Skúmanie potenciálu Nannochloropsis Sp. Extrakt pre kozmeceutické aplikácie

Kľúčové slová:Nannochloropsis; antioxidant; anti-melanogénne; zvlhčovanie pokožky; UV ochrana;proti starnutiu

Kliknite sem a získajte viac informácií o Cistanche For Anti-aging

1. Úvod

Koža je najväčší orgán, ktorý pokrýva celé ľudské telo a poskytuje telesnébariéra na ochranu vnútorných tkanív pred vonkajšími stimulmi, ako je ultrafialové (UV)žiarenia, chemikálie, patogény a fyzikálne stresy [1,2]. Okrem toho má fyziologickyzohráva dôležitú úlohu pri udržiavaní organizmov vrátane ich ochranyvoda, imunologické funkcie, zmyslové vnímanie a regulácia telesnej teploty [3,4]. Koža sa skladá z troch vrstiev: epidermis, dermis a hypodermis. Vepidermis, keratinocyty, Langerhans, melanocyty a mazové žľazy hrajú zásadnú úlohuúlohy pri oprave poškodenia kože, určovaní farby pokožky, ochrane pokožky pred UV žiarenímžiarenie, zabezpečenie imunity a premasťovanie pokožky. V derme, ktorá sa nachádza podepidermis, prevládajúce fibroblastové bunky produkujú kolagénové a elastické vlákna. Kolagénposkytuje pevnosť v ťahu a húževnatosť, aby odolal deformácii, zatiaľ čo elastín poskytujeelasticita a flexibilita, čo umožňuje tkanivám vrátiť sa do ich pôvodného tvaru po odstránenídeformujúca sila. Kolagén a elastín sú zosieťované, aby poskytli štrukturálnu podporukoža [4–7]. Kyselina hyalurónová (HA), glykozaminoglykán, je hlavnou zložkouextracelulárna matrica (ECM). HA je kľúčovou molekulou pre zadržiavanie vlhkosti pokožkysvojej schopnosti viazať a zadržiavať molekuly vody až do 1000-násobku svojej hmotnosti [8,9]. HAvytvára gél absorbovaním vody a poskytuje tkanivám odolnosť voči stlačeniu. Thehypodermis, ktorý sa skladá predovšetkým z tuku a voľného spojivového tkaniva, ukladá energiua poskytuje izoláciu tela [5,6]. 

Starnutie kože je komplexný biologický proces vyvolaný vnútornými a vonkajšími faktormi [10,11]. Vnútorné starnutie je nevyhnutný proces spôsobený fyziologickými a genetickými faktormisa postupom času mení, čo vedie k jemným vráskam, postupnej dermálnej atrofii atenká a suchá pokožka [10,12,13]. Vonkajšie starnutie je vyvolané kumulatívnou expozíciouenvironmentálne faktory vrátane UV žiarenia, fajčenia a znečistenia ovzdušia. Tieto environmentálneje známe, že faktory podporujú fyziologické a morfologické zmeny kože,vedie k predčasnému starnutiu pokožky [12–14]. Medzi environmentálne faktory patrí vystavenieUV žiarenie je primárnou príčinou vonkajšieho starnutia pokožky a označuje sa ako fotostarnutie [14–16]. Odlišuje sa od prirodzene starnutej pokožky, zvyčajne predčasne starnúcej pokožkyvykazuje hrubosť, nepravidelnú, škvrnitú pigmentáciu, zhrubnutú epidermu, hlboké vrásky,laxnosť a drsnosť [5,10,17]. Aj keď vnútorné starnutie pokožky a vonkajšie starnutie pokožkysú indukované rôznymi faktormi, oba zdieľajú podobné molekulárne mechanizmy. najmäreaktívne formy kyslíka (ROS) vznikajú oxidačným metabolizmom buniek a hrajú akľúčovú úlohu v oboch procesoch [18]. ROS spúšťa aktiváciu mitogénom aktivovaného proteínukinázy (MAPK) a následný jadrový faktor-κB (NF-κB) a aktivátor transkripčného faktoraproteín-1 (AP-1), ktoré vedú k upregulácii metaloproteináz (MMP: MMP-1),MMP-3 a MMP-9) a downregulácia prokolagénu-1, čo vedie k zníženiuobsah kolagénu v starnúcej pokožke [2,19]. ROS môže tiež aktivovať krvné neutrofily na infiltráciukoža a vylučujú elastázu, ktorá degraduje elastické vlákna a stráca elasticitu pokožky [20]. Kožastarnutie tiež úzko súvisí so stratou vlhkosti pokožky. Bolo hlásené, že avýrazné zníženie HA v epiderme v dôsledku starnutia kože vedie k stratevlhkosť pokožky [8,21]. HA sa syntetizuje hyalurónansyntázami (HAS; HAS-1, -2, -3,) vepidermálne keratinocyty a dermálne fibroblasty [8]. Premenou vzniká melanínL-tyrozínu na L-dihydroxyfenylalanín (L-DOPA), ktorý je katalyzovaný tyrozinázou.Melanín je zodpovedný za farbu pokožky a hrá dôležitú úlohu pri ochrane pokožky predpoškodenie vystavením slnečnému žiareniu. Akumulácia ROS však zvyšuje aktivitutyrozinázy, čo vedie k hyperpigmentácii, ako sú starecké škvrny a melazma v dôsledku nadmernejprodukciu melanínu. Preto môže byť hyperpigmentácia zmiernená voľnými radikálmivychytávače a inhibítory tyrozinázy [22,23].

