Vyhodnotenie a porovnanie štyroch kvantitatívnych sérologických testov SARS-CoV-2 u pacientov s COVID-19 a imunizovaných zdravých jedincov, pacientov s rakovinou a pacientov s imunosupresívnou terapiou

ABSTRAKT

Pozadie: Semikvantitatívne a kvantitatívne imunotesty sú najčastejšie používanou metodikou na hodnotenie imunity po imunizácii.

Ciele: Porovnať štyri kvantitatívne sérologické testy SARS-CoV{1}} u pacientov s COVID{2}} a imunizovaných zdravých jedincov, pacientov s rakovinou a pacientov s imunosupresívnou liečbou.

Študovať dizajn: Na vytvorenie úložiska sérologických vzoriek sa použilo 210 sérologických vzoriek z kohort infekcie COVID{1}} a očkovania. Sérologické metódy od štyroch výrobcov, menovite Euroimmun, Roche, Abbott a DiaSorin, boli hodnotené na kvantitatívne, semikvantitatívne a kvalitatívne merania protilátok. Všetky štyri metódy merajú protilátky IgG proti doméne viažucej sa na vrcholový receptor SARS-CoV{4}} a výsledky uvádzajú v jednotkách väzbových protilátok/ml (BAU/ml). Ako kritérium na určenie, či sú tieto dve metódy kvantitatívne klinicky ekvivalentné, bola zvolená celková prípustná chyba (TEa) ± 25 %. Semikvantitatívne výsledky (titre) boli odvodené pomocou numerickej koncentrácie protilátky vydelenej hraničnou hodnotou pre každú metódu. Výsledky: Všetky párové kvantitatívne porovnania preukázali neprijateľný výkon. S ±25 % ako TEa bola najlepšia zhoda 74 (35,2 % z 210 vzoriek) medzi Euroimmunom a DiaSorin, zatiaľ čo najnižšia zhoda bola 11 (5,2 % z 210 vzoriek) medzi Euroimmunom a Roche. Titre protilátok medzi všetkými štyrmi metódami boli významne odlišné (p < 0,001). Najvyšší rozdiel v titre z rovnakej vzorky je medzi Roche a DiaSorin s 1392-násobným rozdielom. Pri kvalitatívnom porovnaní žiadne z párových porovnaní neukázalo prijateľné porovnanie (p < 0,001).

Závery: Medzi štyrmi hodnotenými testami existuje slabá korelácia, kvantitatívne, semikvantitatívne a kvalitatívne. Na dosiahnutie porovnateľných meraní je potrebná ďalšia harmonizácia testov.

cistanche tubulosa - zlepšenie imunitného systému

1. Pozadie

Globálna pandémia SARS-CoV-2 trvá už viac ako dva roky a bolo podaných viac ako 12 miliárd dávok vakcín, pričom viac ako 600 miliónov ľudí je infikovaných COVID-19 na celom svete [1] . Health Canada (HC) a US Food and Drug Administration (FDA) schválili viaceré vakcíny na núdzové použitie (EUA), ako napríklad Moderna SpikeVax (mRNA-1273) a Pfizer-BioNTech Comirnaty (BNT162b2) [2, 3]. Koronavírusy majú štyri štrukturálne proteíny: spike proteín (S), nukleokapsid (N), obalový proteín (E) a membránový proteín (M) [4]. Proteín S, ktorý vyčnieva z obalu vírusu, je imunodominantný a pozostáva z dvoch podjednotiek: proteínu S1, ktorý obsahuje doménu viažucej receptor (RBD), a proteínu S2, ktorý sprostredkúva fúziu bunkovej membrány [5]. K dispozícii je viacero platforiem sérologického testovania proti rôznym antigénom SARS-CoV-2, ako je napríklad spike proteín (S) a nukleokapsidový proteín (N).

