ELOVL2 podporuje progresiu rakoviny inhibíciou bunkovej apoptózy pri karcinóme obličkových buniek
Mar 20, 2022
Abstraktné. Renálnabunkový karcinóm (RCC) je agresívna genitourinárna malignita, ktorá sa spája so zlou prognózou, najmä u pacientov s metastázami, pričom jeho hlavnými podtypmi sú RCC z jasných buniek (ccRCC), papilárny PCC (pRCC) a chromofóbny RCC (chRCC). Prítomnosť intracelulárnych lipidových kvapôčok (LD) sa považuje za charakteristický znak ccRCC. Význam zmeneného metabolizmu lipidov pri ccRCC je široko uznávaný. Predlžovanie mastných kyselín s veľmi dlhým reťazcom (ELOVL) katalyzuje predlžovanie mastných kyselín (FA), moduluje zloženie lipidov a je potrebné pre normálne telesné funkcie. Účasť elongáz v RCC však zostáva nejasná. V tejto štúdii sa skúmala expresia ELOVL2 v ccRCC; najmä v primárnych nádoroch boli pozorované vysoké hladiny siedmich ELOVLisozýmov. Je potrebné poznamenať, že zvýšené hladiny expresie ELOVL2 boli pozorované v ccRCC, ako aj v pRCC a chRCC. Okrem toho vyššia hladina ELOVL2 bola významne spojená so zvýšeným výskytom zlej prognózy pacientov s ccRCC a pRCC. Zníženie ELOVL2 sprostredkované CRISPR/Cas{5}} malo za následok potlačenie predlžovania polynenasýtených mastných kyselín s dlhým reťazcom a zvýšenú produkciu LD vobličkovérakovinové bunky. Okrem toho ablácia ELOVL2 viedla k potlačeniu bunkovej proliferácie prostredníctvom indukcie apoptózy in vitro a oslabenia rastu nádoru in vivo. Celkovo táto štúdia poskytuje nový pohľad na mechanizmy proliferácie nádorov zahŕňajúce metabolizmus lipidov a naznačuje, že ELOVL2 môže byť atraktívnym novým cieľom pre terapiu RCC.
Kľúčové slová:karcinóm obličkových buniek, lipidové kvapôčky, bunková proliferácia, obličky, obličky
Úvod
Renálny bunkový karcinóm (RCC) je bežne sa vyskytujúca a letálna malignita, ktorá predstavuje ~ 2 percentá všetkých prípadov rakoviny a súvisiacich úmrtí na celom svete(1), pričom jeho hlavnými podtypmi sú RCC z jasných buniek (ccRCC), papilárny PCC (pRCC) a chromofób. RCC (RCC). Zo všetkých podtypov RCC je ccRCC najčastejším histologickým prejavom a jeho patogenéza je charakterizovaná konštitutívnou aktiváciou hypoxiou indukovateľných faktorov (HIF) v dôsledku straty funkcie v supresorovom géne von Hippel-Lindau (VHL). (1). Boli vyvinuté rôzne cielené terapie proti signalizácii vaskulárneho endotelového rastového faktora (VEGF) alebo cicavčieho cieľa rapamycínu (mTOR) a inhibítorov imunitného kontrolného bodu pre metastatické ochorenie. Progresia ochorenia je však u väčšiny pacientov nevyhnutná (1,2).
CISTANCHE ZLEPŠÍ DIALÝZU OBLIČIEK/RENÁL
Charakteristickým znakom ccRCC je množstvo intracelulárnych lipidových kvapiek (LD), ktoré pozostávajú z neutrálneho lipidového jadra obsahujúceho triglyceridy (TG) a estery cholesterolu (CE) obklopené fosfolipidovou monovrstvou (3). LD sú dynamické organely zodpovedné za príjem lipidov. a skladovanie a používajú sa na udržanie homeostázy, uľahčenie výroby energie a ochranu pred rôznymi typmi stresu alebo na udržanie membránovej biogenézy počas rýchleho rastu nádorových buniek pri niekoľkých typoch rakoviny (4). V skutočnosti predchádzajúce štúdie preukázali, že LD prispievajú k ccRCC progresia (5,6).
Uvádza sa, že mastné kyseliny (FA), ktoré tvoria hlavnú zložku lipidov, slúžia ako substráty na ukladanie energie, syntézu membrán a produkciu signálnych molekúl. Predĺženie a desaturácia sú ústrednými krokmi de Novo syntézy FA s dlhým reťazcom (LC-FA), dĺžka a stupeň nenasýtenia sú determinantmi funkcie FA a metabolického osudu (7). Stearoyl-CoA desaturáza 1 (SCD1), člen rodiny mastných acyl desaturáz, bola rozsiahle študovaná v ccRCC (6.8.9). Bolo preukázané, že zvýšená expresia SCD1 podporuje životaschopnosť, zatiaľ čo inhibítor SCD1 s malou molekulou (A939572) ukázalo sa, že potláča bunkovú proliferáciu v ccRCC (8.9). Navyše. Yang et al (10) preukázali, že proteín 1 viažuci sterolový regulačný prvok (SREBP1) podporoval desaturáciu lipidov prostredníctvom FA kyslej desaturázy 1 (FADSI) pred aktiváciou signalizácie NF-xB na podporu bunkovej proliferácie v ccRCC. Akékoľvek potenciálne úlohy elongáz v RCC však zostávajú nejasné.