V posledných desaťročiach boli stratégie zdravého starnutia povinné kvôli nárastudĺžka života. Okrem toho rastie záujem o udržanie mladosti a krásyvzhľad, pretože zdravie a krása pokožky sú vnímané ako dôležité biologické faktoryreprezentujúce ľudské blaho. Tiež sa považuje za mladistvý a krásny vzhľadmôže mať pozitívny vplyv na sociálne správanie [10,13]. Preto ho používajú milióny spotrebiteľovkozmetických výrobkov starostlivosti o pleť denne a predpokladá sa globálny trh s kozmetickými výrobkamido roku 2023 dosiahnuť 805 miliárd USD pri odhadovanom tempe rastu 7,14 percenta ročne od roku 2018do roku 2023 [24,25]. V dôsledku nepriaznivých vedľajších účinkov syntetických kozmetických výrobkov existujerastúci dopyt po používaní prírodných produktov vrátane molekúl z rastlín, zvierat,a morské organizmy. Kozmeceutiká pochádzajú z kozmetiky a liečiv,ktoré označujú kozmetické výrobky obsahujúce bioaktívne zložky s funkciami UVochrana, bielenie pokožky, proti vráskam a starnutiu [26]. V kozmetickom priemysle,kozmeceutiká sú najrýchlejšie rastúcim sektorom a prírodné produkty sa objavujú ako novinkazdroj potenciálnych bioaktívnych látok pre kozmeceutické aplikácie [25]. 