cistanche výhody pre mužov - posilnenie imunitného systému

Kliknite sem pre zobrazenie produktov Cistanche Enhance Immunity

【Požiadať o viac】 E-mail:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

Imunoanalýzy, napr. ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay), sú najčastejšie používanou metodikou hodnotenia imunity po imunizácii [6]. Pre väčšinu ostatných vakcín sa ako ochrana a imunita často volí univerzálna hraničná hodnota založená buď na semikvantitatívnom alebo kvantitatívnom imunoteste [6]. Ako preukázala vakcína proti rubeole, hraničná hodnota by sa mala nepretržite monitorovať a upravovať pomocou veľkých epidemiologických štúdií [7] a môže sa v jednotlivých krajinách líšiť [8]. Preto je dôležité, aby výsledky na rôznych analytických platformách boli porovnateľné a mohli správne definovať imunitu po imunizácii aj infekcii. Národný výbor vedcov klinických laboratórií (NCCLS) pravidelne publikuje usmernenia pre klinické laboratóriá, aby správne oznamovali výsledky testovania s ohľadom na imunitu po dosiahnutí vysokej úrovne zhody medzi rôznymi analytickými platformami [7,9]. U zdravých jedincov je známe, že humorálne odpovede by sa mohli významne zvýšiť s dodatočnými posilňovacími dávkami očkovania proti SARS-CoV-2 [10]. Navyše, humorálna odpoveď je slabá po imunizácii u imunokompromitovaných jedincov [11]. Výsledkom je, že sérologické metódy schválené na klinické použitie musia poskytovať presné výsledky so širokým dynamickým rozsahom protilátok od nízkej po vysokú hranicu.

Tabuľka 1 Charakteristika študovanej populácie.

2. Ciele

Porovnať štyri kvantitatívne sérologické testy SARS-CoV-2 u pacientov s COVID-19 a imunizovaných zdravých jedincov, pacientov s rakovinou a pacientov s imunosupresívnou liečbou pomocou vzoriek odobratých z prvej až štvrtej dávky očkovania. Vyhodnotili sme štyri sérologické testy označené na klinické použitie v rozšírenom dynamickom (merateľnom) rozsahu.

3. Návrh štúdie

3.1. Nábor, odber vzoriek a zber údajov

Od účastníkov sa získal súhlas a súhlas inštitucionálnej etickej komisie. Od mája 2021 do júla 2022 sme v Kingstone v Ontáriu v Kanade zaregistrovali zdravých jedincov, pacientov s rakovinou a pacientov s imunosupresívnou terapiou po jednej až štyroch dávkach očkovania proti COVID{2}}. Získali sa aj vzorky séra od hospitalizovaných pacientov s COVID{3}} prijatých do Kingston Health Sciences Center od februára 2021 do apríla 2022. Celkovo bolo 210 vzoriek vrátane 82 pozitívnych vzoriek na COVID{8}}a 128 vzoriek od imunizovaných jedincov. Posledne uvedené zahŕňa 42 vzoriek od zdravých jedincov, 44 od pacientov s rakovinou a 42 od pacientov s imunosupresívnou liečbou (23 od pacientov po transplantácii obličky a 19 od pacientov na inej imunosupresívnej liečbe). Imunosupresívna liečba u pacientov po transplantácii obličky pozostávala z trojitej liečby s inhibítorom kalcineurínu (takrolimus alebo cyklosporín), s antiproliferatívnym činidlom (mykofenolát, azatioprín, sirolimus alebo everolimus) a kortikosteroidmi. Imunizovaní účastníci dostali BNT162b2, AZD1222, mRNA-1273 alebo zmes vakcín od viacerých výrobcov. Spomedzi 128 vzoriek krvi od imunizovaných účastníkov bolo získaných 35, 70, 22 a 1 po prvej, druhej, tretej a štvrtej dávke imunizácie. Žiadni účastníci nedostali bivalentnú vakcínu. U hospitalizovaných pacientov s COVID{24}} bola ich infekcia potvrdená polymerázovou reťazovou reakciou (PCR)/analýzou génových mutácií vykonanou v Kingston Health Sciences Center podľa štandardného protokolu. Pozitívne aj negatívne výsledky PCR boli hlásené do databázy Public Health Ontario.

