Vyšetrenie denných variácií a pohlavných rozdielov v neurofyziológii hipokampu a priestorovej pamäti 3. časť

Aby sme preskúmali rozdiely medzi pohlavím a časom dňa, stratifikovali sme náš súbor údajov na základe oblasti prednej-zadnej osi, po ktorej nasledovala trojcestná faktorová ANOVA. Zistili sme, že pohlavie nemalo žiadny významný vplyv na niekoľko akčných potenciálov generovaných v reakcii na injekcie depolarizujúceho prúdu do buniek zaznamenaných buď z predných (p=0.321, hlavný účinok pohlavia, trojcestná RM-ANOVA) alebo zadných rezov (p=0.568, hlavný účinok sexu, trojcestná RM-ANOVA); teda údaje od oboch pohlaví boli spojené pre konečnú analýzu.

Pamäť je veľmi dôležitou súčasťou našej životnej cesty. Nielenže sa spoliehame na pamäť, aby sme sa naučili nové poznatky, ale potrebujeme ju aj na to, aby nám pomohla riešiť problémy a rozhodovať sa.

Naše chápanie mechanizmov je však nedostatočné. Bunky sú základným stavebným kameňom nášho tela, ako teda súvisia s pamäťou? Bunky zohrávajú dôležitú úlohu v pamäti.

Po prvé, vnútrobunková signalizácia je základom našej pamäte. Počas pamäte a učenia nervové bunky menia spojenie medzi neurónmi a vytvárajú nové neurónové siete. Táto zmena sa uskutočňuje prostredníctvom neurotransmiterov vrátane neurotransmiterov a neuropeptidov. Neurotransmitery a neuropeptidy prenášajú tieto informácie cez synapsie do cieľových buniek. Preto je vnútrobunkový prenos signálu dôležitou súčasťou nášho procesu učenia a pamäte.

Po druhé, kvalita a množstvo buniek môže ovplyvniť aj našu pamäť. Ak nemáme v tele dostatok buniek, cítime sa unavení a máme slabú pamäť. Okrem toho výskum ukazuje, že nutričný stav buniek môže ovplyvniť aj učenie a pamäť. Nové výsledky výskumu ukazujú, že potraviny obsahujúce omega-3 mastné kyseliny môžu zlepšiť kvalitu a množstvo nervových buniek.

Naše bunky navyše dokážu ovplyvňovať pamäť aj fyzickým pohybom. Cvičenie môže podporiť novú generáciu nervových buniek, a tým zlepšiť našu pamäť. Cvičením sa uvoľňujú neurotrofické faktory, látky stimulujúce regeneráciu nervových buniek a tvorbu synaptických spojení.

Aby som to zhrnul, bunky sú základom našej pamäte a ovplyvňuje ich náš každodenný život. V každodennom živote môžeme zlepšiť pamäť tým, že sa vyhneme fajčeniu a nadmernému požívaniu alkoholu, budeme udržiavať zdravý životný štýl, konzumovať potraviny obsahujúce omega-3 mastné kyseliny a venovať sa vhodnému cvičeniu, vďaka čomu budú naše spomienky jasnejšie a šťastnejšie. Je vidieť, že si musíme zlepšiť pamäť. Cistanche deserticola môže výrazne zlepšiť pamäť, pretože Cistanche deserticola je tradičný čínsky liečivý materiál s mnohými jedinečnými účinkami, z ktorých jedným je zlepšenie pamäte. Účinnosť mletého mäsa spočíva v rôznych aktívnych zložkách, ktoré obsahuje, vrátane kyselín, polysacharidov, flavonoidov atď. Tieto zložky môžu podporovať zdravie mozgu rôznymi spôsobmi.

Kliknite na vedieť doplnky na zlepšenie pamäte

Predné bunky zaznamenané v noci vystrelili viac akčných potenciálov ako tie, ktoré boli zaznamenané počas dňa (p=0,046, hlavný účinok denného času, obojsmerná RMANOVA; Obr. 7B). Zadné bunky však vykazovali noštatistický rozdiel deň-noc v počte aktivovaných akčných potenciálov (p=0 0,484, hlavný účinok denného času, obojsmerná RM-ANOVA; obr. 7E).

