Hodnotenie expozície amoniaku a dusíka v imunitných obranách prítomných na slezine a hlave a obličkách pleskáča wuchangského (Megalobrama Amblycephala)
Nov 13, 2023
Abstrakt:Amoniak je jedným z najdôležitejších environmentálnych faktorov vo vodných ekosystémoch. Existujú však obmedzené štúdie o účinkoch chronického alebo dlhodobého stresu z amoniaku a jeho potenciálneho molekulárneho mechanizmu u rýb. Cieľom tejto štúdie bolo preskúmať imunitnú odpoveď a molekulárne mechanizmy v slezine a hlave-obličkách rýb po chronickej expozícii amoniaku.Megalobrama amblycephala(9.98 ± {{0}}.48 g) bol vystavený rôznym koncentráciám celkového amoniakálneho dusíka (0–30 mg/l) počas 30 dní. Expozícia amoniaku spôsobila významné zvýšenie hladín kortizolu a zníženie koncentrácií lyzozýmu a komplementu o 3/4 v sére, čo naznačuje inhibičné účinky stresu z amoniaku na vrodené imunitné reakcie. Expozícia amoniaku tiež vyvolala zvýšenie koncentrácie amoniaku v tkanive závislé od koncentrácie, patologické poškodenie a indexy sleziny a hlavy a obličiek. Okrem toho obsah imunoglobulínu M (IgM), interleukínu 1 (IL-1 ) a tumor nekrotizujúci faktor (TNF- ), ako aj hladiny mRNA signálnych molekúl nezávislých od toll-like receptorov (TLR)/myeloidného diferenciačného faktora 88 (MyD88) v slezine a hlave a obličkách boli po expozícii amoniaku výrazne znížené. Naše zistenia naznačujú, že chronická expozícia amoniaku spôsobila potlačenie vrodených a adaptívnych imunitných reakcií prostredníctvom downregulácie TLR/MyD88-nezávislej signalizácie. Nepriaznivé vplyvy chronického amoniakového stresu boli závažnejšie v slezine ako v hlavovej obličke.
Kľúčové slová: amoniak; stres; mýtne receptory; slezina; hlava-oblička; imunita
KLIKNITE SEM A ZÍSKAJTE BYLINKOVÉ CISTANCHE PRE OBLIČKY
1. Úvod
Ammonia is one of the most important environmental factors in aquatic ecosystems that affect the growth and health of aquatic animals [1]. Ammonia nitrogen generally comes in one of two ionized forms—NH4 + and the un-ionized form, NH3, in the aquatic environment. NH3 is extremely toxic to fish by reason of its ability to diffuse across cell membranes easily [2–4]. Over the past decades, high levels of ammonia frequently occur in aquatic environments due to disorderly discharges of sewage effluent, agricultural run-off, and high-density aquaculture [5–7]. Although the recommended level of ammonia nitrogen in drinking water is up to 3 mg/L (NH4/L) [8], the real ammonia level can reach much higher (>20 mg/l) niekedy z dôvodu neúčinného alebo neexistujúceho čistenia odpadových vôd alebo z iných dôvodov [9,10].
Bolo dokázané, že imunosupresívne účinky amoniaku u rýb prispievajú k prepuknutiu chorôb [11,12]. V niektorých štúdiách na Takifugu rubripes, Scophthalmus maximus a Pelteobagrus fulvidraco by akútna expozícia amoniaku mohla zvýšiť hladinu génovej expresie aktivačného faktora B-buniek, proteínu tepelného šoku 70/90, tnf- a interleukínu- 1/1 /6/ 8/12 [13–15]. Wang a kol. tiež uviedli, že aktivity sérového lyzozýmu sa významne znížili u Acanthopagrus schlegelii po 24 hodinách expozície amoniaku [16]. Podobne znížené hladiny mRNA komplementu C3 a IgM boli pozorované v slezinách Pelteobagrus vachellii a Rhynchocypris lagowski pri akútnej expozícii amoniaku [17,18]. Hoci sa veľa pozornosti venovalo účinkom akútnej expozície amoniaku na imunitu rýb, existujú len obmedzené štúdie o účinkoch chronického alebo dlhodobého stresu z amoniaku a jeho potenciálnom molekulárnom mechanizme. Okrem toho niektorí výskumníci prostredníctvom transkripčnej analýzy hlásili nepriaznivé účinky amónneho dusíka na expresiu mRNA TLR [16,19–22]. V dôsledku toho predpokladáme, že pretrvávajúca expozícia amoniaku môže tiež ovplyvniť imunitu rýb, v ktorej môže hrať dôležitú úlohu signálna dráha TLR.