cistanche rastlina zvyšujúca imunitný systém

3.2. Kvantitatívne, semikvantitatívne a kvalitatívne meranie protilátok

Hodnotili sa štyri sérologické metódy vrátane Euroimmun Anti-SARS-CoV-2 QuantiVac ELISA (IgG) (číslo produktu: EI 2606- 9601-10 G), Abbott Architect AdviseDx SARS-CoV-2 IgG II ( číslo produktu: 6S60), Roche Elecsys Anti-SARS-CoV-2 S (číslo produktu: 09289267190) a DiaSorin LIAISON SARS-CoV-2 TrimericS IgG (číslo produktu: 311510). Testovanie 210 vzoriek bolo vykonané v troch akademických klinických laboratóriách technológmi lekárskych laboratórií. Testovanie sa uskutočnilo na prístrojoch od každého výrobcu sérologických testov, menovite EUROIMMUN Analyzer 1, Abbott ARCHITECT, Roche Cobas e602 a DiaSorin LIAISON. Všetky výsledky boli uvedené v jednotkách väzbovej protilátky/ml (BAU/ml). Všetky štyri metódy merajú protilátky IgG proti doméne viažucej vrcholový receptor SARS-CoV{19}} (S1). Semikvantitatívny titer protilátok IgG proti doméne viažucej sa na vrchol SARS-CoV-2 (S1) bol odvodený z kvantitatívneho merania protilátok. Titer sa určil vydelením kvantitatívnych hladín protilátok zodpovedajúcimi hraničnými hodnotami od každého výrobcu. Titre protilátok boli zaokrúhlené na celé číslo a tie väčšie ako 1 boli zahrnuté do porovnania. Kvantitatívne hladiny protilátok pre doménu SARS-CoV-2 S1 sa porovnávali s ich zodpovedajúcou pozitívnou hraničnou hodnotou, aby sa určil kvalitatívny výsledok testu, buď pozitívny alebo negatívny. Testovanie EUROIMMUN má hraničný rozsah (Väčší alebo rovný 25,6 až<35.2 BAU/mL); antibody results within the borderline range were excluded from the quantitative comparison. 

3.3. Prezentácia údajov a štatistická analýza

Prezentácia údajov a porovnanie kvantitatívnej metódy sa uskutočňovali pomocou EP Evaluator 12 (Data Innovations LLC, Spojené štáty americké). Na základe spoločných regulačných požiadaviek na imunologické testy sa ako kritérium na určenie, či sú tieto dve metódy klinicky ekvivalentné, zvolila povolená celková chyba (TEa) ± 25 %. Analýza semikvantitatívnych a kvantitatívnych porovnaní bola uskutočnená pomocou SPSS Statistics (IBM SPSS Statistics, Spojené štáty americké). U všetkých skupín sa zistilo, že nie sú normálne rozdelené (str< 0.001, Shapiro-Wilk normality test). The results were reported as medians and interquartile range (IQR). Friedman's and Pearson's Chi-Square tests were used to determine statistical significance between groups.

Tabuľka 2 Hlavné charakteristiky štyroch hodnotených imunotestov.

Obr. 1. Párové porovnania kvantitatívneho sérologického testovania.

4. Výsledky

4.1. Charakteristika študijného súboru

Demografické údaje a kvantitatívne hladiny protilátok účastníkov štúdie sú zhrnuté v tabuľke 1. Údaje pre kohortu očkovacej látky sú ďalej rozdelené na zdravých jedincov, pacientov s rakovinou a pacientov s imunosupresívnou liečbou (IST). Je znázornený dynamický rozsah kvantitatívnych hladín IgG protilátok proti SARS-CoV-2.

Obr. 2. Párové porovnanie zhody semikvantitatívneho sérologického testovania.

4.2. Charakteristika sérologických testovacích metód

Hlavné charakteristiky štyroch sérologických testovacích metód pre IgG proti proteínu SARS-CoV-2 S1 sú zhrnuté v tabuľke 2. Všetky štyri metódy sú schválené na použitie HC na klinické použitie a FDA pre EUA. Traja výrobcovia nastavili jednu hraničnú hodnotu predstavujúcu sérokonverziu, zatiaľ čo Euroimmun poskytuje hraničný rozsah (väčší alebo rovný 25,6 až<35.2 BAU/mL). 