Skúmanie základného membránového potenciálu neodhalilo žiadne rozdiely v pohlaví alebo dennom čase v bunkách zaznamenaných z predných rezov (p=0.572 a 0.535, hlavné účinky pohlavia a času dňa v tomto poradí, dvojcestná ANOVA, obr. 7C). Membránové potenciály buniek zaznamenané zo zadných rezov v noci však boli viac depolarizované ako tie, ktoré boli zaznamenané počas dňa, bez ohľadu na pohlavie (p= 0.044, hlavný účinok dennej, obojsmernej ANOVA; Obr. .7F).

Skúmali sme 15 ďalších vlastností membrány, vrátane vlastností akčného potenciálu jednorazového akčného potenciálu vyvolaného injekciou prúdu reobázy, poklesom a vstupným odporom (tabuľka 1). V predných neurónoch (muž:0.295 6 0.01 ms, žena: 0.275 6 0.01 ms; p=0.047, obojsmerná ANOVA). Žiadne ďalšie parametre nedosiahli štatistickú významnosť (rozšírená tabuľka údajov 1-1).

Vzhľadom na to, že spaľovanie akčného potenciálu a membránový potenciál sú mierou neurónovej excitability, môžeme dospieť k záveru, že CA1 pyramidálne neuróny naprieč hipokampálnym okruhom sú celkovo vzrušujúcejšie v noci, ale mechanizmy, ktoré sú základom tohto nočného zvýšenia excitability, sa môžu líšiť naprieč hipokampálnou predo-zadnou osou.

Rozdiely medzi dňom a nocou v pyramidálnej neuroneexcitabilite CA1 nie sú vlastné

Keďže pozorovaná zmena excitability deň-noc mohla byť riadená synaptickými a/alebo vnútornými faktormi, opäť sme hodnotili excitabilitu v samostatnej skupine zvierat v prítomnosti synaptických antagonistov (CPP, NBQX, GBZ), aby sme izolovali pyramidálny neurón CA1 z okruhu. .Za týchto podmienok sme nezistili žiadny významný vplyv času dňa na počet akčných potenciálov generovaných v reakcii na depolarizačné prúdové injekcie v bunkách zaznamenaných z predných aj zadných rezov (p=0,933 pre predné a p { {6}} 0,569 pre zadný, hlavný efekt denného času, obojsmernú RM-ANOVA, obr. 8A, D).

Okrem toho východiskové potenciály za týchto podmienok neboli ovplyvnené časom dňa ani pohlavím v bunkách zaznamenaných z oboch predných (p=0,896 a 0,888, hlavný účinok pohlavia a času- deň, v uvedenom poradí, obojsmerná ANOVA; Obr. 8B) alebo zadné rezy (p {{1{12}}}},999 a 0,702, hlavný účinok pohlavia a času dňa, v uvedenom poradí, obojsmerná ANOVA; Obr. 8E). Skúmali sa ďalšie membránové vlastnosti v prítomnosti synaptických antagonistov, vrátane vlastností akčného potenciálu jednorazových akčných potenciálov vyvolaných injekciou prúdu reobázy, priehybu a vstupného odporu (tabuľka 2).

Potenciálna hyperpolarizácia s rýchlym aj stredným účinkom (fAHP a mAHP) bola väčšia počas dňa (fAHP: 5.776 0,74 mV, mAHP: 9.296 0,65 mV) v porovnaní s nocou v prednej časti neuróny (fAHP: 4.08 6 0,51 mV, mAHP: 7.06 6 0,59 mV; p=0.044 a 0,024 pre fAHP a mAHP, obojsmerné ANOVA, tabuľka 2). V predných neurónoch bol fAHP vyšší u mužov (5.{21}},56 mV) v porovnaní so ženami (3.98 6 0,58 mV; p=0,034, dvojcestná ANOVA; Tabuľka 2). Žiadne ďalšie parametre v predných ani zadných neurónoch nedosiahli štatistickú významnosť (tabuľka rozšírených údajov 1-1).

Celkovo neprítomnosť zvýšenej nočnej neuronalexcitability (frekvencie membránového potenciálu a akčného potenciálu) v prítomnosti synaptických antagonistov naznačuje, že denné rozdiely v rýchlom excitačnom a/alebo inhibičnom synaptickom vstupe aspoň čiastočne prispievajú k nočnému zvýšeniu excitability.

Diskusia

Tu sme skúmali účinky pohlavia a dennej doby na viaceré aspekty hipokampálnej fyziológie, od správania po individuálnu neuronálnu fyziológiu. Ukazujeme, že denná doba ovplyvňuje priestorové učenie a pamäť, veľkosť LTP, synaptickú inhibíciu na CA1 pyramidálne neuróny a CA1 pyramidálnu neurónovú excitabilitu. Zistili sme, že sex mal najväčší vplyv na rozdiely medzi dňom a nocou vo výkone OLM, zatiaľ čo jeho účinok na synaptický prenos, veľkosť LTP a excitabilitu neurónov bol jemný alebo úplne chýbal. Okrem toho sme zistili, že poloha pozdĺž predo-zadnej osi výrazne excitabilne ovplyvňuje CA1 pyramidálne neuróny. Tieto zistenia ilustrujú zložitosť hipokampálnej siete a dôležitosť zohľadnenia faktorov, ako je pohlavie a denná doba v budúcich štúdiách.

Zatiaľ čo cirkadiánne rytmy regulujú LTP a učenie a pamäť závislé od hipokampu, úloha pohlavných denných rozdielov v týchto procesoch bola predtým neznáma. Prekvapivo sme zistili, že cirkadiánne rytmy regulujú výkon pamäte závislý od hipokampu spôsobom závislým od pohlavia. Samce myší fungovali lepšie v úlohe OLM v noci, ako už bolo uvedené (Takahashi a kol., 2013; Snider a kol., 2016). Femalemice sa však počas dňa darilo lepšie. Nie je jasné, prečo by samice myší fungovali lepšie počas ich neaktívneho obdobia, ale možným vysvetlením by mohol byť estrálny cyklus, ktorý v súčasnej štúdii nebol kontrolovaný.

Zatiaľ čo je potrebný ďalší výskum prirodzene cyklujúcich samíc, aby sa urobili definitívne závery o špecifickom vplyve estrálneho cyklu na priestorovú pamäť závislú od hipokampu, štúdie na potkanoch zistili, že samice v proestri a estri prekonali tie v diestre v úlohách rozpoznávania objektov a umiestňovania objektov (Frye et al. ., 2007; Paris a Frye, 2008). Hladiny estrogénu skutočne ovplyvňujú výkon pamäťových úloh závislých od hipokampu a podávanie exogénneho estradiolu zvyšuje výkon pamäťových úloh závislých od hipokampu (Luine a kol., 2003; Li a kol., 2004; Phan a kol., 2012; Vedder a kol., 2013, 2014; Tuscher a kol., 2015). Pochopenie toho, ako sa estrálny cyklus a cirkadiánny cyklus zbližujú, aby modulovali kogníciu u žien, bude zaujímavou a dôležitou témou pre budúci výskum.

Je zaujímavé, že sme zistili, že tieto sexuálne účinky na denné rozdiely vo výkone OLM sa nevzťahovali na dennú reguláciu LTP, ktorá sa považuje za bunkový korelát učenia a pamäte. Je dôležité poznamenať, že časy CT a ZT použité v týchto dvoch experimentoch sa navzájom dokonale nezrkadlia. Testy OLM sa uskutočňovali uprostred subjektívnych denných a nočných období v konštantnej tme (CT štyri a CT 16), ako je prispôsobené (Snider et al., 2016), zatiaľ čo elektrofyziologické experimenty skúmali skoro deň a skoro noc v cykle LD (ZT 1–6 a ZT 12–18).

Napriek tomu by toto trochu neočakávané zistenie mohlo byť príkladom toho, ako možno rovnaký fyziologický proces (LTP) použiť na dosiahnutie rôznych výsledkov v závislosti od kontextu (muži verzus ženy). Navyše, zatiaľ čo úloha OLM, ktorú sme si vybrali, je závislá od hipokampu (Barker a Warburton, 2011); učenie a pamäť sú zložité procesy, ktoré sa môžu spoliehať na viaceré pamäťové systémy a ženy sa možno viac spoliehajú na iné obvody ako muži. Navyše, estrálny cyklus môže ovplyvniť stratégie učenia a relatívne príspevky rôznych ženských pamäťových okruhov (Korol et al., 2004).