Uvádza sa, že u cicavcov sú počiatočné a rýchlosť riadiace kondenzačné reakcie FA katalyzované rodinou elongázových enzýmov označovaných ako predlžovanie FA s veľmi dlhým reťazcom (ELOVL). Doteraz bolo identifikovaných sedem členov ELOVL, ktoré možno vo všeobecnosti rozdeliť na členov špecifických pre nasýtené a mononenasýtené mastné kyseliny (ELOVL1, ELOVL3, ELOVL6 a ELOVL7) alebo pre polynenasýtené mastné kyseliny (PUFA; ELOVL2, ELOVL4 a ELOVL5). Lucarelli et al (9) odhalili významnú akumuláciu PUFA a zvýšenú expresiu ELOVL2 a ELOVL5 v ccRCC. Je potrebné poznamenať, že sa preukázalo, že systémová kyselina dokosahexaénová (DHA) je endogénne produkovaná a riadi de novo lipogenézu a zároveň reguluje ukladanie lipidov spôsobom nezávislým na transkripčnom faktore 1 viažucom sterolové regulačné prvky (SREBPF1) v dôsledku ablácie ELOVL2 v myši (11). Okrem toho sa ukázalo, že nadmerná expresia ELOVL2 podporuje akumuláciu LD so zvýšeným vychytávaním FA v bunkách preadipocytovej bunkovej línie 3T3-LI a F442A (12). Predchádzajúce štúdie in vitro s DHA exogénne podávaným pre rakovinové bunky. preukázali, že DHA má protinádorové, protizápalové a proapoptotické účinky na rakovinové bunky (13-15). Akákoľvek potenciálna úloha ELOVL2 v progresii ccRCC prostredníctvom modulácie metabolizmu lipidov však zostáva do značnej miery nepreskúmaná.
V tejto štúdii sa skúmali úlohy progresie ELOVL2inccRCC vykonaním transkripčného profilovania primárneho ccRCC a normálnehoobličkyvzorky, čo ukazuje, že ELOVL2 je nadmerne exprimovaný v ccRCC a je nadmerne zastúpený medzi izozýmami ELOVL. Je potrebné poznamenať, že ELOVL2 bol tiež nadmerne exprimovaný v ccRCC, ako aj v pRCC a RCC, čo je významne spojené so zlou prognózou pacientov s CCR CCR pRCC. Okrem toho sa preukázalo, že inhibícia ELOVL2 ovplyvňuje metabolizmus lipidov a potláča bunkovú proliferáciu prostredníctvom podpory apoptózy, aspoň čiastočne prostredníctvom narušenia homeostázy endoplazmatického retikula (ER) vrakovina obličiekbunky. Výsledky tejto štúdie naznačujú, že ELOVL2 môže byť potenciálnym novým terapeutickým cieľom pre liečbu RCC.
CISTANCHE ZLEPŠÍ ZLYHAVOVANIE OBLIČIEK/RENÁL
Materiály a metódy
Bunkové línie a kultúry. Bunkové línie 293T (RCB2202) a OS-RC-2 (RCB0735) boli zakúpené od RIKEN BioResource Center, zatiaľ čo bunkové línie 786-O a ACHN boli zakúpené od ATCC; Bunky SK‑RC‑52 boli milým darom od DrJ.G.Old (Centrum pre rakovinu Memorial Sloan Kettering). Bunková línia RPTEC, ktorá je odvodená z epitelových buniek človekaobličkovéproximálny tubul, bol zakúpený od Lonza Group, Ltd. (CC-2553). Bunky ACHN, 786-O, SK-RC-52 a OS-RC-2 sa kultivovali v médiu RPMI-1640 doplnenom 10 percentným fetálnym bovinným sérom (FBS) pri 37 °C s 5 percentami zvlhčenej atmosféry CO2. Bunky 293T boli kultivované v Dulbeccovom modifikovanom Eagle médiu doplnenom 10 percentným fetálnym bovinným sérom (FBS) pri 37 °C s 5 percentami zvlhčenej atmosféry CO2. Bunky RPTEC boli kultivované vobličkovéepitelové rastové médium (REGM™) Bulletkit™ (CC-3190; Lonza Bioscience) pri 37 °C s 5-percentnou zvlhčenou atmosférou CO2.
Pacienti a vzorky ccRCC. Tkanivá RCC a priľahlé normálneobličkytkanivá od 46 pacientov, ktorí podstúpili radikálnu alebo čiastočnú nefrektómiu, boli získané z nemocnice University of Tsukuba v rokoch 2006 až 2015 podľa protokolov schválených etickou komisiou Univerzity v Cukube (číslo schválenia H28‑104). Všetci pacienti poskytli pred operáciou písomný informovaný súhlas. Nádorové štádiá boli priradené podľa TNM stagingu Union for International Cancer Control (16). Patologické stupne boli klasifikované podľa štvorstupňového Fuhrmanovho klasifikačného systému (17). Všetky charakteristiky pacientov sú zhrnuté v tabuľke SI extrakcia RNA a syntéza cDNA. Celková RNA bola extrahovaná zo zmrazených tkanív aobličkovérakovinové bunky pomocou TRIzol® Reagent (Thermo Fisher Scientific, Inc.). Po purifikácii RNA bola potom RNA reverzne transkribovaná do cDNA pomocou vysokokapacitnej cDNA reverznej transkripčnej súpravy (kat. č. 4368814; Thermo Fisher Scientific, Inc.), podľa pokynov výrobcu.
Reverzná transkripčne-kvantitatívna polymerázová reťazová reakcia (RT-qPCR). Úrovne génovej expresie sa kvantifikovali pomocou stroja 7500 Fast Real-Time PCR s Fast SYBR-Green Master Mix (Thermo Fisher Scientific, Inc.). Podmienky cyklovania boli nasledovné: Počiatočné udržiavanie pri 95 °C počas 20 sekúnd, 40 cyklov pri 95 °C počas 3 sekúnd a 60 °C počas 30 sekúnd, po ktorých nasledovala krivka topenia v rozsahu od 95 °C počas 15 sekúnd do 60 °C C počas 1 min. Hypoxantín fosforibozyltransferáza 1 (HPRT1) sa použila ako vnútorná kontrola. Všetky sekvencie primérov sú uvedené v tabuľke SII. Aby bolo možné vyhodnotiť gény súvisiace s apoptózou, relatívne hladiny expresie proapoptotických génov, Bcl‑2‑asociovaný X proteín (BAX), Bcl‑2 homológny antagonista/zabijak (BAK), forbol‑12‑myristát‑13‑ Analyzovali sa acetátom indukovaný proteín 1 (PMAIP1/NOXA) a p53 upregulovaný modulátor apoptózy (BBC3/PUMA) a antiapoptotický gén BCL2 a indukovaný gén diferenciácie buniek myeloidnej leukémie (MCL1). Relatívne hladiny génovej expresie boli kvantifikované pomocou metódy 2‑ΔACq (18).