4.3. Porovnanie kvantitatívneho merania protilátok

Obr. 1 ukazuje porovnania štyroch sérologických metód medzi 210 vzorkami, ktoré zahŕňali imunizované aj COVID{2}}pozitívne vzorky. Všetky párové porovnania preukázali neprijateľnú zhodu s použitím TEa ± 25 % ako kritéria. Najlepšia zhoda bola 74 (35,2 % z 210 vzoriek) medzi Euroimmunom a DiaSorin, zatiaľ čo najnižšia zhoda bola 11 (5,2 % z 210 vzoriek) medzi Euroimmunom a Roche. Obr. 1 tiež ukazuje model lineárnej regresie (štatistika Demingovej regresie) pre každé porovnanie so sklonom v rozsahu od 1,3 do 7,6. Ďalšia analýza založená na imunizovaných a COVID{17}pozitívnych vzorkách samostatne preukázala podobné výsledky, ktoré sú uvedené v doplnkových údajoch.

cistanche tubulosa - zlepšenie imunitného systému

4.4. Porovnanie semikvantitatívneho merania protilátok 

Obr. 2 predstavuje titre protilátok pre štyri sérologické metódy porovnávané párovým spôsobom s použitím 21 0 vzoriek. Titer protilátky každej vzorky sa vypočítal ako číselná koncentrácia protilátky vydelená hraničnou hodnotou pre každú metódu. Titre protilátok medzi všetkými štyrmi metódami boli významne odlišné (p < 0,001, Friedmanov test). Najvyšší rozdiel v titre z rovnakej vzorky bol medzi Roche a DiaSorin s 1392-násobným rozdielom. Ďalšia analýza založená na imunizovaných a COVID-19-pozitívnych vzorkách samostatne preukázala podobné výsledky, ktoré sú uvedené v doplnkových údajoch.

4.5. Porovnanie kvalitatívneho merania protilátok

Kvalitatívne porovnanie štyroch sérologických testovacích metód je zhrnuté v tabuľke 3. Zo 173 vzoriek, v ktorých bola dokonalá zhoda medzi všetkými štyrmi sérologickými metódami, 148 výsledkov bolo pozitívnych a 25 negatívnych. Bolo tam 31 vzoriek, v ktorých bola nezhoda aspoň medzi jednou zo štyroch testovacích metód. Tieto vzorky nesúhlasu boli ďalej kategorizované na základe toho, ktorý test poskytol zreteľný výsledok. Žiadne z párových porovnaní založených na kvalitatívnych výsledkoch nepreukázalo zhodu (p < 0,001, Pearsonov ChiSquare test).

Tabuľka 3 Dohoda o kvalitatívnom sérologickom testovaní protilátok.

5. Diskusia

Na základe poznatkov z iných očkovacích programov existuje viacero náhradných markerov na určenie imunity. Patria sem hladiny protilátok stanovené imunotestom, vírusovým a bakteriálnym neutralizačným testom, interferónovým testom a hemaglutinačným testom [6]. Monitorovanie bunkami sprostredkovanej imunitnej odpovede na vírusový antigén v laboratóriu je pracovne náročný postup. Vykonáva sa len v špecializovaných laboratóriách, napr. v moderných laboratóriách prietokového cytometra, a nepoužíva sa rutinne na klinické účely. Na rozdiel od toho, detekcia cirkulujúcich protilátok môže byť uskutočnená relatívne jednoducho použitím vysokovýkonných sérologických testov. Preto je semikvantitatívny (meranie titra protilátok) a kvantitatívny (meranie koncentrácie protilátok) imunotest najčastejšie používanou metodikou hodnotenia imunity po imunizácii [6].

Sérologické vyšetrenie je nevyhnutné na vyhodnotenie účinnosti očkovania proti SARS CoV-2 [12,13]. Od začiatku pandémie COVID-19 a najmä potom, čo sa celosvetovo stalo dostupné očkovanie proti SARS-CoV{5}}, bola publikovaná rozsiahla výskumná literatúra na vyhodnotenie humorálnych imunitných reakcií pomocou rôznych imunotestov [12,13]. Výsledky rôznych analytických metód by mali byť porovnateľné, aby bolo možné správne pochopiť závery z rôznych publikácií. Okrem toho, na spoľahlivé vyhodnotenie účinnosti imunizácie SARS-CoV-2 na klinické účely je dôležité vyvinúť robustné imunologické testy a vykonať rozsiahle porovnávanie a štandardizáciu metód. Keď sa vyžaduje vysoká úroveň zhody medzi rôznymi metódami, môže sa zvoliť hranica založená na semikvantitatívnych alebo kvantitatívnych testoch na SARS-CoV-2, ktorá predstavuje ochranu a imunitu.

