Experimentálna štúdia mechanizmov protišportovej únavy Biect Cistanche Deserticola
Mar 09, 2022
Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com
YANG Hong-Xin, YANG Yong², YAN Xiao-hong'
Abstrakt:Cieľ Študovať účinokcistanche deserticolana laktátdehydrogenázu (LDH) izoenzým, glykogén a syntázu oxidu dusnatého 3 (NOS3) pečene u myší pri zaťažení plávaním a preskúmať relevantné molekulárne mechanizmyantišportová únava. Metóda Myši boli rozdelené do normálnej kontrolnej skupiny, športovej kontrolnej skupiny acistanche deserticolaexperimentálna skupina. Každá myš z normálnej kontrolnej skupiny a športovej kontrolnej skupiny dostávala fyziologický roztok 0,2 ml denne. Každá myš z experimentálnej skupiny cistanche deserticola dostala vodný odvarcistanche deserticola0.2 ml (3 g/kg na deň. Podávanie bolo 15 dní. Plávanie so záťažou počas 90 minút sa vykonávalo na myšiach v športovej kontrolnej skupine acistanche deserticolaexperimentálnej skupine 1 hodinu po poslednom podaní. Pečene myší boli odstránené po 10 hodinách plávania. Jedna časť pečene bola fixovaná v neutrálnom formalíne na prípravu parafínových rezov a ostatné boli použité na meranie aktivity LDH. Štruktúra pečene sa pozorovala farbením HE a pečeňový glykogén sa meral farbením glykogénu. NOS3 bol vyšetrený SP imunohistochemickou metódou. Rei Štruktúra pečene športovej kontrolnej skupiny bola vážne zranená, izoenzýmy LDH4 a LDH5 boli vyššie, pečeňový glykogén bol slabý, NOS3 bol znížený v porovnaní s normálnou kontrolnou skupinou (P<0.05). the="" liver="" structure="" of="" the="" cistanche="" deserticola="" experimental="" group="" was="" good,="" ldh5="" isoenzyme="" was="" low,="" the="" glycogen="" was="" rich="" and="" expression="" of="" nos3="" was="" upregulated="" compared="" with="" the="" sport="" control="" group=""><0.05). conclusion:="">Cistanche deserticolaby mohol znížiť LDH5, chrániť pečeň pri plávaní pri záťaži myší a urýchliť akumuláciu glykogénu zvýšením expresie NOS3 na ochranu pečene a zlepšenie obnovy fyzickej kapacity.
Kľúčové slová; cistanche deserticola;pečeňový glykogén; oxid dusnatý syntáza 3; myši
Cistanche, tiež známy ako Dayun, je dvojročná parazitická bylina z čeľade Lydanaceae. Má suché dužinaté stonky so šupinami. Vyrába sa hlavne na piesočnatých pôdach a polopiesočnatých pastvinách vo Vnútornom Mongolsku, Gansu, Xinjiang a Qinghai.Cistanchevo Vnútornom Mongolsku má najlepšiu kvalitu spomedzi výrobných oblastí.Cistanchemá sladkú, slanú a hrejivú povahu. Vstupuje do meridiánu obličiek a hrubého čreva. Jeho hlavnou funkciou je povzbudiť obličky a posilniť jang, vyživiť esenciu a krv a vyživiť črevá. Často sa používa na liečbu impotencie, neplodnosti, slabosti v páse a kolenách, slabosti svalov a kostí, suchých čriev a zápchy. . Účelom tejto štúdie je sledovať účinkyCistanchena pečeňovú laktátdehydrogenázu (LDH), pečeňový glykogén a syntázu oxidu dusnatého 3 (NOS3) u záťažových plávajúcich myší prostredníctvom záťažového testu plávania na myšiach a na preskúmanie jej ochranného mechanizmu na pečeni. Poskytnite teoretický základ pre hĺbkový výskum, vývoj a využitieCistanchev športovej zdravej výžive.
1 Experimentálny materiál
1.1 Zvieratá 3 0 samce krýs Kunming, čistý stupeň, hmotnosť (20±0,5) g, poskytnuté Animal Center of Inner Mongolia University.