Slezina a hlavová oblička sú hlavnými imunitnými orgánmi teleostových rýb, ktoré sú zodpovedné za zachytávanie a čistenie cudzích častíc a udržiavanie stabilného vnútorného prostredia [23,24]. Sú tiež hlavnými miestami, kde sa vytvárajú imunitné protilátky [25–27]. Okrem toho sa vrodený imunitný systém rýb skladá z fixných a mobilných buniek, ako aj zo širokého spektra obranných molekúl (ako je lyzozým, komplement a cytokíny) [28,29]. Bream Wuchang (Megalobrama amblycephala) je cyprinidová ryba pochádzajúca z povodia Yangtze v Číne, ktorá bola v roku 2014 na 11. mieste na svete v celkovej ročnej produkcii tejto ryby [30]. Ako hlavný druh akvakultúry je M. amblycephala relatívne citlivým druhom na amoniakálny dusík a často trpí stresom vyvolaným amoniakálnym dusíkom [31–33]. Vo svetle vyššie uvedeného sa vo Wuchang bream uskutočnil experiment s chronickou expozíciou, aby sa objasnili vlastnosti imunitných reakcií po chronickej expozícii amoniaku a mechanizmus za týmito účinkami prostredníctvom detekcie zmien v sérových imunitných parametroch, histológii a molekulách súvisiacich s dráhou TLR. v slezine a hlave-obličke. Naše výsledky tiež prispievajú k monitorovaniu zdravotného stavu a welfare M. amblycephala v systémoch intenzívnej akvakultúry.
2. Výsledky
2.1. Obsah amoniaku v slezine a hlave a obličkách
Obrázok 1 ukazuje obsah amoniaku v slezine a hlavovej obličke M. amblycephala po 30 dňoch vystavenia rôznym hladinám amoniaku. Významné zvýšenie hladiny amoniaku bolo pozorované v slezine rýb vystavených 30 mg/l celkového amoniakálneho dusíka v porovnaní s kontrolnou skupinou (p < 0,05). Medzi všetkými skupinami liečenými amoniakom a kontrolnou skupinou nebol žiadny štatistický rozdiel v hladinách amoniaku v hlave obličky (p > 0,05).
Obrázok 1. Účinky chronickej expozície amoniaku na akumuláciu amoniaku v slezine a hlave obličky M. amblycephala. Každý stĺpec predstavuje priemer ± SE zo šiestich duplikátov. Hodnoty p < 0,05 sú znázornené ako "*" nad stĺpcom, čo naznačuje významné rozdiely oproti kontrole.
2.2. Sérový kortizol, lyzozým, hladiny C3 a C4
Ako je znázornené na obrázku 2, hladiny kortizolu v sére sa významne zvýšili vo všetkých skupinách liečených amoniakom v porovnaní s kontrolnou skupinou (p < 0.05). Naopak, aktivity sérového lyzozýmu boli významne znížené u rýb vystavených vyšším koncentráciám amoniaku (20 a 30 mg/l celkového amoniakálneho dusíka) (p < 0,05). Hladiny komplementu C3 a C4 v sére boli významne znížené v skupinách liečených 10 až 30 mg/l celkového amoniakálneho dusíka (p < 0,01).
Obrázok 2. Účinky chronickej expozície amoniaku na hladiny sérového kortizolu, lyzozýmu, C3 a C4(AD) v M. amblycephala. Každý stĺpec predstavuje priemer + SE zo šiestich duplikátov. Hodnoty p < 0.05 a 0.0l sú znázornené ako „“ a „“ nad stĺpcom, čo znamená významné rozdiely oproti kontrole.