Naša štúdia preukázala slabé zhody medzi štyrmi sérologickými metódami schválenými na klinické použitie Health Canada a FDA, vyrábané spoločnosťami Euroimmun, Abbott, Roche a DiaSorin. Keďže TEa zatiaľ nie je známy pre sérologické reakcie SARS-CoV-2, svojvoľne sme vybrali ±25 %, čo sa bežne používa pri iných imunotestoch. Pri použití tohto kritéria boli pozorované slabé zhody vo všetkých porovnaniach medzi akýmikoľvek dvoma metódami. Hoci porovnanie medzi Euroimmunom a DiaSorinom je lepšie ako akékoľvek iné porovnania, iba 35,2 % z 210 vzoriek sa považovalo za prijateľné. Semikvantitatívne, po prevedení kvantitatívnych výsledkov na titre vydelením kvantitatívnych hladín protilátok zodpovedajúcimi hraničnými hodnotami od každého výrobcu, sa titre akýchkoľvek dvoch metód významne líšili (p < 0,001). Najvyšší rozdiel v titre bol medzi Roche a DiaSorin s 1392-násobným rozdielom. Je zrejmé, že súčasné dostupné sérologické metódy sa výrazne líšia kvantitatívne aj semikvantitatívne a nemôžu poskytnúť výkon potrebný na bežné klinické použitie. Okrem toho, keď sme vo výsledkoch aplikovali medzné hodnoty sérokonverzie a určili sme pozitívne miery vo všetkých štyroch metódach v 210 vzorkách, boli významné štatistické rozdiely (p < 0,001) v akýchkoľvek dvoch porovnávaných metódach.

cistanche tubulosa - zlepšenie imunitného systému

V novembri 2020 Svetová zdravotnícka organizácia (WHO) vytvorila medzinárodný štandard a referenčný materiál pre anti-SARSCoV-2 imunoglobulín (kód NIBSC 20/136) [14]. Cieľom tohto referenčného materiálu je harmonizovať hodnotenie humorálnej imunitnej odpovede po prirodzenej infekcii alebo očkovaní. Všetky štvrté hodnotené metódy sú nadväzné na tento referenčný materiál a ich výsledky by sa mohli uvádzať v BAU/ml, čo je jednotka odporúčaná WHO. Euroimmun vo svojom inštrukčnom dokumente uvádza koreláciu s týmto referenčným materiálom s R2=0.99. Nie je jasné, prečo bola v našej štúdii pozorovaná slabá zhoda. V júli 2022 WHO poskytla druhý medzinárodný štandard pre imunoglobulín anti-SARS-CoV-2 a referenčný panel pre protilátky proti variantom SARS-CoV-2, ktoré vzbudzujú obavy [15]. Aplikácia tohto nového referenčného materiálu by pravdepodobne mohla zlepšiť zhodu meraní protilátok, najmä v prípade vzoriek pozitívnych na COVID{15}}. Na záver sme zistili zlú koreláciu medzi všetkými hodnotenými testami, kvantitatívne, semikvantitatívne a kvalitatívne. Na dosiahnutie porovnateľných meraní je potrebná ďalšia harmonizácia testov.

Referencie

[1] Štatistika a výskum Očkovanie proti koronavírusu (COVID-19). https://ourworldindata.org/covid-vaccinations, (prístup 3. augusta 2022).

[2] Health Canada, Schválené vakcíny proti COVID{1}} (dostupné 3. augusta 2022). https://www.canada.ca/en/health-canada/services/drugs-health-products/ covid19-industry/drugs-vaccines-treatments/vaccines.html.

