Posilnenie antiangiogénnych účinkov delfinidínu pri zapuzdrení do malých extracelulárnych vezikúl, časť 2

Prosím kontaktujteoscar.xiao@wecistanche.comPre viac informácií

3.2. Metabolity delfinidínu v rámci sEV

Okrem delfinidínu (obrázok 2A) aj peonidínu-3-galaktozid(Retenčný čas=11,11 min, [M]' m/z=463,12404) (obrázok 2B) adelfinidín3-O- -rutinozid (retenčný čas=12,34 min, [M] m/z=611,16121) (obrázok 2C) boli zistené za týchto experimentálnych podmienok v sEV . Stopy týchto metabolitov boli tiež detegované v štandardnom roztoku delfinidínu. Analýza bola založená na presnej hmotnosti, hoci na potvrdenie tohto pozorovania je potrebný autentický štandardný roztok.

Ak chcete vedieť viac, kliknite sem

3.3. Účinky delfinidínu a delfinidínu naplneného sEV na proliferáciu HAoEC

Delfinidín samotný alebo naložený v sEV nemodifikoval životaschopnosť HAoEC počas 24 hodín pri koncentráciách 1 až 10 ug/ml (obrázok 3A).

VEGF (20 ng/ml), použitý ako pozitívna kontrola, nevýznamne zvýšil proliferáciu endotelových buniek (obrázok 3B). Natívne sEV (10 ug/ml) nemali žiadny účinok. Delfinidín inhiboval proliferáciu endotelových buniek spôsobom závislým od koncentrácie, pričom maximálny účinok sa dosiahol pri 10 ug/ml (obrázok 3B). Rovnakým spôsobom vyvolal delfinidín naplnený sEV koncentračne závislú inhibíciuendoteliálnybunkovej proliferácie. Je zaujímavé, že maximálna inhibícia sa dosiahla pri koncentrácii 5 ug/ml delfinidínu s naneseným sEV, čo je koncentrácia dvakrát nižšia ako pri samostatnom delfinidíne. Tieto výsledky naznačujú, že delfinidín naplnený sEV bol dvakrát účinnejší akodelfinidínsám.

3.4. Účinky delfinidínu a delfinidínu s obsahom sEV na produkciu NO

Ako je znázornené na obrázku 4, ATP（10μM）vyvolalo zvýšenie DAF-2fluorescenciailustruje produkciu NO v endotelových bunkách. Natívne sEV neovplyvnili hladinu NO. Samotný delfinidín zvýšil produkciu NO spôsobom závislým od koncentrácie, pričom maximálny účinok sa dosiahol pri 10 ug/ml. Delfinidínom nabité sEV tiež vyvolali koncentračne závislé zvýšenie produkcie endotelového NO. Je zaujímavé, že maximálny účinok delfinidínu naplneného sEV sa dosiahol pri 1 ug/ml, zatiaľ čo voľný delfinidín dosiahol tento účinok pri 10 ug/ml. Delfinidín naplnený sEV bol teda 10-krát účinnejší ako samotný delfinidín pri zvyšovaní produkcie NO.

3.5. Účinky delfinidínu a delfinidínu naplneného sEV na angiogenézu

HAoEC reštrukturalizovali a vytvorili kapilárne štruktúry (obrázok 5A, B). Natívne sEV nemali žiadny vplyv na tvorbu kapilárnych štruktúr. Ako už bolo opísané [6], samotný delfinidín znížil počet rozvetvení kapilárnych štruktúr v závislosti od koncentrácie, pričom maximálny účinok sa dosiahol pri 10 ug/ml so 40-percentným znížením. Je zaujímavé, že delfinidínom nabité sEV vykazovali silné zníženie počtu kapilárnych vetvení. Delfinidín v koncentrácii 0,1 ug/ml nanesený v rámci sEV už znížil počet vetvení o 60 percent a tento účinok bol väčší ako účinok získaný s 10 ug/ml samotného delfinidínu. Delfinidín naplnený sEV bol teda viac ako 100-krát účinnejší pri inhibícii angiogenézy ako samotný delfinidín.

Obrázok 5. In vitro test angiogenézy. (A) Reprezentatívne mikrofotografie tubulárnych štruktúr v kultivovaných HAoEC vystavených počas 24 hodín delfinidínu alebo sEV naplneným delfinidínom v rôznych koncentráciách. Zväčšenie: 40×. Z každej jamky boli analyzované štyri oblasti. (B) Stĺpcový graf ilustroval významný pokles percenta bodov vetvenia po ošetrení v porovnaní s ošetrením PBS (kontrola). Údaje sú uvedené ako priemer ± SEM zo šiestich nezávislých experimentov v porovnaní s kontrolou: a: p<0.0001><0.0001 vs.del=""><0.0001 vs.="" del=""><0.001 vs.=""><><0.05vs.del5;g:><0.05 vs.sev=""><0.001 vs.sevdel0.5="" and=""><0.0001 vs.sevdel="">