1.2 Medicine Cistanche (Cistanche deserticolaYC Ma) sa vyrába v Ejina Banner vo Vnútornom Mongolsku a bol identifikovaný. Podľa pôvodného liečivého materiálu: voda=100g: 400 ml, namočte na 30 minút, zohrejte a povarte, potom 30 minút lúhujte na teplom ohni, vylejte liečivý roztok a znovu ozdobte v pomere 100 g: 200 ml. Oba odvary zmiešajte, prefiltrujte dvoma vrstvami gázy a potom zahustite na ekvivalent 1 g pôvodných liečivých látok na mililiter pôvodného odvaru a skladujte v chladničke pri teplote 4 °C. 1.3 Činidlá a prístroje Polyklonálna protilátka NOS3 bola zakúpená od Wuhan Boster Bioengineering Co., Ltd. Súprava SP bola zakúpená od Fujian Maixin Reagent Company. Súprava izoenzýmu laktátdehydrogenázy bola zakúpená od Inner Mongolia Tongri Reagent Co., Ltd (úplne vlastnená Nissanom). Analyzátor farebných obrázkov Nanjing JD{12}}. Americký systém UVP gélovej analýzy obrazu.
2. Experimentálne metódy
2.1 Zoskupenie a podávanie Myši Kunming boli náhodne rozdelené do normálnej kontrolnej skupiny, kontrolnej skupiny pri cvičení aCistancheexperimentálna skupina, každá s 10 myšou. Normálna kontrolná skupina a kontrolná skupina pri cvičení dostávali normálny fyziologický roztok raz denne, 0,2 ml/čas; aCistancheexperimentálnej skupine bol podávaný odvar z cistanche (vezmite 3 ml pôvodného vodného odvaru a pridajte vodu na 10 ml), raz denne, 0 2ml/čas, denná dávka 3g/kg, nepretržité podávanie počas 15 dní. Jednu hodinu po poslednom podaní sa myšiam v kontrolnej skupine cvičenia a v experimentálnej skupine Cistanche naložilo 1 g oloveného závažia na chvost a umiestnili sa do bazéna s výškou 50 cm, dĺžkou 50 cm a šírka 35 cm na plávanie. Teplota sa udržiavala na (30±0,5) stupni a udržiavala sa konštantná. Pozorujte myš, ak zistíte, že myš prestane plávať, pomocou drevenej palice stimulujte jej pohyb po dobu 90 minút. Po cvičení zjedzte normálnu stravu, 10 hodín si oddýchnite a myši zabite spolu s myšami normálnej kontrolnej skupiny metódou odkrku, vyberte pečeň, časť zafixujte 10 percentným neutrálnym formaldehydom, osušte, priehľadné, namočte do vosku a vložte, aby ste vytvorili 4 hrubé súvislé rezy, použite metódu farbenia HF na pozorovanie štruktúry pečeňového tkaniva každej skupiny: druhá časť sa premyla normálnym fyziologickým roztokom, zmrazila na 20 stupňov, rozmrazila pri izbovej teplote počas merania, vysušila filtračným papierom a odvážil sa a potom sa pripravil pečeňový homogenát s normálnym fyziologickým roztokom, 3500r centrifúga počas 15 minút pri/min, a supernatant sa odobral na meranie aktivity izoenzýmu laktátdehydrogenázy elektroforézou.
2.2 Stanovenie aktivity laktátdehydrogenázy Pomocou elektroforézy na polyakrylamidovom géli sa izoenzýmy LDH separujú podľa rozdielov v ich elektroforetickej pohyblivosti. Koncentrácia separačného gélu vo vzorke je 7 percent, pH 8,9, a koncentrácia koncentrovaného gélu je 4 percentá, pH 6,8,10. Vzorka sa zmieša s 1 kvapkou glycerínu a indikátorom brómfenolovej modrej. Elektródový pufor je Tris-glycín (pH 8,7), začnite stabilizovať tlak na 1o0-150V, pridajte ho na 2o0-250V po 30 minútach a vykonajte elektroforézu počas 4h. Po elektroforéze sa zafarbil laktátdehydrogenázovou izoenzýmovou súpravou, zafarbil sa pri 37 stupňoch počas 30 minút, pričom sa ukázal modrý pás izoenzýmu laktátdehydrogenázy, potom sa opláchol vodou, zafixoval sa ľadovou kyselinou octovou a použil sa systém na analýzu obrazu gélu UVP Vykonajte analýzu údajov .
Farbenie 2,3 glykogénom Sériové rezy s hrúbkou 4 um sa konvenčne zbavia parafínu vo vode, vložia sa do 1% roztoku kyseliny jodistej pri 37 stupňoch na 15 minút, opláchnu sa tečúcou vodou, vložia sa do Schiffovho roztoku na 60 minút, opláchnu sa v tečúcej vode, dehydratujú sa gradientom etanol, xylén je priehľadný, neutrálny Pripevnite sklíčka gumou a pozorujte výsledky farbenia pod mikroskopom.