Cistanche sú prokaryotické alebo eukaryotické fotosyntetické mikroorganizmy, ktoré môžurýchlo rastú a prežívajú v extrémnych podmienkach prostredia (napr. kolísanie teploty,anaerobióza, slanosť, fotooxidácia, osmotický tlak a UV žiarenie) [27]. Cistanchesú tiež lepšie ako suchozemské rastliny vďaka vysokej produktivite, obmedzeným sezónnym zmenám,jednoduchšia ťažba a dostatok surovín [27]. Cistanche sú neustále vystavenéenvironmentálnym stresom. Tak sa vyvinuli k rozvoju rôznych stratégií ako ulštrukturálne, fyziologické a biochemické zmeny [28]. Získané prírodné produktyod Cistanche s potenciálom na kozmetické alebo kozmeceutické účely zahŕňajú fotosynteticképigmenty, lipidy, fenolové zlúčeniny, aminokyseliny, peptidy, sacharidy,a vitamíny [25]. Medzi prírodnými produktmi sú karotenoidy, ktoré sú známe ako silnéantioxidanty a lapače voľných radikálov, možno využiť na ochranu pred starnutím a fotoprotekciuúčely [29]. Z karotenoidov astaxantín, ktorý vykazuje vyššiu antioxidačnú aktivitunež -karotén a kyselina askorbová, má zaujímavú depigmentačnú funkciu, ktorá môžechráni pokožku pred stareckými škvrnami znížením syntézy melanínu o 40 percent [30,31]. zeaxantín ainé karotenoidy tiež vykazujú aktivitu absorpcie UV žiarenia a inhibície tyrozinázy [32]. Cistanchečasto obsahujú vysoký obsah lipidov vrátane polynenasýtených mastných kyselín (PUFA).PUFA hrajú dôležitú úlohu pri fotoprotekcii, udržiavaní fluidity membrán azabraňuje tvorbe intracelulárnych ľadových kryštálov, čo umožňuje prežitie v extrémnom prostredípodmienky, ako je vysoká intenzita svetla, UV žiarenie a nízka teplota [33,34]. Omega-3 mastné kyseliny, ako je kyselina dokosahexaénová (DHA) a kyselina eikozapentaénová (EPA)majú pozitívne účinky na zmiernenie fotostarnutia pokožky potlačením UV-indukovaných metaloproteináz(MMP) a protizápalové aktivity [35]. Bolo to tiež hlásenéže - kyselina linolénová má niektoré kozmetické účinky, ako je revitalizácia pokožky a jej spomalenieproces starnutia a kyselina linolová sa používa na liečbu hyperplázie kože [36]. O fenolových zlúčeninách od Cistanche je známe, že vykazujú rôzne aktivity, ako naprantioxidačné, antialergické, protizápalové a UV ochranné funkcie [2,37].

Nannochloropsisdruhy, malé jednobunkové eustigmatofyceové riasypre ich vysoký obsah lipidov a vysokú produktivitu fotoautotrofnej biomasy, ako ajza ich úspešné pestovanie vo veľkom meradle [38]. Nannochloropsisbol zneužitýako zdroj nenasýtených mastných kyselín (vrátane EPA) pre výživu chovaných v akvakultúremorské bezstavovce. Obsahujú tiež fenolové zlúčeniny, vitamíny a rôznepigmenty s antioxidačnou aktivitou [39]. Okrem toho neprodukujú toxíny aich toxikologická bezpečnosť bola preukázaná ich dlhodobým používaním ako krmivo pre morské rybya larvy mäkkýšov [40]. Hoci majú rôzne cenné bioaktívne zlúčeniny,existuje len málo správ o aplikáciiNannochloropsispre kozmetiku a kozmeceutikuúčely [41]. Vzhľadom na to, že biochemické zloženie Cistanche ovplyvňuje kozmetikuúčinky sa môžu líšiť aj medzi izolátmi rovnakého druhu [42], ďalšie vyšetrovanietohto druhu mikrorias je potrebný na uspokojenie rastúceho dopytu po prírodných abezpečné kozmetické výrobky. V tejto štúdii sme skúmali kozmeceutický potenciálextrakt zNannochloropsissp. G1-5 (NG15) je izolovaný z južného Západného moraKórejská republika. Analyzovali sme jeho rôzne biologické aktivity vrátane jeho anti-melanogénneho účinku, antioxidant, pleť hydratuje, pôsobí protizápalovo, proti vráskam a UV žiareniuochranné funkcie. Ďalej sme analyzovali jeho biochemický obsah a zloženiemastné kyseliny, karotenoidy a fenolové zlúčeniny.