Western blot analýza. Analýza Western blot sa uskutočnila tak, ako už bolo opísané (19). Bunky boli lyzované v lyzovacom pufri (20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 150 mM NaCI, 1 mM EDTA, 1 % SDS a inhibítor proteázy) a sonikované na ľade. Lyzáty sa centrifugovali pri 1,000 x g počas 20 minút pri 4 °C a supernatanty sa odobrali ako vzorky. Kvantifikácia proteínov vzoriek sa uskutočnila pomocou testu Quick Start Bradford Protein (kat. č. 5000202JA; Bio-Rad Laboratories, Inc.). Vzorky boli podrobené 10% SDS-PAGE a oddelené produkty boli následne prenesené na PVDF membrány.
CISTANCHE ZLEPŠÍ INFEKCIU OBLIČIEK/OBLIVÍN
Membrány sa blokovali blokovacím činidlom ECL Prime (kat. č. RPN418V; Cytiva) počas 60 minút pri teplote miestnosti. Membrány sa potom inkubovali cez noc pri 4 °C s nasledujúcimi protilátkami: Anti-serín/treonín-proteínkináza/endoribonukleáza, enzým vyžadujúci inozitol 1 (anti-IRE1; 1:200; #3294, Cell Signaling Technology, Inc.), anti-fosforylovaný IRE1 (anti-p-IRE1 ; 1:200; NB100-2323, Novus Biologicals, LCC), anti-C/EBP homológny proteín (anti-CHOP; 1:200; MA1-250, Thermo Fisher Scientific, Inc. .). Anti-králičí alebo anti-myší imunoglobulín G naviazaný na HRP, celé oslie Ab (kat. č. NA934V, NA931VS; GE Healthcare; Cytiva) sa použili v pomere 1:10,000 ako sekundárne protilátky. Western bloty sa vizualizovali pomocou ImmunoStar® Zeta (FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation) s použitím zobrazovača Fujifilm LAS-4000 a LAS400IR (FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation). ‑aktín bol použitý ako vnútorná kontrola (1:10 000, kat. č. A5316; Sigma-Aldrich).
Bioinformatická analýza génovej expresie. Klinické údaje a údaje o sekvenovaní RNA (RNA-seq) primárnych nádorov zozbierané od pacientov s RCC v databáze The Cancer Genome Atlas (TCGA) boli stiahnuté z dátového portálu Genomic Data Commons (GDC) (20). Celkovo bolo vyšetrených 1 005 (880 chorých a 125 kontrolných) vzoriek, z toho 530 chorých a 71 kontrolných vzoriek preoblička obličkovákohorta s jasnými bunkami (KIRC; ccRCC), 286 chorých a 31 zdravých vzoriek z krčka materniceoblička obličkovákohorta karcinómu papilárnych buniek (KIRP; pRCC) a 64 chorých a 23 zdravých vzoriek pre kohortu obličkových chromofóbov (KICH; chRCC). Expresia génu ELOVL2 vo vzorkách genitourinárnej rakoviny sa analyzovala pomocou databázy génovej expresie normálnych a nádorových tkanív (GENT2). Údaje o génovej expresii boli stiahnuté z verejného úložiska génovej expresie omnibus (GEO) platformy U133 Plus 2 (GPL570) (http://gent2.appex.kr/gent2/) (21).
Plazmidy a lentivírusová transdukcia. Malé vlásenkové RNA (shRNA) pre ELOVL2 charakterizované v predchádzajúcich štúdiách (22, 23) boli subklonované do lentivírusového vektora pLKO.1 (plazmid #8453; Addgene, Inc.). Oligonukleotidové sekvencie použité pri konštrukcii shRNA vektora sú uvedené v tabuľke SIII. Lentivírusy boli vytvorené v bunkách 293T kotransfekciou štyroch plazmidov in trans, vrátane lentivírusového vektora (pLKO‑shControl alebo pLKO‑shELOVL2), pMDLg/pRRE (plazmid #12251; Addgene, Inc.), pRSV-Rev (plazmid #12253 Addgene, Inc.) a pMD2.G (plazmid #12259; Addgene, Inc.) s použitím transfekčného činidla Lipofectamine 20}00® (Thermo Fisher Scientific, Inc.). 48 hodín po transfekcii sa supernatanty obsahujúce vírus odobrali a prefiltrovali cez 0, 45 μm filter na infekciu. Na vírusové transdukcie sa lentivírusy pLKO-shControl alebo pLKO-shELOVL2 inkubovali s bunkami 786-O, ACHN a SK-RC-52 cez noc pri 37 °C vo zvlhčenom inkubátore bunkovej kultúry. Bunky boli selektované v prítomnosti puromycínu 24 hodín po infekcii. Na stabilizáciu subklonov sa bunky kultivovali v médiu s puromycínom počas 1 mesiaca pri 37 °C vo zvlhčenom inkubátore bunkových kultúr a prežívajúce zásoby sa použili na analýzy expresie a proliferácie.
Pre experimenty s nadmernou expresiou boli bunky OSRC-2 transfekované prázdnym vektorom pCMV6 (plazmid #PS100001; Origene Technologies, Inc.) alebo pCMV6‑ELOVL2 (plazmid #RC209232;Origene Technologies, Inc.) pri 37 °C vo zvlhčenej bunkovej kultúre inkubátora s použitím transfekčného činidla Lipofectamine 3000® (Thermo Fisher Scientific, Inc.), podľa pokynov výrobcu. Bunky sa použili na uvedené testy 48 hodín po transfekcii. Dizajn a klonovanie CRISPR/Cas9. Plazmid pX330-U6-Chimérický_BB-CBh-hSpCas9 (pX330) bol darom od Feng Zhang (Addgene, Inc.; plazmid #42230) (24). Sekvencie CRISPR single-guide (sg) pre ELOVL2 boli špecificky zamerané na exón 2 (sgELOVL2 #1) a exón 3 (sgELOVL2 #2 a #3) ELOVL2 pomocou nástroja CRISPR Design Tool (GE Healthcare Dharmacon, Inc.;‑discovery.com/gene-editing/crispr-cas9/crispr-design-tool/), pred klonovaním do pX330. Sekvencia vedenia CRISPR pre kontrolu s jedným sprievodcom (sgControl) bola navrhnutá skôr (25). Oligonukleotidové sekvencie jednosmerných RNA (sgRNA) sú uvedené v tabuľke SIII
ACHN bunky sa potom naočkovali do 6-jamkových doštičiek (1,4x105 buniek/jamku) a o 2 hodiny neskôr sa kotransfekovali s 2 ug pX330-exprimovaných sgRNA a 0,2 ug pCI-neo vektora (Promega Corporation; kat. č. E1841) pri 37 °C vo zvlhčenom inkubátore bunkovej kultúry s použitím FuGENE HD (Promega Corporation; kat. č. E2312). 24 hodín po transfekcii sa aplikovalo 400 ug/ml G418 na 7 až 10 dní a bunky sa nechali zotaviť 2 alebo 3 dni. Keď sa bunky blížili ku konfluencii, znova sa riedko vysiali do 10 cm misiek. Po 2 alebo 3 týždňoch sa pomocou klonovacích diskov (MilliporeSigma; kat. č. Z374431‑100EA) izolovali rozoznateľné kolónie. Jednotlivé klony sa expandovali a vyhodnotili sa na stav knockoutu pomocou Sangerovho sekvenovania pre cieľovú oblasť.
CISTANCHE ZLEPŠÍ BOLESŤ OBLIČIEK/OBLIVÍN
Testy bunkovej proliferácie. Bunková proliferácia bola hodnotená pomocou MTT testu s Cell Counting Kit-8 (CCK-8; Dojindo Molecular Technologies, Inc.) podľa pokynov výrobcu. V stručnosti, bunky sa naočkovali do 96-jamkových doštičiek a po 72 hodinách sa pridalo 10 ul WST-8. OD460 sa meralo po 1-hodinovej inkubácii pri 37 °C. Subkutánny xenoštep. BALB/c nahé (nu/nu) samice myší (n=12; 6-8 týždňov staré) boli zakúpené od Charles River Laboratories, Inc.. Myši boli umiestnené v špecifických podmienkach bez patogénov, v h cyklus svetlo/tma, s ad libitným prístupom k potrave a vode. Pre subkutánne xenoštepové testy sa 1x107 buniek suspendovaných v 100 ul PBS subkutánne injikovalo do pravého boku pomocou 24G ihly a objemy nádorov sa merali raz týždenne. Objem nádoru sa vypočítal podľa vzorca: mm3=dĺžka x šírka x výška x 0,52 (26). Po 90 dňoch boli všetky zvieratá usmrtené a xenoštepové nádory boli vyrezané. Zvieratá boli anestetizované 2 percentami izofluránu pred usmrtením cervikálnou dislokáciou
Vzorky xenoimplantátových nádorov fixované vo formalíne a zaliate do parafínu (FFPE) boli pred deparafinizáciou a rehydratáciou narezané na rezy s hrúbkou 4 µm. Na získanie antigénu boli rezy vopred ošetrené mikrovlnami počas 21 minút v tlmivom roztoku kyseliny citrónovej. Po procedúre získania antigénu bola aktivita endogénnej peroxidázy blokovaná 3 percentami H2O2 počas 25 minút a sklíčka boli inkubované s protilátkou Ki-67 (1:200; Dako; Agilent Technologies, Inc.; M7240) pri 4 °C cez noc. Imunohistochemická reakcia bola vizualizovaná pomocou sekundárnej protilátky Histofine Simple Stain MAX PO® (Nichirei Biosciences, Inc, kat. č. 424151) s použitím diaminobenzidínu ako chromogénu. Všetky štúdie na zvieratách boli schválené Výborom pre experimenty na zvieratách Univerzity Tsukuba a všetky experimenty sa uskutočňovali v súlade so smernicami Predpisov pre experimenty na zvieratách Univerzity Tsukuba (schválenie č. 20‑370). Testy apoptózy. Apoptóza bola hodnotená pomocou Caspase-Glo® 3/7 Assay System (Promega Corporation; kat. č. G8090), farbiacej súpravy Annexin-V-FLUOS (Roche Diagnostics; kat. č. 11858777001) a JC-1 Mitochondrial Membrane Potential Testovacia súprava (Cayman Chemical Company; kat. č. 10009172) podľa pokynov výrobcu.
Farbenie LD. Bunky boli nasadené na sklenené krycie sklíčka v 60mm miskách a kultivované s médiom obsahujúcim kyselinu olejovú (200uM) pri 37 °C cez noc v inkubátore s 5 % CO2. Médium sa potom odsalo a bunky sa dvakrát premyli PBS pred fixáciou 4 percentným formaldehydom (FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation) počas 5 minút pri teplote miestnosti. Bunky sa potom dvakrát premyli PBS a inkubovali sa s 0,5 uM Lipi-Green (Dojindo Molecular Technologies, Inc.) počas 30 minút v tme pri 37 °C. Potom boli bunky dvakrát premyté PBS a krycie sklíčka boli pripevnené na sklenené sklíčka s použitím VECTASHIELD® Antifade Mounting Medium s DAPI (Vector Laboratories, Inc.; kat. č. H-1200). Obrázky zafarbených buniek sa získali fluorescenčným mikroskopom BZ-X710 (Keyence Corporation). Živé bunky sa inkubovali s 0,5 uM Lipi-Green v Hanksovom vyváženom soľnom roztoku (HBSS) počas 30 minút pred dvojnásobným premytím v HBSS, resuspendovali sa v 1 mM EDTA/PBS (pH 8,0) s 0,5 percentami BSA a nechali prejsť cez bunkové sitko. . Bunky sa analyzovali na prietokovom cytometri Gallios (Beckman-Coulter, Inc.) a údaje sa analyzovali pomocou softvéru FlowJo v10 (FlowJo LLC).