4. Diskusia

Súčasná štúdia ukazuje, že delfinidín naložený v sEV bol zjavne účinnejší ako voľný delfinidín, pokiaľ ide o jeho schopnosť uvoľňovať endoteliálny NO, inhibovať endoteliálnu proliferáciu a redukovať kapilárne štruktúry. Okrem delfinidínu nájdeného v sEV analýza metabolitov delfinidínu v sEV ukázala prítomnosť dvoch metabolitov (tj.delfinidín3-O--rutinozid a peonidín-3-galaktozid) prítomné vo vzorkách delfinidínu. Delfinidín sa teda degraduje na rovnaké metabolity vo svojej voľnej forme alebo po naplnení do sEV; tieto však boli účinnejšie pri pôsobení na endotelové bunky. Dôležité je, že keď je delfinidín (používaný ako všeobecný termín a zahŕňajúci prirodzené metabolity delfinidín 3-O-ß-rutinozid a peonidín-3-galaktozid) zapuzdrený do sEV, bol 2-násobne vyšší, {{8 }}násobne a 100-násobne účinnejšie ako voľný delfinidín, pokiaľ ide o endoteliálnu proliferáciu, endoteliálnu produkciu NO a tvorbu kapilár. Delfinidín naplnený sEV má teda účinky na rôzne kroky vedúce k angiogenéze. Tieto výsledky naznačujú, že sEV možno považovať za sľubnú dodávku delfinidínu ako inovatívny prístup k zacieleniu chorôb spojených so zvýšenou angiogenézou, vrátane rakoviny, aterosklerózy a diabetických retinopatií.

Cistanche môže zlepšiť imunitu

Zapuzdrenie polyfenolov na ich ochranu pred degradáciou je prirodzený jav. Skutočne sa ukázalo, že rastliny bohaté na polyfenoly produkujú EV nesúce tieto molekuly. Napríklad flavonoidový glykozid naringín a jeho metabolit, naringenín, sa nachádzajú v EV získaných z grapefruitu [12]. Okrem toho sa nanočastice odvodené z rastlín môžu použiť ako vektory pre iné molekuly, ktoré sú predmetom záujmu. V skutočnosti sa uvádza, že nanočastice odvodené od grapefruitu naplnené inhibítorom STAT3 inaktivujú STAT3 v nádorových bunkách GL26 a zlepšujú mieru prežitia myší [19]. Ďalšou stratégiou enkapsulácie polyfenolov je použitie vezikúl odvodených z buniek cicavcov. Nedávna správa hodnotila exozomálnu formuláciu antokyanidínov proti rôznym typom rakoviny [19]. sEV získané zo surového hovädzieho mlieka naplneného zmesou kyanidínu, delfinidínu, petunidínu, peonidínu a malvidínu zvyšujú antiproliferatívnu aktivitu antokyanidínov proti šiestim rôznym typom rakovinových buniek prostredníctvom inhibície TNFo-indukovanej aktivácie NF-kB [20] . Účinky sEV naplnených antokyanidínmi sú skutočne účinnejšie ako účinky získané voľnými antokyanidínmi. Táto metóda má výhody; zostáva však riskantná. Použitie EV z cicavčích buniek môže skutočne spôsobiť imunitné reakcie. sEV pochádzajúce z nezrelých ľudských dendritických buniek nevyvolali žiadnu toxicitu a nezrelá povaha dendritických buniek vyvolala nízku imunogenicitu [21,22]. Pokiaľ je nám známe, toto je prvýkrát, čo bola opísaná účinnosť načítania delfinidínu v rámci JAWS ⅡI sEV. Zavedenie delfinidínu do sEV (9 percent) chráni a pravdepodobne obmedzuje jeho degradáciu na metabolity za použitých experimentálnych podmienok. Zapojené mechanizmy si vyžadujú ďalšie štúdium. Metabolity nájdené v sEV, ako je delfinidín 3-O- -rutinozid alebo peonidín{18}}galaktozid, sa tiež nachádzajú v experimentoch in vivo s delfinidínom 14,15]. Predchádzajúce práce uvádzajú, že produkty degradácie delfinidínu majú silné biologické účinky, vrátane protirakovinových a protizápalových účinkov [20]. Spomedzi fenolových kyselín vzniká najmä kyselina galová degradáciou delfinidínu v kultivačnom médiu [23]. V tejto štúdii sme zistili, že metabolity detegované v delfinidíne naplnenom sEV boli identické s metabolitmi detegovanými vo voľnom delfinidíne [18]. Hoci presný podiel metabolitov zapuzdrených v týchto sEV nebol stanovený, boli účinnejšie na cieľové bunky ako samotné metabolity. Delfinidín a jeho metabolity boli teda pravdepodobne stabilnejšie a chránené pred degradáciou.