2.3. Indexy imunitných orgánov
Indexy sleziny aj hlavy a obličiek sa zvýšili so zvýšením celkových koncentrácií amoniakálneho dusíka po expozícii (obrázok 3). V porovnaní s kontrolnou skupinou bol index sleziny významne zvýšený u rýb liečených vyšším celkovým amoniakálnym dusíkom (20 a 30 mg/l) (p < 0,05). Nebol zistený žiadny významný rozdiel v indexe hlava-oblička medzi všetkými skupinami liečenými amoniakom a kontrolnou skupinou (p > 0,05).
Obrázok 3. Účinky chronickej expozície amoniaku na indexy sleziny (A) a hlavy a obličiek (B) u Mamblycephala. Hodnoty sú vyjadrené ako minimum až maximum (n=18). Hodnoty p < 0.05 a 0,01 sú uvedené ako "" a "u" nad stĺpcom, čo znamená významné rozdiely oproti kontrole.
2.4. Patologické hodnotenie
Slezina pleskáča wuchangského v kontrolnej skupine vykazovala normálny vzhľad s bohatými erytrocytmi a leukocytmi (obrázok 4A). Po vystavení amoniaku počas 30 dní sa zaznamenalo mierne zvýšenie počtu erytrocytov spolu s výskytom melano-makrofágových centier v slezine rýb vystavených 5 mg/l celkového amoniakálneho dusíka (obrázok 4B, tabuľka 1). Podobné, ale závažnejšie zmeny boli pozorované u rýb liečených 10 až 30 mg/l celkového amoniakálneho dusíka, ako je zvýšenie počtu a veľkosti centier melanóm-makrofág, ako aj výrazne zvýšený počet erytrocytov (obrázok 4C, D). Okrem toho bola tiež detegovaná vakuolizácia cytoplazmy v slezine rýb vystavených 30 mg/l celkového amoniakálneho dusíka (obrázok 4E, tabuľka 1).
Čo sa týka hlavy a obličiek, obrázok 5A ukazuje normálnu štruktúru tkaniva hlavy a obličiek u kontrolných rýb po expozícii. V hlave a obličkách rýb vystavených nižšiemu celkovému amoniakálnemu dusíku (5 mg/l) sa nezaznamenali žiadne zjavné patologické príznaky (obrázok 5B, tabuľka 1). Mierne zvýšenie počtu melanómových-makrofágových centier bolo pozorované u rýb vystavených 10 a 20 mg/l celkového amoniakálneho dusíka (obrázok 5C, D, tabuľka 1). Veľkosť a počet melanómových-makrofágových centier sa zvýšili v skupine s celkovým amoniakovým dusíkom 30 mg/l (obrázok 5E, tabuľka 1).
2.5. Analýza imunitných parametrov tkaniva
Hladiny vrodených imunitných parametrov (TNF-, IL-1) a získaných imunitných parametrov (IgM) v slezine a hlave obličky sa znížili spolu so zvýšením hladín expozície amoniaku (obrázok 6, doplnková tabuľka S1). V slezine boli obsahy a hladiny mRNA TNF- a IgM významne znížené vo všetkých skupinách liečených amoniakom v porovnaní s kontrolami (p < 0.{{10}}5). Medzitým bol obsah IL-1 v slezine a hladiny expresie mRNA významne znížené u rýb vystavených viac ako 20 mg/l celkového amoniakálneho dusíka (p < 0,05). Naopak, iba obsah a hladina mRNA IL-1, ako aj hladina expresie tnf- v hlave-obličke boli výrazne znížené v skupinách liečených amoniakom v porovnaní s kontrolami (p < 0,05). Medzi skupinami liečenými amoniakom a kontrolnou skupinou neboli žiadne významné rozdiely v hladinách expresie IgM proteínu a génu, ako aj v koncentrácii TNF- v hlavovej obličke (p > 0,05).
Obrázok 6. Relatívne hladiny mRNA génov signálnej dráhy TLR, ako aj obsah TNF-, IL- 1 a IgM v slezine a hlave-obličke M. amblycephala. Hodnoty vyjadrené ako priemer ± SE zo šiestich duplikátov. igm: imunoglobulín M, il-1: interleukín 1, tnf-: tumor nekrotizujúci faktor, jnk1: c-Jun N terminálna kináza1, erk1: extracelulárne regulovaná proteínkináza 1, p38: mitogénom aktivovaná proteínkináza p38, nf-κb1 /2: väzba nukleárny faktor-κ-gén 1/2, pi3 k: fosfatidylinozitol 3-kináza, akt: proteínkináza B, myd88: myeloidný diferenciačný faktor 88, traf6: faktor 6 spojený s receptorom faktora nekrózy nádorov, tlr1 /2/3/4/5: mýtny receptor 1/2/3/4/5. Hodnoty p < 0.05 a 0,01 sú znázornené ako „*“ a „**“ nad stĺpcom, čo znamená významné rozdiely oproti kontrole, resp.