ER tracker farbenie. Bunky ACHN (ACHN/sgControl, ACHN/sgELOVL2‑1 a ACHN/sgELOVL2‑2) boli nasadené na sklenené krycie sklíčka v 6{{20}}-mm miskách a kultivované pri 37 °C počas 48 hodín v inkubátor s 5 percentami CO2. Médium sa potom odsalo a bunky sa dvakrát premyli HBSS pred fixáciou 4 percentným formaldehydom (FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation) počas 5 minút pri izbovej teplote. Bunky sa potom dvakrát premyli HBSS a inkubovali sa s 500 nM ER Tracker Red (Thermo Fisher Scientific, Inc.; kat. č. E34250) počas 2 hodín v tme pri 37 °C. Následne boli bunky dvakrát premyté PBS a krycie sklíčka boli pripevnené na sklíčka. Obrázky zafarbených buniek sa získali fluorescenčným mikroskopom BZ-X710 (Keyence Corporation). Živé bunky sa inkubovali s 500 nM ER Tracker v HBSS počas 30 minút pred dvojnásobným premytím v HBSS, resuspendovali sa v 1 mM EDTA/PBS (pH 8,0) s 0,5 percentami BSA a nechali prejsť cez bunkové sitko. Bunky sa analyzovali na prietokovom cytometri Gallios a údaje sa analyzovali pomocou softvéru FlowJo v10.
Plynová chromatografia-hmotnostná spektrometria (GC-MS). Extrakcia celkových lipidov z bunkových peliet sa uskutočnila tak, ako už bolo opísané (27). Uskutočnila sa hydrolýza a derivatizácia extraktov na metylestery FA (FAME). Pre vnútorné štandardy konjugovaných FA sú C20:4 (ω‑6), C20:5 (ω‑3), C22:5 (ω‑6), C22:5 (ω‑3) a C22 :6 (ω-3) FAME boli zakúpené od MilliporeSigma alebo Cayman Chemical Company. GC-MS analýza sa uskutočnila s použitím GCMS-TQ8040 (Shimadzu Corporation) s Omegawax® Capillary GC Column (MilliporeSigma; kat. č. 24136). Teplotný gradient sa spočiatku zvyšoval zo 70 na 150 °C rýchlosťou 20 °C za minútu a zo 150 na 280 °C rýchlosťou 8 °C za minútu a potom klesol z 280 na 200 °C rýchlosťou 15 ˚C za min. Vstreknutie vzorky sa uskutočňovalo v splitless režime s vstreknutým 1,0 ul vzorky. Pre MS analýzu bol zdroj iónov a teplota rozhrania nastavená na 200 °C a 270 °C. Dáta boli získané v režime úplného skenovania (30-600 m/z) pri 70 eV ionizačného napätia. FAME boli identifikované podľa retenčného času a spektra elektrónovej ionizácie-MS (EI-MS), ktorý sa zhodoval s referenčnými štandardmi FAME. Relatívne množstvo FAME sa vypočítalo porovnaním priemernej plochy píku na hmotnosť vzorky. Každá vzorka bola nezávisle meraná trikrát.
Štatistická analýza. Údaje sú vyjadrené ako priemer ± SD. Všetky štatistické analýzy sa uskutočnili pomocou softvéru JMP 10 (SAS Institute, Inc.), GraphPad Prism8 (GraphPad Software, Inc.) alebo balíka R (verzia 4.0.2; RStudio, Inc.). Významnosť rozdielov medzi týmito dvoma skupinami bola hodnotená pomocou nepárového Studentovho t-testu alebo Mann-Whitneyho testu. Významnosť rozdielov medzi tromi alebo viacerými skupinami bola hodnotená pomocou jednosmernej ANOVA s post hoc porovnaním s použitím Dunnettovho testu alebo Kruskal-Wallisovho testu, po ktorom nasledoval Dunnov post hoc test s Bonferroniho korekciou. Krivky prežitia boli skonštruované pomocou Kaplan-Meierovej metódy a rozdiel medzi krivkami bol vyhodnotený pomocou log-rank testu. Pacienti boli rozdelení do dvoch skupín, skupina s nízkou expresiou alebo skupinou s vysokou expresiou, pomocou hraničných hodnôt strednej expresie. P<0.05 was="" considered="" to="" indicate="" a="" statistically="" significant="">
Výsledky
ELOVL2 je vysoko nadmerne exprimovaný v RCC. Množstvo siedmich izoenzýmov ELOVL v zodpovedajúcich normálnych a nádorových tkanivách sa najprv skúmalo v tejto kohorte, pričom sa ukázalo, že hladiny expresie ELOVL1, ELOVL2, ELOVL5 a ELOVL7 boli zvýšené v tkanivách ccRCC (obr. 1A). Na potvrdenie týchto výsledkov sa skúmala expresia génu izoenzýmu ELOVL v zodpovedajúcich normálnych a nádorových tkanivách pomocou databázy TCGA (kohorta KIRC). Potvrdilo sa, že expresia ELOVL2 mRNA bola najviac a významne zvýšená v tkanivách ccRCC (obr. 1B; P<0.0001). subsequently,="" elovl2="" mrna="" expression="" was="" investigated="" further="" among="" three="" major="" histological="" subtypes="" of="" rcc="" using="" tcga="" database="" (kirc,="" kirp="" and="" kich="" cohorts).="" this="" revealed="" that="" elovl2="" was="" overexpressed="" in="" the="" prcc="" and="" chrcc="" tissues;="" however,="" its="" expression="" in="" ccrcc="" tissues="" was="" the="" highest="" among="" the="" histological="" subtypes="" (fig.="" 1c).="" moreover,="" the="" elovl2="">
hladiny expresie boli výrazne zvýšené v bunkových líniách ACHN, 786-O a SK-RC-52, hoci hladiny expresie mRNA v bunkovej línii OS-RC-2 boli nižšie v porovnaní s hladinami v bunkovej línii RPTEC (obr. 1D) . Následne sa pomocou databázy GENT2 skúmala zmena expresie génu ELOVL2 spojená s rakovinou u rôznych typov rakoviny (obr. 1E). V porovnaní s normálnymi tkanivami sa zistilo, že expresia ELOVL2 je výrazne vyššia vobličky, rakoviny prostaty, pľúc a hrubého čreva, zatiaľ čo expresia ELOVL2 bola podobná pri rakovine močového mechúra alebo prsníka. Tieto výsledky naznačujú, že úlohy izoenzýmov ELOVL sa líšia podľa typu rakoviny a že nadmerná expresia ELOVL2 môže byť spojená s karcinogenézou alebo progresiou ochorenia RCC, najmä ccRCC.