2.4 Imunohistochemická farbiaca sekcia bola rutinne zbavená parafínu vo vode a antigén bol opravený mikrovlnným tlmivým roztokom kyseliny citrónovej a endogénna peroxidáza bola odstránená kvapalinou A počas 10 minút a potom blokovaná kvapalinou B (zriedené kozie sérum) počas 10 minút. Pridajte primárnu protilátku cez noc pri 4 stupňoch vo vlhkom boxe, premyte roztokom PBS s pH 7,4 po dobu 5 minút × 3 krát na druhý deň, pridajte biotínom označený roztok C (pracovný roztok sekundárnej protilátky) na 10 minút, premyte roztokom PBS 5 minút x 3-krát a pridajte roztok D značený chrenovou peroxidázou sa inkuboval 10 minút, premyl sa roztokom PBS 5 minút X 3-krát a nakoniec sa vyvolal v roztoku DAB 5 minút, premyl sa vodou z vodovodu, zafarbil sa HE kontrastne, dehydratoval sa gradientovým alkoholom, priehľadné s xylénom a pripevnené neutrálnou gumou. Po nasadení fólie pozorujte pod svetelným mikroskopom. V každej sérii experimentov sa ako negatívna kontrola namiesto primárnej protilátky použil fyziologický roztok pufrovaný fosfátom (PBS).
2.5 Analýza expresie syntázy oxidu dusnatého 3 Predbežne pozorovaný vizuálnou semikvantitatívnou metódou pod svetelným mikroskopom, pozitívny produkt NOS3 je tmavohnedý alebo hnedožltý a pozitívny produkt sa nachádza v cytoplazme hepatocytov alebo medzi hepatocytmi. . V cytoplazme endotelových buniek je modré pozadie negatívne. Potom sa systém analýzy farebného obrazu použije na meranie sivej hodnoty pozitívneho reaktantu a parametre 4 zorných polí sa náhodne merajú pre každý film pod 40-zloženým objektívom a priemerná hodnota je prijaté. Tento parameter sa používa na vyjadrenie zmeny intenzity farbiva NOS3. 2.6 Štatistické metódy Všetky údaje sú reprezentované. SPSS11.{11}} štatistický softvérový balík sa používa na t-test a P<0.05 is="" considered="" a="" significant="">
Proti únave
3 Výsledky
3.1 Pozorovanie štruktúry tkaniva pod svetelným mikroskopom V normálnej kontrolnej skupine je štruktúra pečeňových lalokov jasná, bunkové povrazy sú usporiadané úhľadne, sínusoidy pečene sú normálne, pečeňové bunky nemajú žiadne zjavné lézie a jadrová štruktúra je jasná. V kontrolnej skupine pri cvičení zmizla normálna tkanivová štruktúra, laloky boli nejasné, bunkové povrazce boli neusporiadané, väčšina pečeňových sínusoidov zmizla a hepatocyty boli rozsiahlou vakuolárnou degeneráciou, ktorá sa prejavila zvýšeným objemom buniek, uvoľnenou cytoplazmou, svetlom sfarbením, a dokonca jasné a transparentné. Niektoré pečeňové bunky vykazovali typickú balónovitú zmenu s malým množstvom fokálnej alebo bodkovanej nekrózy. Pečeňové bunkyCistancheexperimentálna skupina boli mierne zakalené, ale boli usporiadané pravidelne, v bunkách neboli žiadne zjavné vakuoly a uvoľnenie, bunkové šnúry boli usporiadané úhľadne a štruktúra jadra bola jasná.
3.2 Účinky na aktivitu pečeňových izoenzýmov laktátdehydrogenázy u myší pri záťaži (pozri tabuľku 1)
Tabuľka 1 ÚčinokCistanchena pečeňový izoenzým laktátdehydrogenázy naloženého Xiaofeng (x±s)
Poznámka: V porovnaní s normálnou kontrolnou skupinou P<0, 05;="" compared="" with="" the="" exercise="" control="" group,=""><0.05 (the="" same="">
3.3 Pozorovanie farbenia pečeňového glykogénu svetelným mikroskopom. Hoci obsah glykogénu v normálnej kontrolnej skupine nie je vysoký, v každej pečeňovej bunke bez vakuol je glykogén rovnomerne distribuovaný; kontrolná skupina pri cvičení má menej glykogénu, rozptýleného v pečeni Bunky, v niektorých oblastiach sa objavili vakuoly; aCistancheexperimentálna skupina bola bohatá na glykogén, ale nazbieralo sa veľa na jednej strane bunky. 3.4 Pozorovanie expresie syntázy oxidu dusnatého 3 svetelným mikroskopom a kvantitatívna analýza obrazu. Cytoplazma normálnych kontrolných hepatocytov vykazovala silnú pozitívnu expresiu v difúznej distribúcii, najmä v binukleárnych bunkách, a pozitívnu expresiu v endotelových bunkách. . Expresia v cytoplazme hepatocytov a endotelových buniek v kontrolnej skupine pri cvičení bola oslabená. Experimentálna skupina cistanche vykazovala pozitívnu expresiu v cytoplazme hepatocytov a silnú pozitívnu expresiu v endotelových bunkách. Výsledky analýzy analyzátora farebných obrázkov sú uvedené v tabuľke 2.