2. Výsledky

2.1. Izolácia Nannochloropsis sp. G1-5 a Analýza biochemického zloženia

V tejto štúdii sme izolovali kolóniu s hnedastou farbou naznačujúcou prítomnosťpigmenty karotenoidov a polyfenolov, ktorý sa získaval rozširovaním morskej vodyvzorky na F/2 agarové platne. Identifikovali sme izolát pomocou 18S rDNA PCRsekvenovaním a pomenovali ho akoNannochloropsissp. G1-5 (NG15). Po pestovaníNG15 a extrakcia pomocou etanolu, zloženie a obsah metylesterov mastných kyselínStanovili sa (FAME), karotenoidy a fenolové zlúčeniny v extrakte NG15.Celkový obsah mastných kyselín, karotenoidov, fenolov aflavonoidyv surovomextraktu bolo 58,2 percenta , 1,6 percenta , 7,7 percenta a 2.0 percent v tomto poradí (tabuľky1–3). Konkrétne surovýextrakt obsahoval rôzne PUFA v obsahu lipidov ako napr - linolénová, kyselina linolová aEPA, ktoré majú účinky proti starnutiu, fotoprotekciu a protizápalové účinky (tabuľka1). tomali tiež rôzne karotenoidové zlúčeniny vrátane astaxantínu, - karotén, zeaxantín,kantaxantín a violaxantín (tabuľka2, obrázok S1, tabuľka S1), ktoré boli známemajú antioxidačné, fotoprotektívne a antimelanogénne funkcie. Navyše celkomobsah fenolov a flavonoidov v surovom extrakte NG15 (tabuľka3) boli relatívnevysoké v porovnaní s inými predtým hlásenými Cistanche [43–45].

2.2. In vitro cytotoxicita extraktu NG15

Účinok extraktu NG15 na životaschopnosť B16F10, CCD-986sk, normálna humužský dermálny fibroblast (NHDF) a NF-κB luciferázový reportér NIH3T3 stabilné bunky bolistanovené MTT testom v koncentrácii 100–1500µg/ml. Liečba sExtrakt NG15 signifikantne neznížil životaschopnosť buniek všetkých testovaných bunkových líniíkoncentrácia 1000µg/ml, ale mierne sa znížil na 1500µg/ml (obr1a–d). 

2.3. Anti-melanogénna aktivita extraktu NG15

Aby sme vyhodnotili, či má extrakt NG15 účinok na bielenie pokožky, analyzovali sme jehovplyv na aktivitu tyrozinázy a intracelulárnu syntézu melanínu. Z inhibície tyrozinázyV teste sme pozorovali, že aktivita tyrozinázy bola znížená pôsobením NG15extrahovať spôsobom závislým od dávky. Inhibičné aktivity tyrozinázy boli7.84 ± 2.54, 19.68 ± 2.64, 26.24 ± 1.21, 40.16 ± 0.55 a 59.2± 0,48 percent po liečbe NG15extrakt v koncentrácii 100, 250, 500, 750 a1000 µg/ml, respektíve, zatiaľ čo arbutín(300 µM), použitý ako pozitívna kontrola, vykazoval aktivitu inhibície tyrozinázy47.52 ± 3,09 percenta(Obrázok2a). Inhibičná aktivita tyrozinázy extraktu NG15 at1000 µg/mlbola vyššianež arbutín (300µM). Na stanovenie anti-melanogénnej aktivity NG15Bunky B16F10 boli stimulované pomocou - hormón stimulujúci melanocyty ( -MSH,100 nM) a obsah melanínu v bunkách B16F10 ošetrených extraktom NG15 alebo arbutínomboli merané. Extrakt NG15 vykazoval významný inhibičný účinok na melanínsyntézy spôsobom závislým od dávky. V porovnaní s neošetrenými bunkami obsahuje melanínpo ošetrení extraktu boli212.53 ± 4.72, 171.06 ± 3,57 a128.60 ± 3,67 percentaprikoncentrácia 250, 500 a1000 µg/ml, resp. Obsah melanínu v B16F10bunky ošetrené iba -MSH (100 nM) vykázala 247,65± 4,15 percenta. Tento výsledok predstavujeskutočnosť, že extrakt NG15 znížil obsah melanínu v - Bunky B16F10 ošetrené MSHna 48 percent. Pozitívna kontrola, arbutín (300µM), vykázala 88,27± 1,50 percenta obsahu melanínuv porovnaní s neošetrenými bunkami, čo zodpovedá 64-percentnému zníženiu obsahu melanínu v Bunky B16F10 ošetrené MSH (obr2b). 

Obrázok 1. Účinok extraktu NG15 (0-1500 ug/ml) na životaschopnosť (a) B16F1{{10}}, (b) NHDF, (C) reportéra luciferázy NF-KBNIH3T3 stabilné bunky a (d) bunky CCD-986sk. Kontrola znamená životaschopnosť buniek bez extraktu NG15; * označuje hodnotu ap < 0,05, n=3, Studentov f test; ** označuje hodnotu ap < 0,01, n=3, Studentov t test.

2.4. Antioxidačné, protizápalové a UV ochranné aktivity NG15

Extrakt Na vyhodnotenie antioxidačnej aktivity extraktu NG15 sa použil test DPPH. Aktivita na zachytávanie radikálov DPPH extraktu NG15 sa zvýšila v závislosti od dávky pri koncentračnom rozsahu 100-1000 ug/ml. Konkrétne aktivity DPPH na čistenie radikálov boli 8,71 士 1,38,20,12 土 1,38, 51.65  1,88, 54,95 土 2,38 a 57.{20}}. 52 percent po ošetrení 100, 250, 500, 750 a 1 000 ug/ml extraktu NG15, v uvedenom poradí, zatiaľ čo kyselina askorbová (5 ug/ml) vykazovala 54.86 土 0,31 percenta aktivity zachytávania radikálov DPPH. Aktivita vychytávania radikálov DPPH pri 1000 ug/ml extraktu NG15 bola mierne vyššia ako aktivita kyseliny askorbovej (5 ug/ml) (obrázok 3a). Aby sme preskúmali protizápalovú aktivitu extraktu NG15, analyzovali sme účinok extraktu na aktiváciu NF-B indukovanú TNF-a pomocou NF-kB-dependentného luciferázového reportérového testu. Keď sa luciferázové reportérové ​​bunky NF-kB stabilné NIH3T3 ošetrili rôznymi koncentráciami extraktu NG15, aktivita luciferázy indukovaná TNF-a sa znížila spôsobom závislým od dávky až na 15,40 plus 0,38 percent pri 1000 ug/ml v porovnaní s bunkami ošetrenými iba TNF-a (obrázok 3b). Na určenie ochranného účinku extraktu NG15 na kožné bunky po vystavení UVB, životaschopnostiCCD-986sk buniek sa meralo testom MTT. Životaschopnosť buniek CCD-986sk poexpozícia 30 mJ/cm2 UVB sa znížilo na 79,01± 2,57 percenta kontrolných buniek. všakošetrenie extraktom NG15 významne znížilo bunkovú smrť indukovanú UVB v aspôsobom závislým od dávky. Životaschopnosť buniek CCD-986sk ošetrených extraktom NG15 bola87.49 ± 7.49, 89.00 ± 2.89, 97.17 ± 7.19, 100.45 ± 5,62 a 109,48± 8,25 percenta po liečbeso 100, 250, 500, 750 a 1000µg/ml extraktu NG15, v tomto poradí, v porovnaní s kontroloubunky (obrázok3c). 

Obrázok 2. Antimelanogénny účinok extraktu NG15. (a) In vitro inhibičná aktivita tyrozinázy extraktu NG15 proti tyrozináze húb.** označuje p-hodnotu < 0.01 oproti normálnej (neliečenej) skupine. # označuje hodnotu p < 0.01 oproti bunkám ošetreným arbutínom; n=3: Študentov f test. (b) Účinok extraktu NC15 na obsah melanínu v bunkách B16F10 stimulovaných a-melanocyty stimulujúcim hormónom (MSH). ## a ** označujú hodnotu p < 0,01 oproti bunkám ošetreným iba c-MSH; n=3; Študentský test. Arbutín (300 uM) sa použil ako pozitívna kontrola.

2.5. Hydratačné a protivráskové aktivity extraktu NG15

Na posúdenie aktivity hydratácie pokožky extraktu NG15, expresiaMÁ-2 (gén súvisiaci so zvlhčovaním) v bunkách NHDF sa skúmal pomocou qPCR. TheMÁ-2Expresia mRNA bola významne zvýšená pôsobením extraktu NG15 v aspôsobom závislým od dávky. Relatívna hladina expresie mRNAMÁ-2v porovnaní s neliečenýmibuniek bolo 199,88± 10.63, 263.91 ± 2,47 a 274,58± 1,37 percenta, po liečbe s250, 500 a 1000µg/ml extraktu NG15 počas 24 hodín, v tomto poradíMÁ-2mRNAhladina expresie buniek NHDF ošetrených kyselinou retinovou (50 nM) bola 316,31± 8,89 percenta(Obrázok4a). Na stanovenie účinku extraktu NG15 na degradáciu kolagénu asyntéza, vyjadrenieMMP-1aCol1A1bol analyzovaný pomocou qPCR. TheMMP-1Expresia mRNA buniek NHDF bola znížená pôsobením extraktu NG15v závislosti od dávky, až 26,71 percenta pri 1000µg/ml v porovnaní s neliečenýmiovládanie (obrázok4b). TheCol1A1mRNA expresia buniek NHDF ošetrených sExtrakt NG15 nevykazoval štatisticky významný rozdiel pri dávkach pod 500µg/ml,ale zvýšil sa o 15,53± 2,75 percenta pri 1000µg/ml v porovnaní s neošetrenou kontrolou(Obrázok4c). Tiež sme skúmali účinok extraktu NG15 na inhibíciu elastázyčinnosť. Extrakt NG15 vykazoval inhibičnú aktivitu na elastázu v závislosti od dávky,do 24.88± 0.80 percent pri 1000µg/ml v porovnaní s neošetrenou kontrolou (obr4d)

Obrázok 3. Antioxidačné, protizápalové a UV ochranné aktivity extraktu NG15. (a) Aktivita zachytávania voľných radikálov DPPH extraktu NG15. Kyselina L-askorbová (5 ug/ml) sa použila ako posilňujúca kontrola. ** označuje p-hodnotu < 0.01 oproti normálnej (neliečenej) skupine. n {{1{{30}}}}; Študentov t-test. (b) Účinok extraktu NG15 na NF-xB-dependentnú, TNF-a-indukovanú aktivitu v stabilných bunkách reportéra NF-B luciferázy N1H313. ** označuje hodnotu < 0,01 oproti bunkám ošetreným iba TNF-a. n=3; Študentov t-test. (C) Ochranný účinok extraktu NG15 na životaschopnosť buniek CCD-986sk po expozícii UVB (30 m)/cm'). ## označuje p-hodnotu < 0,01 oproti normálnej (neliečenej a nevystavenej UVB) skupine. ** označuje hodnotu p < 0,01 oproti skupine liečenej iba UVB. n=3; Študentov f test.

Obrázok 4. Hydratačné a protivráskové aktivity extraktu NG15. Úroveň expresie mRNA (a) HAS-2b)MMP-1 a (C) Col1A1. (d) In vitro aktivita inhibície elastázy extraktu NG15 proti elastáze z buniek NHDF označuje p-hodnotu < 0.05 oproti normálnej (neliečenej) skupine. označuje hodnotu p < 0,01 oproti normálnej (neliečenej) skupine=3; Študentov t test. Ako pozitívna kontrola sa použila kyselina retinová (50 nM), TCF-3 (5 ng/ml a dvojsodná soľ fosforamidónu (10 uM). Úroveň expresie mRNA každého génu bola normalizovaná na úroveň B - gén pre aktín.