Nadmerná expresia ELOVL2 je spojená s progresiou RCC. Skúmala sa súvislosť medzi génovou expresiou ELOVL2 a štádiami metastáz v nádorových uzlinách (TNM) v kohorte KIRC, aby sa objasnil klinický význam ELOVL2 v ccRCC. Expresia ELOVL2 bola vyššia pri lokálne pokročilom a metastatickom ochorení, hoci jeho expresia nesúvisela so stavom metastáz v lymfatických uzlinách (obr. 2A-C). Súhrnne sa expresia ELOVL2 zvýšila podľa klinického štádia (obr. 2D). Následne sa vyhodnotila súvislosť medzi expresiou ELOVL2 a prognózou pacientov s RCC, aby sa objasnil klinický vplyv ccRCC. Podľa Kaplan-Meierovej analýzy sa ukázalo, že vysoká expresia ELOVL2 bola významne spojená so zlou prognózou v súčasnej kohorte (P=0.0015, obr. 2E). Na potvrdenie týchto výsledkov sa ďalej skúmala súvislosť medzi expresiou ELOVL2 a prognózou pacientov s ccRCC v kohorte KIRC a preukázalo sa, že podobne aj vysoká expresia ELOVL2 bola významne spojená so zlou prognózou (P<0,01, fig.="" 2f).="" moreover,="" a="" high="" expression="" of="" elovl2="" was="" significantly="" associated="" with="" a="" poor="" prognosis="" of="" patients="" with="" prcc=""><0.0001, fig.="" 2g).="" however,="" this="" was="" not="" observed="" in="" patients="" with="" chrcc="" (fig.="" 2h).="" in="" total,="" the="" aforementioned="" results="" indicated="" that="" elovl2="" may="" mediate="" ccrcc="" and="" prcc="" disease="" progression,="" at="" least="">
ELOVL2 podporuje proliferáciu buniek rakoviny obličiek. Na posúdenie funkcie ELOVL2 pri proliferácii buniek RCC sa uskutočnilo knockdown shRNA ELOVL2 v bunkách 786-O, ACHN a SK-RC-52. Účinky každej shRNA sa hodnotili pomocou RT‑qPCR a potvrdil sa významný pokles expresie ELOVL2 (obr. 3A). Potom sa uskutočnili MTT testy, aby sa preskúmali účinky knockdownu ELOVL2 na bunkovú proliferáciu. Pozorovalo sa, že knockdown ELOVL2 inhiboval proliferáciu všetkých buniek v porovnaní s bunkami transfekovanými kontrolnou shRNA (obr. 3B).
Naopak, nadmerná expresia ELOVL2 bola indukovaná v bunkách OS-RC-2, bunkovej línii s nižšou bazálnou expresiou ELOVL2. Účinnosť transfekcie bola hodnotená pomocou RT‑qPCR a bola potvrdená signifikantne zvýšená expresia ELOVL2 (obr. 3C). Testy MTT odhalili, že proliferácia buniek nadmerne exprimujúcich ELOVL2 bola významne podporovaná v porovnaní s kontrolnou skupinou (obr. 3D), čo naznačuje, že ELOVL2 môže byť promótorom proliferácieobličkovérakovinové bunky.