Už sme predtým uviedli, že v endotelových bunkách hovädzej aorty delfinidín stimuluje uvoľňovanie NO zvýšením intracelulárnych koncentrácií Ca2 plus prostredníctvom zvýšenia tvorby superoxidových aniónov. Toto bolo spojené so zvýšenou fosforyláciou tyrozínu niekoľkých intracelulárnych proteínov, čo malo za následok vazodilatáciu závislú od endotelu [24,25]. Delfinidín interaguje priamo s aktivačným miestom ER, čo vedie k aktivácii endotelovej NO-syntázy, produkcii NO a vazorelaxácii závislej od endotelu 4] V tejto štúdii bol delfinidín naplnený sEV 10-krát účinnejší ako voľný delfinidín; preto by bol pravdepodobne účinnejší pri korekcii NO-endoteliálnej dysfunkcie spojenej s kardiovaskulárnymi ochoreniami vrátane hypertenzie, mŕtvice alebo metabolických ochorení [3].

Už sme predtým uviedli, že upregulácia dráhy NO nie je zodpovedná za antiproliferatívny účinok delfinidínu. Delfinidín skutočne inhibuje proliferáciu endotelových buniek aktiváciou dráhy ERK{{0}}/-2, čo vedie k zastaveniu bunkového cyklu a akumulácii buniek vo fáze G0/G1 prostredníctvom down-regulácie expresia cyklínu A a D1 a upregulácia p27kip1 [6,7]. Zistili sme tiež, že delfinidín znižuje nádorový rast melanómových buniek in vivo pôsobením špecificky na proliferáciu endotelových buniek prostredníctvom inhibície signalizácie VEGFR2, MAPK, PI3K a na úrovni transkripcie na faktory CREB/ATF1 a inhibíciu fosfodiesterázy 2 [9]. V tejto štúdii boli sEV s obsahom delfinidínu dvakrát účinnejšie ako voľný delfinidín pri inhibícii proliferácie endotelu. Tieto výsledky teda naznačujú, že sEV s obsahom delfinidínu sú sľubným prístupom k prevencii patológií spojených s nadmernou endoteliálnou proliferáciou, a teda vytváraním vaskulárnej siete, ako je vývoj plakov a stabilita pri ateroskleróze a vývoj nádorov pri rakovine.

V súlade s týmito zisteniami sme ukázali, že delfinidín v experimentálnom modeli angiogenézy znižuje tvorbu podobnú kapiláram. Je zaujímavé, že keď je delfinidín zapuzdrený v rámci sEV (dokonca aj pri naplnení len 9 percent), bol 100-krát účinnejší ako voľný delfinidín pri znižovaní tvorby kapilár.

Obmedzenie štúdie: Antiangiogénny potenciál vykazovaný mnohými prírodnými zlúčeninami obsiahnutými v mnohých zložkách stredomorskej stravy, vrátane delfinidínu, robí tento stravovací vzorec obzvlášť zaujímavým ako zdroj chemopreventívnych činidiel definovaných v rámci stratégie angioprevencie. Toto nedávno zhodnotili Martinez-Podeva et al. [26]. Zdá sa, že delfinidín je rovnako účinný ako iné flavonoidy pri indukcii antiangiogénnych vlastností. Hoci sú antokyány v potrave bohaté, vo všeobecnosti a najmä delfinidín sa zle vstrebávajú. Jedným z dôsledkov slabej biologickej dostupnosti antokyanov je, že mnohé účinky pozorované in vitro (napr. inhibícia COX-2) sa pravdepodobne nevyskytnú in vivo, čo nie je prípad delfinidínu, na základe našich predchádzajúcich štúdií [{{ 5}}]. Na potvrdenie zvýšenia antiangiogénnych vlastností tohto prístupu in vivo sú však potrebné ďalšie štúdie využívajúce delfinidín zapuzdrený v sEV.

Stručne povedané, delfinidín naplnený sEV zvýšil účinnosť delfinidínu 100-násobne pre proliferáciu, 10-násobne pre NO a 2-násobne pre tvorbu kapilár. SEV teda buď chránili delfinidín a jeho metabolity pred degradáciou, alebo niektoré neidentifikované metabolity delfinidínu obsiahnuté v sEV boli účinnejšie. Rozdielna účinnosť získaná pre proliferáciu, produkciu NO a angiogenézu podporuje hypotézu, že delfinidínom nabité EV majú účinky na rôzne kroky vedúce k angiogenéze. Napriek tomu poskytujeme dôkaz, že sme optimalizovali účinnosť delfinidínu, pravdepodobne znížením jeho degradácie a zvýšením jeho dodávania, keď je zapuzdrený v EV. Delfinidínom nabité sEV teda predstavujú silný dodávací systém na zníženie angiogenézy v endotelových bunkách bez nežiaducich vedľajších účinkov, pretože je známa nízka biologická dostupnosť tejto zlúčeniny. Zdôrazňujeme inovatívnu terapeutickú stratégiu založenú na bioinžinierskych EV ako vektoroch delfinidínu, ktorá pomáha zvýšiť jeho potenciálny zdravotný prínos na zacielenie na choroby súvisiace s angiogenézou, vrátane rakoviny, ktorá by sa prípadne mohla rozšíriť na ďalšie choroby s nadmernou vaskularizáciou.

Tento článok je extrahovaný z Nutrients 2021, 13, 4378. https://doi.org/10.3390/nu13124378 https://www.mdpi.com/journal/nutrients