[3] Úrad pre potraviny a liečivá USA, "COVID-19 Vaccines," (prístup 3. augusta 2022). https://www.fda.gov/emergency-preparedness-and-response/ coronavirus-disease-2019-vakcíny na covid-19/covid{10}}.

[4] J. Cui, F. Li, Z.-L. Shi, Pôvod a vývoj patogénnych koronavírusov, Nat. Microbiol. 17 (3) (2019) 181–192.

[5] H. Bisht, A. Roberts, L. Vogel, A. Bukreyev, PL Collins, BR Murphy, K. Subbarao, B. Moss, Ťažký akútny respiračný syndróm koronavírusový spike proteín exprimovaný oslabeným vírusom vakcínie protektívne imunizuje myši, Proc. . Natl. Akad. Sci. USA 101 (17) (2004) 6641–6646.

[6] SA Plotkin, Koreláty ochrany vyvolanej očkovaním, Clin. Vaccine Immunol. 17 (7) (2010) 1055–1065.

[7] Národný výbor vedcov z klinických laboratórií (NCCLS). Detekcia a kvantifikácia protilátky IgG proti rubeole v klinickom laboratóriu; Schválené usmernenie. 1997 Wayne, PA.

[8] Z. Gao, JG Wood, MA Burgess, RI Menzies, PB McIntyre, CR MacIntyre, Modely stratégií kontroly rubeoly a vrodeného rubeolového syndrómu – 40-ročné skúsenosti z Austrálie, vakcína 31 (4) (2013) 691–697.

[9] Národný výbor vedcov z klinických laboratórií (NCCLS). Hodnotiace a výkonnostné kritériá pre viaczložkové testovacie produkty určené na detekciu a kvantifikáciu protilátky IgG proti rubeole, I/LA6-T, predbežné usmernenie. 1985 Wayne, PA.

[10] K. Macrae, CY Gong, P. Sheth, J. Martinez-Cajas, Y. Gong, Kvantitatívna analýza sérologických odpovedí SARS-CoV-2 po troch dávkach imunizácie a pred prelomom COVID{{4 }} infekcie, Vaccines 10 (10) (2022) pp, https://doi.org/ 10.3390/vaccines10101590.

[11] A. Robinson, A. Mazurek, M. Xu, Y. Gong, Kvantitatívna analýza stavu protilátok proti SARS-CoV-2 medzi pacientmi s rakovinou a zdravými jedincami s predĺženými intervalmi medzi dávkami očkovania v Kanade, Curr. Oncol. 29 (1) (2022) 68–76, https://doi.org/10.3390/curroncol29010006.

[12] PM Folegatti, et al., Bezpečnosť a imunogenicita vakcíny ChAdOx1 nCoV-19 proti SARS-CoV-2: predbežná správa fázy 1/2, jednoducho zaslepená, randomizovaná kontrolovaná štúdia , Lancet 396 (10249) (2020) 467–478.

[13] LA Jackson, EJ Anderson, NG Rouphael, PC Roberts, M. Makhene, RN Coler, MP McCullough, JD Chappell, MR Denison, LJ Stevens, AJ Pruijssers, A. McDermott, B. Flach, NA Doria-Rose, KS Corbett, KM Morabito, S. O'Dell, SD Schmidt, PA Swanson, M. Padilla, JR Mascola, KM Neuzil, H. Bennett, W. Sun, E. Peters, M. Makowski, J. Albert, K. Cross, W. Buchanan, R. Pikaart Tautges, JE Ledgerwood, BS Graham, JH Beigel, Predbežná správa mRNA vakcíny proti SARS-CoV-2 -, N. Engl. J. Med. 383 (20) (2020) 1920–1931.

[14] Mattiuzzo. a kol. Založenie Medzinárodného štandardného a referenčného panelu WHO pre protilátky proti SARS-CoV-2. 2020.(https://www.who.int/publications/m/it/WHO-BS-2020. 2403).

[15] WHO/BS/2022.2427: Zriadenie 2. medzinárodného štandardu WHO pre imunoglobulín anti-SARS-CoV-2 a referenčný panel pre protilátky proti variantom SARS CoV-2, ktoré sú predmetom záujmu. https://www.who.int/publications/m/item/who-bs- 2022.2427 (prístup 30. novembra 2022).