Preto účinky závislé od pohlavia pozorované v úlohe OLM môžu byť sprostredkované iným mechanizmom ako LTP na synapsii CA3-CA1. Je tiež možné, že použitá vysokofrekvenčná stimulácia, na rozdiel od fyziologickejšej stimulácie (tj théta vzplanutie), môže okludovať detekciu regulácie LTP závislej od pohlavia. Ďalším obmedzením testu OLMassay, ktorý stojí za zmienku, je možné narušenie behaviorálnych rytmov v dôsledku opakovanej manipulácie (5 min/d) 4 dpred tréningom a testovaním. Bez ohľadu na to tieto výsledky ilustrujú dôležitosť zohľadnenia pohlavia aj času dňa pri navrhovaní výskumných štúdií a interpretácii výsledkov.

Predchádzajúca práca z nášho laboratória odhalila, že pyramidálne neuróny sIPSCsonto CA1 vykazujú denné rozdiely, ktoré sa strácajú v myšom modeli Alzheimerovej choroby (Fusilier et al., 2021). Tu sme replikovali a rozšírili predchádzajúce zistenia skúmaním sIPSC u oboch pohlaví a vykonaním ďalších experimentov v prítomnosti TTX (mIPSC), aby sme začali identifikovať presynaptické a postsynaptické mechanizmy, ktoré prispievajú k denným rozdielom. Nedostatok denných rozdielov v mIPSC IEI naznačuje, že inhibícia pyramídových buniek CA1 závislá od akčného potenciálu je väčšia počas dňa ako v noci u samcov aj samíc myší. Vzhľadom na to, že tieto inhibičné prúdy boli farmakologicky izolované s antagonistami glutamátového receptora, je pravdepodobné, že sa spontánne vytvorí zvýšená denná interneuronaktivita. Predchádzajúce správy skutočne naznačujú, že niektoré interneuróny v oblasti CA1 sú spontánne aktívne (Sik a kol., 1995; Maccaferri a McBain, 1996; Oliva a kol., 2000; Amilhon a kol., 2015; Huh a kol., 2016; Miri ., 2018); definitívny dôkaz o dennej variácii spontánneho spustenia interneurónov v hipokampe však chýba a bude dôležitou oblasťou budúcej štúdie, ktorá by mohla poskytnúť pohľad na cirkadiánnu dysfunkciu spojenú s chorobami zahŕňajúcimi hyperexcitabilitu hipokampálnej siete, vrátane Alzheimerovej choroby a epilepsie.

Okrem prijímania inhibičného vstupu z lokálnych interneurónových populácií prichádza hlavný excitačný vstup do CA1 pyramídových buniek z axónov hlavných neurónov downstream oblasti CA3 (Schafferove kolaterály; CA3 pyramídové bunky) alebo entorinálneho kortexu (temperoammonická dráha). Skúmanie sEPSC ukázalo, že tendencia excitačného vstupu do CA1 pyramidálnych buniek je väčšia v noci ako cez deň. Pri absencii uvoľňovania neurotransmiterov závislého od akčného potenciálu tento jav pretrváva u mužov, ale nie u žien, čo naznačuje, že zvýšená nočná excitácia u žien je pravdepodobne riadená akčným potenciálom. Pyramídové bunky CA3 tiež vykazujú denné rozdiely v excitabilite, takže nočné bunky vykazujú väčší prúd vápnika, zníženú hyperpolarizáciu a zníženú adaptáciu frekvencie hrotov v porovnaní s dennými bunkami (Kole et al., 2001). Táto zvýšená nočná excitabilita CA3 pyramidálnych buniek by sa mohla premietnuť do zvýšeného sEPSC na CA1 pyramidálne bunky v noci v porovnaní so dňom.