Na objasnenie molekulárneho mechanizmu chronickej toxicity amoniaku na imunitný systém boli stanovené transkripčné zmeny kľúčových génov zapojených do signálnej dráhy TLR spolu s hladinami TNF-, IL-1 a IgM. V slezine boli hladiny mRNA toll-like receptorových génov (tlr2, tlr4), génu traf6 spojeného s nezávislou dráhou MyD, génu nf-κb2 spojeného so signálnou dráhou NF-KB a génu erk1 spojeného so signálnou dráhou MAPK významne nižšie -regulované v skupinách liečených amoniakom v porovnaní s kontrolou (p < 0.05), pričom nedošlo k žiadnym významným zmenám v expresii tlr1, tlr3, tlr5, pi3k, akt, myd88 , nf-κb1, jnk1 a p38 a (p > 0.05). Podobne hladiny transkripcie tlr1, tlr2, tlr5, akt, traf6, nf-κb1, erk1 a jnk1 boli významne červené, žiadne významné rozdiely v expresii tlr3, tlr4, myd88, pi3 k, nf-κb2 a p38 v hlave-obličke medzi skupinami liečenými amoniakom a kontrolnou skupinou (p > 0,05).
2.6. Korelačná analýza
Ako je znázornené na obrázku 7 a v doplnkovej tabuľke S2, koncentrácia vystavenia amoniaku významne negatívne korelovala s obsahom TNF-, IL-1 a IgM, ako aj s transkripčnými hladinami tnf-, il-1, igm, tlr2, traf6, nf-кb2 a jnk1 v slezine. Medzitým obsah a hladiny transkripcie TNF-, IL-1 a IgM v slezine vykazovali významné pozitívne vzájomné korelácie (p < 0.05). Koncentrácia IgM v slezine vykazovala významnú pozitívnu koreláciu s tlr2 a nf-кb2 a TNF- ako aj IL-1 vykazovali významné pozitívne korelácie s tlr2, traf6 a nf-кb2 (p < 0). 53}}5). Avšak v obličkách hlavy boli hladiny vystavenia amoniaku iba pozoruhodne negatívne korelované s obsahom IL-1 a expresiou génov tnf-, il-1, tlr1/2/4/5, traf6, akt, nf-кb1, jnk1 a erk1 (p < 0,05). Hlava-oblička IL-1 pozitívne korelovala s IgM, igm, il-1, tlr4, myd88, traf6, akt, nf-кb1, erk1 a jnk1, zatiaľ čo IgM a TNF- vykazovali pozitívnu koreláciu s p38a a tlr2, v tomto poradí (p < 0,05).
Obrázok 7. Spearmanove korelačné koeficienty® medzi koncentráciou expozície amoniaku a imunitnými parametrami zapojenými do signálnej dráhy TLR v slezine a hlave-obličke M. amblycephala po chronickej expozícii amoniaku. Hodnoty p < 0.05 a 0,01 sú znázornené ako „*“ a „**“ nad stĺpcom, čo znamená významné rozdiely oproti kontrole, resp.
2.7. Indexy IBR
Hodnoty IBR boli vypočítané zo štandardizovaných údajov 22 biomarkerov v slezine a hlave-obličke u pleskáča wuchangského pod rôznymi hladinami okolitého amoniaku po 30-dňovej expozícii (tabuľka 2, obrázok 8). Keď sa expozičné koncentrácie amoniaku zvyšovali, hodnoty IBR mali tendenciu stúpať v slezine aj v hlavových obličkách. Hodnoty IBR boli vyššie v slezine
Podporná služba Wecistanche - Najväčší vývozca cistanche v Číne:
E-mail:wallence.suen@wecistanche.com
Whatsapp/Tel:+86 15292862950
Nakupujte pre ďalšie špecifikácie Podrobnosti:
https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop
