktoré spolu s kyselinou hyalurónovou udržujú elasticitu, kapilárny tonus a pevnosť kože [39]. Počas procesu starnutia vedie oxidačný stres a nadmerné vystavovanie sa UV žiareniu k aktivácii hydrolyzujúcich enzýmov, ako sú elastáza, kolagenáza a hyaluronidáza, čím sa stráca pevnosť a pružnosť pokožky a objavujú sa vrásky[40]] . Inhibícia aktivít kolagenázy a elastázy je jednou z účinných stratégií ochrany kože pred prejavmi starnutia kože [41]. Ako je objasnené na obrázku 3A, zlúčenina vykazovala mierne anti-kolagenázové vlastnosti s hodnotou IC50 419,10 ug/ml v porovnaní s fenantrolínom (IC50=182 0,80 ug/ml） ako štandardom). Pokiaľ ide o inhibičný účinok na elastázu (obrázok 3B), preukázal pozoruhodný účinok s hodnotou IC50 1,06 ug/ml, zatiaľ čo pozitívna kontrola, N-metoxysukcinyl-Ala-Pro-Val-chlórmetylketón, vykazovala hodnotu ICso 0,63 ug /ml. V súlade s týmito výsledkami predchádzajúca štúdia uviedla, že extrakt z listov metanolu z manga bol 10-krát silnejším inhibítorom elastázy než štandardný tokoferol, ktorý sa pripisuje nekompetitívnej inhibičnej vlastnosti mangiferínu[42]. Predchádzajúce správy ďalej dokázali antielastázovú aktivitu polyfenolových zlúčenín v dôsledku prítomnosti hydrofilných skupín, ako sú hydroxylové alebo karboxylové skupiny, ktoré by mohli pozitívne ovplyvniť kompetitívnu inhibíciu enzýmov [43].

2.3.2. Stanovenie antihyaluronidázových a antityrozinázových aktivít

Kyselina hyalurónová je prevládajúcim glykozaminoglykánom v pokožke, ktorý zachováva jej vlhkosť[44]. Je enzymaticky hydrolyzovaný hyaluronidázou, čo vedie k narušeniu integrity štruktúry kože a narušeniu priepustnosti tkaniva [45]. Potlačenie hyaluronidázy udržuje integritu pokožky, odďaľuje progresiu starnutia pokožky a zachováva hydratáciu pokožky [13]. Skoršie štúdie informovali, že prírodné inhibítory hyaluronidázy by mohli dobre slúžiť ako činidlá proti starnutiu pri vývoji produktov súvisiacich so zdravím pokožky[46]. Ako je znázornené na obrázku 4A, izolovaná zlúčenina mohla pozoruhodne zoslabiť hyaluronidázovú aktivitu s hodnotou IC50 1,65 ug/ml v porovnaní s 6-kyselinou O-palmitoyl-L-askorbovou ako pozitívnou kontrolou (2,55 ug/ml).

Medzi klinickými prejavmi starnutia kože môže byť hyperpigmentácia kože urýchlená enzýmom tyrozináza v prítomnosti reaktívnych foriem kyslíka (ROS) [46]. Tyrozináza, glykoproteín obsahujúci meď, hrá kľúčovú funkciu v syntéze melanínu prostredníctvom hydroxylácie L-tyrozínu na 3,4-dihydroxyfenylalanín (DOPA), po ktorej nasleduje oxidácia DOPA na DOPAchinón [47]. Preto potlačenie aktivity tyrozinázy potenciálne znižuje hyperpigmentáciu kože [48]. Z tohto pohľadu zlúčenina potenciálne inhibovala tyrozinázu s hodnotou ICso 0,48 ug/ml, v porovnaní s kyselinou kojovou ako pozitívnou kontrolou (0,82 ug/ml), ako je uvedené na Obrázok 4B. Predchádzajúca štúdia o extrakte zo semien Mangifera indica ukázala vynikajúce výsledky antityrozinázy a antihyaluronidázy korelujúce s obsahom polyfenolov [47]. Na molekulárnej úrovni tak tyrozín, ako aj DOPA obsahujú hydroxylové skupiny, ktoré sa prejavujú ako esenciálne donory protónov pre aktiváciu tyrozinázy [49]. Podobne zlúčenina obsahuje vo svojom skelete štyri hydroxylové skupiny, ktoré sa môžu správať ako kompetitívne inhibítory tým, že reagujú ako substráty na tyrozinázu.

3.Materiál a metódy

3.1. Rastlinný materiál

Čerstvé listy Mangifera indica L.leaves boli získané v štádiu plodenia zo súkromnej záhrady v oblasti Abo-Zabal (N 30 stupeň 1743.5336"E 3128.254), vláda Qualiobya, Egypt, 20. júla 2021. Boli láskavo overené Pani Treize Labib, špecialistka na taxonómiu z botanickej záhrady El-Orman, Gíza, Egypt. Poukazové exempláre s kódom PHG-P-MI-362 boli umiestnené v galérii Katedry farmakognózie, Farmaceutická fakulta Univerzity Ain Shams.

3.2. Extrakcia a chromatografická izolácia

Na vzduchu sušené listy Mangifera indica L. (1,56 kg) sa perkolovali v 70 percentnom metanole (27 1) počas 5 dní, potom sa prefiltrovali. Filtrát sa úplne odparil vo vákuu pri 47 stupňoch do sucha, čím sa získal vysušený zvyšok (90,36 g; 5,79 % hmotn./hmotn.); výťažok extrakcie sa vypočítal podľa nasledujúcej rovnice: [celková hmotnosť sušeného extraktu/celková hmotnosť čerstvej rastliny] × 100. Potom sa získaný extrakt aplikoval na frakcionáciu Diaion HP{12}}. Použila sa gradientová elúcia (voda/metanol). Získalo sa päť hlavných frakcií: 100 percent vody, 25 percent metanolu, 50 percent metanolu, 75 percent metanolu a 100 percent metanolu. Frakcia 50 percent rozpustná v metanole (26,38 g) bola vystavená polyamidu a eluovaná najprv 100 percentami vody, potom gradientovou elúciou zmesou voda/metanol (od 100:0 do 0:100, w/o), čím sa získalo šesť subfrakcií:100 percent vody, 20 percent, 40 percent, 60 percent, 80 percent a 100 percent metanolu. 40-percentná subfrakcia rozpustná v metanole (2,36 g) bola aplikovaná na Sephadex LH-20 s použitím MeOH (izokratická elúcia). A3(0.86 g) sa aplikoval na doštičky pre preparatívnu chromatografiu na tenkej vrstve (TLC) s použitím kyseliny butanooctovej:vody (BAW; 4:1:5) ako vývojky mobilnej fázy na izoláciu zlúčeniny ako ľahkého žltý amorfný prášok.

3.3. Spektrometer nukleárnej magnetickej rezonancie (NMR).

Spektrometer Bruker Ascend 400/R (Burker Avance Ⅲ, Fallanden, Švajčiarsko) bol použitý v Centre pre objavovanie, výskum a vývoj liečiv, Farmaceutická fakulta, Univerzita Ain Shams. 3.4. Hmotnostná spektrometria

Na hmotnostnú spektrometrickú analýzu sa použil hmotnostný spektrometer Finnigan LCQ-DECA (San Jose, CA, USA) pripojený k PDA detektoru. Vzorky sa rozpustili v HzO:MeOH ako zmes a vstrekli sa priamo do systému HPLC/ESI-MS. Negatívne aj pozitívne ESI ionizačné iónové módy boli aplikované za nasledujúcich podmienok: sušenie a rozprašovanie plynu, N2; kapilárna teplota, 250 stupňov; rozprašovacie napätie,4,48 kV; kapilárne napätie, 39,6 V; napätie trubicovej šošovky, 10.{9}} V; a režim úplného skenovania v hmotnostnom rozsahu m/z 100-2000. Analýza ESI-MS pre izolovanú zlúčeninu sa uskutočnila na hmotnostnom spektrometri Waters Xevo TQD s režimom UPLC Acquity (Milford, CT, USA) v Centre pre objavovanie, výskum a vývoj liečiv, Farmaceutická fakulta, Univerzita Ain Shams.

3.5. Predpoveď farmakokinetiky in-Silico

Lipinskiho pravidlo piatich, fyzikálno-chemických parametrov, ako je lipofilita, rozpustnosť a farmakokinetické vlastnosti, ako je absorpcia, distribúcia, metabolizmus a kožná permeácia izolovanej zlúčeniny GIT, boli vykonané pomocou online servera SwissADME [36]. 3.6. Hodnotenie vlastností proti starnutiu pokožky

3.6.1. Stanovenie anti-kolagenázovej aktivity

Inhibičná schopnosť izolovanej zlúčeniny proti aktivite kolagenázy bola hodnotená pomocou fluorometrickej súpravy na skríning inhibítorov kolagenázy (BioVision, katalógové č. K833-100) podľa vyššie opísanej metódy [50]. Referenčnou kontrolou bol (1,10)-fenantrolín. Testovaná zlúčenina a referenčná kontrola boli na analýzu pripravené v koncentráciách 1, 10, 100 a 1 000 ug/ml. Testovaná zlúčenina bola pripravená v 96-jamkovej platni s plochým dnom. Najprv sa kolagenázový substrát rozpustil v kolagenázovom testovacom pufri (CAB). Vzorka na analýzu bola pripravená zmiešaním zlúčeniny s kolagenázou a CAB. Príprava kontrolných vzoriek inhibítora sa uskutočnila zmiešaním inhibítora ((1,10)-fenantrolínu (80 mM)) so zriedeným kolagenázovým enzýmom a pufrom CAB. Enzýmová kontrola sa pripravila zmiešaním zriedenej kolagenázy s CAB. Ako kontrola pozadia sa použil CAB pufor. Všetky vzorky boli inkubované pri teplote miestnosti počas 15 minút. Počas tejto doby sa reakčná zmes pripravila zmiešaním kolagenázy s CAB. V nasledujúcom kroku bola reakčná zmes dôkladne premiešaná s pripravenými vzorkami. Fluorescencia sa okamžite merala pri excitačnej vlnovej dĺžke 490 nm a emisnej vlnovej dĺžke 520 nm s použitím čítačky mikrodoštičiek (FilterMax F5, Thermo Fisher). Meranie sa uskutočňovalo v kinetickom režime pri 37 stupňoch počas 60 minút. Vzorky sa pripravili dvojmo a inhibičný účinok testovanej zlúčeniny na kolagenázu sa vypočítal použitím nasledujúcej rovnice:

3.6.2. Stanovenie antielastázovej aktivity

Anti-elastázová aktivita zlúčeniny bola skúmaná pomocou EnzChek§Elastase Assay Kit (E-12056) podľa predtým opísanej metódy [51]. Testovaná zlúčenina a referenčná kontrola boli pripravené v koncentráciách 0.1, 10 a 100 ug/ml na analýzu. Zlúčenina sa pripravila na 96-jamkových doštičkách s čírym dnom na fluorometrický test. V stručnosti, roztoky enzýmu elastázy, substrát elastázy a kontrola inhibítora sa pripravili podľa odporúčania. Potom sa do jamiek pridal zriedený roztok elastázy. Testovaná zlúčenina, inhibítorová kontrola a enzýmová kontrola sa pridali do nasledujúcich jamiek. Vzorky sa zmiešali na trepačke a potom sa inkubovali 5 minút pri 37 stupňoch. Skúšobný pufor sa zmiešal so substrátom na prípravu fluorometrickej reakčnej zmesi, ktorá sa potom pridala a dôkladne premiešala s každou vzorkou. Fluorescencia sa merala okamžite pri excitačnej vlnovej dĺžke 400 nm a emisnej vlnovej dĺžke 505 nm s použitím čítačky mikrodoštičiek (FilterMax F5, Thermo Fisher, Waltham, MA, USA). Meranie sa uskutočňovalo v kinetickom režime pri 37 stupňoch počas 30 minút chránenom pred svetlom. Všetky testované vzorky boli pripravené a testované v duplikáte a inhibičný účinok testovanej zlúčeniny na elastázu bol vypočítaný použitím nasledujúcej rovnice:

kde:

△RFU=zmena relatívnych jednotiek fluorescencie EC=enzýmová kontrola

3.6.3. Stanovenie anti-tyrozinázovej aktivity

Inhibičné aktivity olejov sa testovali proti kolagenáze pomocou súpravy Abcam@Tyrozinase Inhibitor Screening Colorimetric Assay Kit (katalógové č. ab204715). Test sa uskutočnil podľa dodanej príručky. Štandardným inhibítorom tyrozinázy bola kyselina kojová. Testovaná zlúčenina bola pripravená na analýzu v koncentráciách v rozsahu od 0,1 do 10 ug/ml. Približne 2 ul poskytnutej tyrozinázy sa zmiešali so 48 ul pufra na testovanie tyrozinázy. Vzorky esenciálnych olejov alebo stojan (20 ul) sa zmiešali s enzýmovou zmesou （50 μl） a inkubovali sa pri 25 stupňoch počas 10 minút. Potom sa do jamiek esenciálnych olejov a štandardu pridalo 30 ul roztoku substrátu tyrozinázy. Potom sa platňa merala spektrofotometricky pri vlnovej dĺžke 510 nm počas 30-60 min pri 25 stupňoch.

3.6.4. Stanovenie antihyaluronidázovej aktivity

Hyaluronidázová aktivita bola hodnotená spektrofotometricky meraním množstva N-acetylglukozamínu vytvoreného z hyaluronátu sodného [52]. Testovaná zlúčenina a referenčná kontrola boli pripravené v koncentráciách v rozmedzí od 0,1 do 10 ug/ml na analýzu. Päťdesiat mikrolitrov bovinnej hyaluronidázy (7 900 jednotiek ml-1, (Sigma, St. Louis, MO, USA) rozpustených v 0,1 M acetátovom tlmivom roztoku （pH=3,5）) sa zmiešalo so 100 μl určeného koncentrácia zlúčeniny rozpustenej v 5 % DMSO a potom inkubovaná vo vodnom kúpeli pri 37 stupňoch počas 20 minút. Kontrolná skupina bola ošetrená 100 μl 5 % DMSO namiesto vzorky. Optická hustota reakčnej zmesi bola meraná pri 585 nm spektrofotometriou.

3.7. Štatistická analýza

Všetky experimenty sa uskutočnili trojmo. Údaje pre IC50 enzýmovej inhibičnej aktivity sa štatisticky skúmali použitím jednosmernej analýzy rozptylu (ANOVA). Štatistické analýzy boli vykonané pomocou GraphPad Prism 5.0. 4. Závery a perspektívy do budúcnosti

Prírodné produkty rastlinného pôvodu sú na globálnom trhu veľmi žiadané pre vývoj nových prostriedkov pre kozmeceutický dizajn[4]. V tejto štúdii bola z extraktu listov M. indica izolovaná nová xantónová zlúčenina, 1.3.5,6-tetrahydroxyxantón-C-4- -D-glukopyranozid. Na základe enzýmových inhibičných testov by táto zlúčenina mohla vykazovať dobré anti-kolagenázové, antielastázové, antihyaluronidázové a antityrozinázové vlastnosti, čím by prepožičiavala komplexný zoslabujúci účinok proti enzýmom súvisiacim so starnutím pokožky. Okrem toho fyzikálno-chemický parameter in silico a štúdia ADME podporujú jeho začlenenie do lokálnych dávkových foriem, pretože vykazuje sľubnú rozpustnosť vo vode a primerane predpovedanú penetráciu pokožkou. Preto by sa táto zlúčenina mohla použiť ako priaznivé multifunkčné bioaktívne činidlo pre nutraceutické a kozmeceutické prípravky. Napriek tomu sú toxikologické a klinické hodnotenia potenciálne sľubné.

Tento článok je extrahovaný z Molecules 2022, 27, 2609. https://doi.org/10.3390/molecules27092609 https://www.mdpi.com/journal/molecules