Ďalej sme chceli preskúmať, ako môže denná variácia v excitačnom a inhibičnom synaptickom prenose ovplyvniť excitabilitu pyramídových neurónov CA1. Predchádzajúca štúdia na potkanoch zistila, že excitabilita membrány osciluje v cirkadiánnom čase a neuróny boli viac depolarizované počas subjektívnej noci / subjektívneho skorého dňa (Naseri Kouzehgarani et al., 2020). Nedávna štúdia zistila zvýšenú nočnú excitabilitu v myšacích CA1 pyramidálnych neurónoch (Fusilier et al., 2021). Tu sme replikovali predchádzajúce zistenia a rozšírili našu štúdiu, aby sme zohľadnili potenciálne rozdiely medzi pohlaviami a vplyv predo-zadnej hipokampálnej osi. Celkovo sme zistili, že v neporušenom synaptickom okruhu (tj bez synaptických antagonistov) boli pyramidálne neuróny CA1 vzrušujúcejšie v noci v porovnaní s dňom, bez ohľadu na pohlavie. Je zaujímavé, že nočné zvýšenie excitability nebolo rovnomerné v celej hipokampálnej predo-zadnej osi. Zatiaľ čo neuróny zaznamenané z predných rezov vyvolali viac akčných potenciálov v reakcii na injekcie depolarizujúceho prúdu a nevykazovali žiadny denný rozdiel v základnom membránovom potenciáli, zadné neuróny boli viac depolarizované v noci, ale nevykazovali štatisticky významný nočný nárast niekoľkých spustených akčných potenciálov.

Tieto zistenia naznačujú, že základné mechanizmy nočného zvýšenia neuronálnej excitability sa môžu líšiť v závislosti od umiestnenia na prednej a zadnej osi. Zatiaľ čo naša príprava koronálnych rezov znamenala, že sme neboli schopní skutočne izolovať ventrálny hipokampus od dorzálneho hipokampu, pozorovali sme, že neuróny zo zadných rezov vykazovali charakteristiky konzistentné s predtým publikovanými údajmi zozbieranými z ventrálnych CA1 pyramídových neurónov, zatiaľ čo neuróny z predných rezov boli v súlade s údajmi skúmajúcimi dorzálne CA1pyramídové neuróny ( Malik et al., 2016; Milior et al., 2016). Konkrétne, zadné (ventrálne) neuróny boli dráždivejšie v porovnaní s prednými neurónmi, pričom dosiahli maximálnu rýchlosť zapaľovania skôr ako predné neuróny, mali vyššiu vstupnú odolnosť a nižšie hodnoty reobázy v porovnaní s prednými ( dorzálne) neuróny. Vzhľadom na známe rozdiely v dendritickej morfológii a expresii iónových kanálov medzi indorzálnymi a ventrálnymi hipokampálnymi neurónmi (Bannermanet al., 2004; Fanselow a Dong, 2010; Marcelin a kol., 2012; Dougherty a kol., 2012, 2013; Hönaligsperger a kol., 2013 Kim a Johnston, 2015; Malik a kol., 2016; Milioret al., 2016; Soltesz a Losonczy, 2018), nie je prekvapujúce, že mechanizmy, ktoré sú základom nedráždivosti denných rozdielov, sa môžu v rámci týchto populácií líšiť. Absencia rozdielov medzi dňom a nocou neurónová excitabilita v prítomnosti synaptických antagonistov naznačuje, že synaptické vstupy aspoň čiastočne prispievajú k nočnému zvýšeniu excitability. Na určenie špecifickej úlohy synaptických aj vnútorných faktorov pri regulácii denných rozdielov vo fyziológii v pyramidálnych neurónoch CA1 sú však potrebné budúce experimenty.

Okrem toho sa rozdiel medzi prednými a zadnými bunkami zmenšil v prítomnosti synaptických antagonistov, čo naznačuje, že synaptické faktory by mohli byť aspoň čiastočne zodpovedné za niektoré regionálne rozdiely, ktoré sme pozorovali. Bude zaujímavé zúžiť, ako je modulovaná expresia a funkcia rôznych neurotransmiterových receptorov a iónových kanálov v priebehu dňa a umiestnenia pozdĺž pozdĺžnej osi. Výhodou techniky slepej náplasti použitej v tejto štúdii je schopnosť zbierať údaje z neurónov umiestnených hlboko pod povrchom tkaniva, kde je zdravie a životaschopnosť buniek najväčšia, ale vizualizované zacielenie na neuróny by bolo zložité. Tento prístup však zakazuje zacielenie na špecifické subpopulácie neurónov. ; teda do štúdie boli zahrnuté pyramídové neuróny vo všetkých oblastiach vrstvy pyramídových buniek CA1. Budúce štúdie skúmajúce účinky dennej doby a pohlavia v rôznych subpopuláciách CA1 pyramidálnych buniek (napr. hlboké verzus povrchové neuróny) budú informatívne pre pochopenie fyziológie špecifickej pre bunkový typ.