Ablácia ELOVL2 potláča rast nádoru in vivo, syntézu PUFA a produkciu LD vobličkovérakovinové bunky. Na ďalšie objasnenie úloh ELOVL2 v progresii RCC bola založená bunková línia ACHN s knockoutom ELOVL2 pomocou systému CRISPR/Cas9 (sgELOVL2-1 a sgELOVL2-2) (obr. S1). In vitro bola bunková proliferácia významne znížená abláciou ELVOVL2 v bunkách ACHN (obr. S1). Ešte dôležitejšie je, že ablácia ELOVL2 sprostredkovaná CRISPR/Cas9 potlačila rast nádoru, keď boli bunky implantované subkutánne myšiam (obr. 4A). Maximálne objemy subkutánnych xenoštepových nádorov v ACHN/kontrola a ACHN/sgELOVL2‑2 v deň usmrtenia boli 241 a 109 mm3, v danom poradí. Je potrebné poznamenať, že všetky xenoštepové nádory v skupine ACHN/sgELOVL2‑1 spontánne ustúpili 14 dní po transplantácii a neboli zistené v čase exstirpácie. Index Ki-67 sa skúmal aj u xenoštepových nádorov transfekovaných kontrolou alebo sgELOVL2 a pozorovalo sa, že bunky ACHN/sgELOVL2-2 vykazovali významne nižší index Ki-67 ako bunky ACHN/kontrolné bunky (obr. 4B a C). . Tieto výsledky ďalej podporili možnosť, že ELOVL2 zvyšuje rast nádoru in vivo. Keďže ELOVL2 sa nachádza na chromozóme 6p24.2 a kóduje transmembránový proteín endoplazmatického retikula, ktorý riadi predĺženie PUFA C20 – C24 (7), celkové hladiny FA sa potom vyhodnotili v bunkách ACHN/sgControl a ACHN/sgELOVL2 pomocou analýzy GC‑MS (obr. S2). Zmena hladín LC-PUFA je znázornená na obr. 4D. ELOVL2 je esenciálny enzým pri endogénnej produkcii kyseliny dokosahexaénovej (DHA, C22:6 n‑3) (28,29) a ako sa očakávalo, hladiny DHA sa výrazne znížili abláciou ELOVL2 vobličkovérakovinové bunky. Navyše,
množstvá iných druhov LC‑PUFA, vrátane kyseliny arachidónovej (AA, C20:4 n‑6), kyseliny eikozapentaénovej (EPA) a kyseliny dokozapentaénovej (DPA), boli tiež významne znížené. Na druhej strane, produkcia DPA sa v bunkách ACHN / sgELOVL2 konzistentne nezmenila. Množstvo DPA v bunkách ACHN bolo veľmi nízke a v niekoľkých vzorkách sa nezistilo (obr. S2). Pretože predchádzajúce štúdie preukázali, že ELOVL2 podporuje akumuláciu LD prostredníctvom produkcie DHA (11, 12), ukladanie LD sa ďalej hodnotilo pomocou farbenia neutrálnych lipidov. Za zmienku stojí, že množstvo LD v bunkách ACHN/sgELOVL2 sa výrazne znížilo v porovnaní s bunkami ACHN/sgControl (obr. 4E‑4G), čo naznačuje, že zmena metabolizmu lipidov nadmernou expresiou ELOVL2 môže ovplyvniť proliferáciu buniek RCC.
Ablácia ELOVL2 indukuje apoptózuobličkovérakovinové bunky. Predchádzajúce štúdie odhalili, že produkcia intracelulárnych LD podporuje apoptózu v stresujúcich nádorových mikroprostrediach (4). Preto v tejto štúdii bola apoptóza hodnotená v ACHN/sgControl alebo ACHN/sgELOVL2 bunkách a signifikantne zvýšená aktivita kaspázy 3/7 bola detegovaná v ACHN/sgELOVL2 bunkách (obr. 5A). Podobne bol identifikovaný väčší počet apoptotických buniek ACHN/sgELOVL2 v porovnaní s bunkami ACHN/sgControl, ako dokazuje farbenie Annexinom V/PI (obr. 5B). V závislosti od bunkového stresu vedie vnútorná apoptóza (30) k strate mitochondriálneho membránového potenciálu; teda táto štúdia ďalej hodnotila mitochondriálny transmembránový elektrický potenciál buniek ACHN/sgControl alebo ACHN/sgELOVL2 pomocou fluorescenčnej JC-1. Pomer agregát/monomér bol významne znížený v bunkách ACHN/sgELOVL2 (obr. 5C), čo naznačuje podporu mitochondriálnej transmembránovej polarizácie a aktiváciu vnútornej apoptotickej dráhy abláciou ELOVL2. Presnejšie, hladiny expresie proapoptotického génu (BAX, BAK, PUMA a NOXA) boli významne zvýšené, zatiaľ čo hladiny expresie antiapoptotického génu (BCL2 a MCL1) boli významne znížené v dôsledku ablácie ELOVL2 (obr. 5D). Tieto výsledky naznačujú, že ELOVL2 prispieva k prežitiu buniek prostredníctvom inhibície apoptózy buniek rakoviny obličiek
Degradácia kapacity ukladania lipidov vo forme LD môže viesť ku kolapsu homeostázy ER, čo spustí reakciu rozloženého proteínu (UPR) a bunkovú apoptózu (4, 5). Preto, aby sa podporila hypotéza zapojenia expresie ELOVL2 do homeostázy ER, uskutočnilo sa farbenie sledovača ER v bunkách ACHN / sgControl alebo ACHN / sgELOVL2. Následné ER zobrazenie (obr. 5E) a kvantifikácia pomocou prietokovej cytometrie (obr. 5F a G) indikovali ER expanziu v ACHN/sgELOVL2 bunkách v dôsledku ER stresu. Okrem toho ablácia ELOVL2 podporila fosforyláciu IRE1, aktivátora UPR senzorov (obr. 5H), zatiaľ čo expresiaCHOP, ktorý hrá hlavnú úlohu v apoptóze vyvolanej ER stresom, bol upregulovaný abláciou ELOVL2 (obr. 5H). Súhrnne tieto výsledky ukázali, že metabolizmus lipidov sprostredkovaný ELOVL2 potláča apoptózu buniek vobličkovérakovinové bunky a naznačili, že narušenie homeostázy ER môže byť potenciálnym mechanizmom indukcie.
Diskusia
Táto štúdia preukázala, že ELVOL2 môže meniť metabolizmus lipidov a podporovať rast nádoru prostredníctvom inhibície apoptózy buniek rakoviny obličiek. Okrem toho sa pozorovalo, že expresia ELOVL2 v tkanivách RCC bola zvýšená a to
vyššia expresia ELOVL2 bola významne spojená so zlou prognózou pacientov s RCC. K dispozícii sú obmedzené štúdie o úlohách ELOVL2 v progresii rakoviny (22, 31, 32) a ich výsledky sú kontroverzné. Simple et al (22) preukázali, že ELOVL2 podporuje syntézu LC-PUFA, podporuje účinnú signalizáciu EGFR a proliferáciu kmeňových buniek glioblastómu. Na rozdiel od toho Kang et al (31) uviedli, že ablácia ELOVL2 môže podporovať migráciu buniek a tvorbu kolónií buniek rakoviny prsníka a odhalili, že znížená expresia ELOVL2 bola spojená s horšou prognózou pacientov s rakovinou prsníka. Okrem toho Ding et al (32) uviedli, že ELOVL2 potláča proliferáciu buniek neuroblastómu a bol spojený s priaznivými mierami prežitia. Podľa protichodných zistení uvedených v predchádzajúcich štúdiách bola preukázaná viacúlohová funkcia ELOVL2 pri progresii rakoviny, ktorá sa jasne líši podľa typu rakoviny.