Tabuľka 2 Porovnanie rozdielu expresie №s3 v hepatocytoch a endotelových bunkách (x±s)
4 Diskutujte
Že ľudské telo potrebuje energiu na cvičenie a telo potrebuje aj energiu v procese metabolizmu. Bunkový metabolizmus priamo využíva energiu z rozkladu adenozíntrifosfátu (ATP). Energiu potrebnú na syntézu ATP v konečnom dôsledku poskytuje hlavne katabolizmus cukru. Štúdie ukázali, že po namáhavom cvičení si telo vytvorí veľké množstvo H', voľných radikálov, kyseliny mliečnej a ďalších látok, ktoré ovplyvňujú normálny metabolizmus buniek. Nedostatok glukózy v bunkách zároveň vedie kúnava z cvičeniaa poškodenie buniek. Výsledky tejto štúdie ukazujú, že poškodenie štruktúry pečeňového tkaniva je po veľkom počte cvičení veľmi vážne a ovplyvňuje aj syntézu buniek, ako je zníženie syntézy pečeňového glykogénu. Po mnohých cvičeniach, myši braťCistanchemôže pozorovať zníženie poškodenia pečene, najmä v dôsledku zníženia LDH5, a obsah pečeňového glykogénu je výrazne vyšší ako v kontrolnej skupine pri cvičení, čo naznačuje, že Cistanche môže dosiahnuť ochranu pečene a udržať normálnu fyziológiu znížením funkcie LDH5. Z výsledkov farbenia glykogénom.
Obsah glykogénu v experimentálnej skupine Cistanche je vyšší ako v normálnej kontrolnej skupine. Zvyšuje Cistanche ukladanie glykogénu v pečeni pred cvičením alebo urýchľuje syntézu glykogénu v strese po cvičení. Pretože neexistuje žiadna kontrola bez cvičeniaCistanchev experimente. Nie je možné vyvodiť záver a je potrebné ho potvrdiť v ďalšom kroku, ale ochrannýúčinok Cistanchena pečeň a podpora syntézy glykogénu po množstve cvičení sú zrejmé. N{{0}} je látka s malou molekulou, ktorá bola v posledných rokoch vysoko cenená športovou komunitou. NOS je hlavným faktorom obmedzujúcim rýchlosť produkcie N0. Potvrdilo sa, že NOS má tri typy izoenzýmov a NOSI sa nazýva neuronálna syntáza oxidu dusnatého.
Enzým, ktorý existuje v neurónových bunkách, bunkách kostrového svalstva atď., sa podieľa hlavne na neurovývoji, neurosekrécii, učení a procesoch pamäti: NOS2 je indukovateľná syntáza oxidu dusnatého, ktorá sa nachádza hlavne v bunkách hladkého svalstva, makrofágoch a lymfocytoch. Tento enzým je indukovaný, môže pokračovať v syntéze NO až do vyčerpania substrátu alebo bunkovej smrti. V súčasnosti sa predpokladá, že sa podieľa na poškodení buniek; NOS3 je endoteliálna syntáza oxidu dusnatého, ktorá je distribuovaná hlavne v endoteliálnych bunkách a hepatocytoch a produkuje NO Hlavne sa podieľa na fyziologických funkciách. Výsledky tejto štúdie ukazujú, že po mnohých cvičeniach je expresia NOS3 v endotelových bunkách a hepatocytoch oslabená a výsledný N0 klesá, takže cievy nie je možné efektívne rozširovať, prietok krvi je znížený, a suroviny na syntézu glykogénu nemôžu byť transportované do pečeňových buniek, takže syntéza glykogénu je znížená. ;Cistanchemôže up-regulovať expresiu NOS3 v endotelových bunkách a pečeňových bunkách, reaktívne rozširovať krvné cievy, zvyšovať prietok krvi, urýchľovať schopnosť transportu surovín na syntézu glykogénu, urýchľovať syntézu glykogénu a udržiavať telo na normálnej fyziologickej metabolickej úrovni. Preto zníženie LDH5 na ochranu pečene a upregulácia expresie NOS3 na podporu glukoneogenézy kyseliny mliečnej môže byť dôležitým mechanizmom preCistanchechrániť pečeň a podporovať fyzické zotavenie. Tento výskum poskytuje vedecký experimentálny základ pre ďalší vývoj a využitieCistanchev oblasti športovej medicíny a tiež kladie základy pre rozvoj a očistu oCistancheov efektlátok.