Hipokampus je jedným z najviac študovaných a dobre charakterizovaných okruhov v mozgu cicavcov. Väčšina poznatkov o tom, ako tento okruh funguje, je však založená na štúdiách vykonaných počas dňa na väčšinou samcoch nočných hlodavcov. Neschopnosť zohľadniť faktory, ako je denná doba a pohlavie, vedie k neúplnému obrazu fyziológie hipokampu a toho, ako dynamicky funguje vo viacerých kontextoch. Pohlavie a denná doba sú obzvlášť dôležitými faktormi pre translačný význam štúdia hipokampu v modeloch chorôb, ako je Alzheimerova choroba alebo epilepsia, ktoré sú ovplyvnené cirkadiánnymi rytmami a môžu ovplyvniť mužov a ženy odlišne.

Je dôležité poznamenať, že okrem experimentov testujúcich OLM boli všetky experimenty v tejto štúdii vykonávané v cykle svetlo-tma. Preto sú potrebné budúce štúdie v konštantných podmienkach na určenie úlohy cirkadiánneho systému na pozorovaných denných rozdieloch. Aj keď sa tu skúmali iba dva body, v budúcich štúdiách bude zaujímavé a užitočné určiť, ako je fyziológia hipokampu dynamická vo viacerých časových bodoch v cirkadiánnom cykle. Na záver, táto štúdia odhaľuje denné variácie hipokampalsynaptických a neuronálnych funkcií a podčiarkuje dôležitosť zohľadnenia pohlavia, cirkadiánnych rytmov a neuronálnej heterogenity v oblasti mozgu pri štúdiu nervových okruhov.

Referencie

Amilhon B, Huh CYL, Manseau F, Ducharme G, Nichol H, Adamantidis A, Williams S (2015) Parvalbumínové interneuróny hippocampu ladia aktivitu populácie na frekvencii theta. Neurón86:1277–1289.

Bannerman DM, Rawlins JNP, McHugh SB, Deacon RMJ, Yee BK, Bast T, Zhang WN, Pothuizen HHJ, Feldon J (2004) Regionálne disociácie v hipokampe – pamäť a úzkosť. NeurosciBiobehav Rev 28:273–283.

Barker GRI, Warburton EC (2011) Kedy sa hipokampus podieľa na rozpoznávacej pamäti? J Neurosci 31:10721-10731.

Okrem RC, Rogers CO, Paul JR, Hablitz LM, Johnson RL, McMahonLL, Gamble KL (2017) aktivita GSK3 reguluje rytmy v génovej expresii hipokampálnych hodín a synaptickej plasticite. Hippocampus 27: 890–898.

Buijs RM, Soto Tinoco EC, Hurtado Alvarado G, Escobar C (2021)Cirkadiánny systém: od hodín k fyziológii. Handb ClinNeurol 179:233–247.

Cao G, Nitabach MN (2008) Cirkadiánna kontrola excitability membrány v neurónoch laterálnych ventrálnych hodín Drosophila melanogaster. JNeurosci 28:6493-6501.

Chao OY, Huston JP, Nikolaus S, de Souza Silva MA (2016) Súbežné hodnotenie pamäte pre objekt a miesto: dôkazy o odlišnej preferenčnej dôležitosti perirhinálnej kôry a hipokampu a prognostickom účinku agonistu neurokinínu-3 R. Neurobiol Learn Mem 130:149–158.

Chaudhury D, Wang LM, Colwell CS (2005) Cirkadiánna regulácia dlhodobej potenciácie hippocampu. J Biol Rhythms 20:225–236.

Colwell CS (2021) Definovanie cirkadiánneho narušenia pri neurodegeneratívnych poruchách. J Clin Invest 131:e148288.

Cook RL, Kelso NE, Brumback BA, Chen X (2016) Analytické stratégie na vyhodnotenie asociácie časovo premenných expozícií k výsledkom súvisiacim s HIV: konzumácia alkoholu ako príklad. Curr HIVRes 14:85–92.

Davis JA, Paul JR, McMeekin LJ, Nason SR, Antipenko JP, YatesSD, Cowell RM, Habegger KM, Gamble KL (2020) Diéty s vysokým obsahom tuku a sacharózy zhoršujú časové rozdiely v priestorovej pracovnej pamäti samcov myší. Obezita (Strieborná jar) 28:2347–2356.

For more information:1950477648nn@gmail.com