Zmenený metabolizmus lipidov výrazne ovplyvňuje progresiu rakoviny, čo je účinok pozorovaný vo výsledkoch tejto štúdie, čo je v súlade s výskumom zobrazujúcim úlohu ELOVL2 ako primárneho regulátora procesu predlžovania LC-PUFA a kritického enzýmu v biosyntéze DHA ( 7). V tejto štúdii sa preukázalo, že endogénne LC-PUFA,
vrátane AA a DHA, boli znížené v dôsledku ablácie ELOVL2 v bunkách rakoviny obličiek. V súvislosti s tým sa už skôr uvádzalo, že inhibícia AA dráhy inhibítormi lipoxygenázy (LOX) indukuje apoptózu a znižuje životaschopnosťobličkovérakovinové bunky in vitro (33,34). Aj keď výsledky nadmernej expresie ELOVL2 tejto štúdie sú v súlade s týmito mechanistickými zisteniami, už skôr sa uvádzalo, že podávanie DHA môže inhibovať proliferáciu a inváziu buniek rakoviny obličiek in vitro (35, 36). Je však známe, že LC-PUFA majú odlišné a kontrastné účinky na progresiu rakoviny. Preto zmena jemnej rovnováhy medzi rôznymi LC-PUFA v dôsledku inhibície ELOVL2 môže byť spojená s rôznymi fenotypmi pozorovanými pri rôznych typoch rakoviny. Predchádzajúce štúdie ukázali, že LD sa zvyšujú prostredníctvom endogénnej produkcie DHA pomocou ELOVL2 u myší (11, 12). Podobne sa zistilo, že ablácia ELOVL2 môže potlačiť produkciu DHA a LD v bunkách rakoviny obličiek, čo naznačuje, že nadmerná expresia ELOVL2 môže podporovať produkciu LD prostredníctvom endogénnej produkcie DHA v RCC. Rakovinové bunky sa často nachádzajú v drsnejších podmienkach prostredia (makro a mikro), vrátane hypoxie a nedostatku živín, no napriek tomu rýchlo rastú pri takýchto silných stresových faktoroch. Boli preukázané funkcie LD v podmienkach bunkového stresu, ako je udržiavanie energie a redoxnej homeostázy, regulácia autofágie, udržiavanie homeostázy ER a ochrana pred lipotoxicitou (4).
Ackerman et al (6) odhalili, že LD zabraňujú akumulácii toxických nasýtených lipidov počas hypoxie pufrovaním saturácie bunkových lipidov prostredníctvom výmeny nenasýtených FAs rezidentných v TG v ccRCC. Bunková lipotoxicita spôsobená nasýtenými MK (SFA), vrátane palmitátu (C16:0), môže spôsobiť apoptózu vedúcu k smrti rakovinových buniek (37,38). Nedávno bol ELOVL2 označený ako kritický enzým pre prežitie, ktorý pomáha pri prevencii apoptózy buniek vyvolanej glukolipotoxicitou (39). Je potrebné poznamenať, že rozdelenie lipidov modifikované osou ELOVL2 / DHA vedie k netoxickému využitiu palmitátu SFA uprednostňovaním jeho transportu do mitochondrií na oxidáciu FA (FAO) prostredníctvom mechanizmu závislého od CPT1. Okrem toho Balaban et al preukázali, že bunky rakoviny prostaty C4-2B a bunky rakoviny prsníka MCF-7 sú chránené pred apoptózou vyvolanou palmitátom mitochondriálnou FAO (37, 38). Počas palmitátom indukovanej lipotoxicity boli hlásené znížené bunkové hladiny antiapoptotických proteínov, vrátane BCL-2 alebo MCL-1 (40,41), zatiaľ čo hladiny proapoptotických proteínov, vrátane PUMA alebo NOXA, boli hlásené zvýšiť (42,43). V tejto štúdii sa ukázalo, že ablácia ELOVL2 môže podporovaťobličkovéapoptóza rakovinových buniek prostredníctvom zmeny pro- a anti-apoptotických génov podobným spôsobom. Tieto zistenia naznačujú, že ELOVL2 môže chrániť bunky pred apoptózou riadenou lipotoxicitou, aby podporil rast nádoru v RCC.
Okrem toho sa preukázalo, že ablácia ELOVL2 v RCC môže podporovať stres ER a upreguláciu CHOP, downreguláciu BCL-2 a MCL-1, zatiaľ čo upreguláciu BAK a BAX cestou závislou od mitochondrií (44). Výsledky tejto štúdie skutočne ukázali, že pro- a antiapoptotické gény boli podobne zmenené abláciou ELOVL2. V súlade so zisteniami v štúdii Qui et al (5), ktorí uviedli, že LD závislé od HIF2 / PLIN2 podporujú odolnosť proti stresu ER a prežitie buniek v ccRCC, tieto kolektívne zistenia podporujú ER stres podporujúci bunkovú apoptózu pomocou ELOVL2 ablácia vobličkovérakovinové bunky, zníženie LD a odstránenie bunkového pufra proti toxickým lipidom.
Záverom možno povedať, že táto štúdia po prvýkrát podľa našich vedomostí preukázala, že ELOVL2 podporuje rast nádoru inhibíciou apoptózy prostredníctvom predlžovania PUFA, aspoň čiastočne udržiavaním homeostázy ER vobličkovérakovinové bunky. Celkovo sa navrhlo, že LD indukované ELOVL2 môžu prispieť k progresii rakoviny v dôsledku viacerých ochranných účinkov proti bunkovému stresu v RCC. Okrem toho sa navrhlo, že ELOVL2 môže byť atraktívnym potenciálnym terapeutickým cieľom pre pacientov s RCC.
