Expresia imunoglobulínu G v ľudských proximálnych tubulárnych epiteliálnych bunkách

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com

ZHENLING DENG a kol

Abstraktné. Proximálnyrúrkovýepitelové bunky (PTEC) majú vrodené imunitné vlastnosti a produkujú prozápalové faktory, chemokíny a zložky komplementu, ktoré riadia epitelovo-mezenchymálny prechod (EMT). Naše predchádzajúce štúdie odhalili, že ľudské mezangiálne bunky a podocyty boli schopné syntetizovať a vylučovať imunoglobulín (Ig) A a IgG. Cieľom tejto štúdie bolo zhodnotiť expresiu Ig v PTEC. Po prvé, IgG sa detegoval v cytoplazme, bunkovej membráne a lúmenePTECv normálnej obličkovej kôre týmimunohistochémia. Po druhé, transkripcia génu Ig a rekombinácia V(D)J sa detegovali v jednotlivých PTEC pomocou vnorenej PCR a Sangerovho sekvenovania. Po tretie, Ig, IgK a Igλ boli jasne detegované v imortalizovanej línii PTEC (HK-2) imunofarbením a westernovým prenosom, v ktorom sa použil RP215 (protilátka, ktorá sa prevažne viaže na IgG nepochádzajúce z B buniek). Okrem toho boli v bunkách HK-2 detegované génové transkripty Ig, IgK a Igλ, konzervatívna rekombinácia V(D)J vo variabilnej oblasti Ig, gén aktivujúci rekombináciu 1/2 a aktiváciou indukovaná cytidíndeamináza. Tieto údaje naznačujú, že PTEC môžu exprimovať IgG podobným spôsobom ako B bunky. Okrem toho expresia IgG bola upregulovaná TGF-1 a môže sa podieľať na EMT.

Kľúčové slová:proximálnerúrkovýepitelové bunky, jednobunkové, HK‑2, IgG, epitelovo-mezenchymálny prechod

Cistanche tubulosa zabraňuje ochoreniu obličiek, kliknite sem a získajte vzorku

Úvod

Proximálnyrúrkovýepitelové bunky (PTEC) sú najrozšírenejším typom buniek vobličkya majú dôležitú úlohu pri oprave obličiek a/alebo progresii chronických ochorení obličiek. PTEC vykonávajú imunologické funkcie expresiou viacerých Toll-like receptorov (TLR), ako sú TLR 1, 2, 3, 4 a 9 (1,2), a molekúl spojených s funkciou buniek prezentujúcich antigén, vrátane MHCII, CD74, CD80 a CD86 (3). Tieto vrodené imunitné vlastnosti PTEC im umožňujú pôsobiť ako imunitné odpovede na širokú škálu stimulov s následnou produkciou a uvoľňovaním bioaktívnych mediátorov, vrátane prozápalových cytokínov, chemokínov a zložiek komplementu, ktoré poháňajú intersticiálny zápal a fibrózu (4). PTEC tiež exprimujú neonatálne Fc receptory a zachovávajú schopnosť špecifickej väzby závislej od pH a transcytózy imunoglobulínu (Ig)G (5). Podľa našich najlepších vedomostí však zostáva neznáme, či PTEC exprimujú Ig.

Predtým sa predpokladalo, že Ig sú produkované výlučne zrelými B bunkami a plazmatickými bunkami a že Ig pôsobia ako protilátky na rozpoznávanie a neutralizáciu rôznych patogénov. Táto teória však bola v posledných desaťročiach spochybnená, pretože stále viac dôkazov uvádza, že Ig, vrátane IgA, IgG a IgM, môžu byť produkované a vylučované non-B bunkami, ako sú ľudské epiteliálne rakovinové bunky (6,7) a normálne non-B bunky (8,9), ako aj na imunitne privilegovaných miestach, ako sú oči (10), centrálne neuróny (11,12), placenta (13) a semenníky a nadsemenníky (14)

Podobne ako Ig odvodené z B buniek (B-Igs), non-B-Ig sú tiež produktmi transkripcie a preskupenia Ig génu a vykazujú klasické V(D)J rekombinačné vzory s adíciami nukleotidov na spojeniach a somatickými hypermutáciami (7, 11,14). Na rozdiel od B-Ig, iné ako B-Ig vykazujú obmedzené vzorce rekombinácie V(D)J a menšiu diverzitu (7). Funkčne, non-B-Ig nielenže prejavujú prirodzenú protilátkovú aktivitu v koži a sliznici (8), ale môžu pôsobiť aj ako rastové faktory na podporu bunkovej proliferácie a adhézie a môžu zvýšiť iniciáciu a metastázu rakoviny väzbou na integríny ( 15-17). Napríklad RP215 rozpoznaný rakovinový IgG vykonáva svoju onkogénnu funkciu interakciou s komplexom integrínu 6 4 a aktiváciou dráh FAK a Src (15).

Naša predchádzajúca štúdia preukázala, že mezangiálne bunky (18) a podocyty (19) môžu syntetizovať a vylučovať IgA a IgG a podieľať sa na raste buniek a bunkovej adhézii in vitro. Cieľom tejto štúdie bolo zhodnotiť hladiny expresie Ig v PTEC a preskúmať ich potenciálnu úlohu v epiteliálno-mezenchymálnom prechode (EMT).

Účinky cistanche: prospieva obličkám

Materiály a metódy

Bunková kultúra a liečba.Z American Type Culture Collection bola zakúpená zvečnená PTEC línia HK-2. Bunky HK-2 sa kultivovali v DMEM/F12 doplnenom 100 U/ml penicilínu, 0,1 mg/ml streptomycínu (všetky Gibco; Thermo Fisher Scientific, Inc.) a 10 percentným fetálnym bovinným sérom (FBS; pôvod z Austrálie, Biological Industries USA, Inc.) pri 37˚C v atmosfére obsahujúcej 95 percent vzduchu a 5 percent CO2. Aby sa zabránilo interferencii Ig v FBS, médium bolo nahradené médiom bez séra 24-48 hodín pred zberom buniek. Bunky HK‑2 boli ošetrené rôznymi koncentráciami (2, 5 a 10 ng/ml) TGF‑1 (Sigma‑Aldrich; Merck KGaA).

Izolácia jednej PTEC a syntéza cDNA.Vzorka ľudskej obličky makroskopicky normálneho kortikálneho tkaniva bola získaná od pacienta (muž, 31 rokov), ktorý podstúpil nefrektómiu v dôsledku renálneho karcinómu bez zjavnej renálnej dysfunkcie. Jednobunková suspenzia sa pripravila štiepením obličkovej kôry 1 mg/ml kolagenázy I (Sigma-Aldrich; Merck KGaA) pri 37 °C počas 20 min. PTEC boli triedené pomocou anti-CD10 konjugovanej s fykoerytrínom (PE) (kat. č. 312203) a anti-CD13 konjugovanej s alofykokyanínom (APC) (kat. č. 301705; obe BioLegend, Inc.) fluorescenčne aktivovaným triedením buniek ( BD FACSAria II Special Order System), ako už bolo opísané (20). Na vylúčenie nešpecifického zafarbenia sa použili zodpovedajúce izotypové kontrolné protilátky (kat. č. 400111 a 400119; obe BioLegend, Inc.). Dvakrát pozitívne označené živé bunky boli izolované ako PTEC. Jeden PTEC bol manuálne vybraný pod inverzným svetelným mikroskopom pomocou kapilárnej pipety a potom bol prenesený do 0,2 ml tenkostennej PCR skúmavky obsahujúcej lyzačný pufor (21). Extrakcia jednotlivej PTEC RNA a syntéza cDNA sa uskutočnili podľa skôr opísaných metód (21). Na detekciu transkripcie a preskupenia Ig génu sa použilo celkom päť jednotlivých PTEC.

PCR amplifikácia.Celková RNA bola extrahovaná z buniek HK‑2, mononukleárnych buniek periférnej krvi [PBMC, izolované od 31-ročnej zdravej darkyne pomocou Ficoll (kat. č. 7111011; Dakewe Biotech., Ltd.) ] a obličkovej kôry (od toho istého pacienta použitého pri jedinej izolácii PTEC) s použitím činidla TRIzol® (Invitrogen; Thermo Fisher Scientific, Inc.) a koncentrácia RNA bola hodnotená pomocou spektrofotometra NanoDrop (NanoDrop; Thermo Fisher Scientific, Inc.) . Následne boli 2 ug celkovej RNA reverzne transkribované do cDNA pomocou súpravy RevertAid First Strand cDNA Synthesis kit (kat. č. K1622; Thermo Fisher Scientific, Inc.). PCR sa uskutočnila s použitím primérov zacielených na konštantné oblasti Ig, IgK, IgX a aktiváciou indukovanú cytidíndeaminázu (AID). Nested PCR sa uskutočnila na amplifikáciu variabilnej oblasti Ig, proteínu 2 súvisiaceho s lipoproteínovým receptorom s nízkou hustotou (LRP2) a génu aktivujúceho rekombináciu (RAG)1 a RAG2. Produkty PCR sa separovali elektroforézou na 1,0 percentnom agarózovom géli a vizualizovali sa pomocou GelRed (kat. č. 41003; Biotium, Inc.). Priméry AID, RAG1/2 a konštantné oblasti Ig, IgK, IgX použité v tejto štúdii sa týkajú primérov, ktoré použil Jing et al (19). Priméry Ig variabilnej oblasti sa týkajú primérov, ktoré použil van Dongen et al (22). Ostatné priméry použité pre PCR sú uvedené v tabuľke SI. Podmienky termocyklovania sú uvedené v tabuľke SII.

Sangerove sekvenovanie a analýzy sekvenčných údajov.Produkty PCR Ig variabilnej oblasti získané z jednotlivých PTEC, HK-2 buniek a PBMC boli klonované do pGEM-T Easy Vector System I (kat. č. A1360; Promega Corporation), ktorý bol transformovaný do TOP10 kompetentných buniek (CB104; Tiangen Biotech Co., Ltd.). Stručne, 5 ul ligačných produktov sa pridalo k 30 ul TOP10 kompetentných buniek, inkubovalo sa na ľade počas 30 minút, tepelne šokovalo pri 42 °C počas 90 sekúnd a inkubovalo sa na ľade počas 5 minút. Potom sa pridalo 500 ul LB a nechalo sa stáť pri 37 °C 40 minút pred naočkovaním časti bakteriálnej tekutiny na Petriho misky potiahnuté 0,1 mmol/l IPTG a 20 ug/ml X‑Gal. Misky sa cez noc prevracali pri 37 °C. Celkovo sa náhodne vybralo 5-16 bielych kolónií na vzorku a sekvenovalo sa pomocou genetického analyzátora ABI 3730XL (Applied Biosystems; Thermo Fisher Scientific, Inc.). Preusporiadané V(D)J sekvencie sa porovnali so sekvenciami v základnom nástroji na vyhľadávanie lokálneho zarovnania (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/), aby sa identifikovali najlepšie zodpovedajúce zárodočné génové segmenty a spojenia po orezaní primérov. .

Western blot analýza.Bunky HK-2 boli lyzované v TSD lyzovacom pufri [1 percento SDS, 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 50 mM DTT] obsahujúcom koktail inhibítora proteázy (Applygen Technologies Inc.), sonikované v ľadovej vode počas 1 minúty ( pracuje 5 sekúnd a odpočíva 15 sekúnd; 3-krát) a lýzuje sa 30 minút pri teplote miestnosti. Po centrifugácii pri 12, 000 xg počas 10 minút pri 4 °C sa stanovila koncentrácia proteínu v bunkovom lyzáte pomocou súpravy BCA (Applygen Technologies Inc.). Následne bol k lyzátu pridaný 5X redukčný nanášací pufor, varený pri 100 °C počas 10 minút a vzorky boli okamžite použité na analýzu Western blot. Sérum, použité ako pozitívna kontrola pre Ig, sa izolovalo od zdravého darcu (rovnakého darcu, aký sa použil v PBMC) centrifugáciou pri 2 103 xg počas 10 minút pri teplote miestnosti.

Účinky cistanche: prospieva obličkám

Western blot sa uskutočnil podľa štandardných postupov. Stručne, 3{{40}}} ug proteínov sa separovalo pomocou SDS-PAGE na 10 percentných géloch a prenieslo sa na nitrocelulózovú membránu. Následne bola membrána blokovaná v 5% odstredenom mlieku pri izbovej teplote počas 1 hodiny a bola inkubovaná s primárnymi protilátkami pri 4˚C cez noc, vrátane králičích anti-ľudských Ig (kat. č. ab109489; 1:1,{{8} }), králičie anti-humánne Ig 4 (kat. č. ab109493; 1:1,000), anti-Igκ (kat. č. ab124727; 1:10,000), anti‑ Igλ (kat. č. ab124719; 1:20,000), králičí anti-humánny ‑aktín (kat. č. ab8227; 1:2,000) (všetky od Abcam) a RP215 monoklonálna protilátka (mAb) (darovaná profesorom Xiaoyanom Qiu, Pekingská univerzita, Peking, Čína; 1:1,000), ktorá špecificky identifikovala epitop spojený s sacharidmi na non-B-Ig . Membrána sa potom inkubovala s kozou anti-králičou (kat. č. 926-32211) alebo anti-myšou (kat. č. 926-32210) sekundárnymi protilátkami IgG-IRDyeTM680CW (obe 1:10,000; obe LI‑COR Biosciences) pri izbovej teplote počas 1 hodiny. Signál bol detekovaný pomocou systému Odyssey Imaging a softvéru Odyssey V3.0 (oba LI‑COR Biosciences). Na semikvantifikáciu bol použitý softvér ImageJ (verzia 1.8.0; National Institutes of Health).

Purifikácia IgG a hmotnostná spektrometria.Po kultivácii buniek HK-2 v DMEM/F12 bez FBS počas 48 hodín sa supernatant kultúry zhromaždil po centrifugácii pri 2,1{10}}3 xg počas 10 minút pri 4 °C. Bunkový supernatant bol purifikovaný afinitnou chromatografiou s použitím proteín G Sepharose podľa pokynov výrobcu (kat. č. 17-0618-02; Thermo Fisher Scientific, Inc.). Eluent sa ultrafiltroval, aby sa elučný pufor (0,1 M glycín; pH 2,4) nahradil PBS. Purifikované proteíny sa oddelili pomocou SDS-PAGE na 10 percentných géloch, detegovali sa westernovým prenosom a ďalej sa analyzovali hmotnostnou spektrometriou, ktorú vykonala spoločnosť Beijing Protein Innovation Co., Ltd.

Imunofluorescencia.Bunky HK-2 boli kultivované na krycích sklíčkach, ktoré boli fixované v studenom neriedenom acetóne počas 5 minút pri izbovej teplote. Následne boli sklíčka dvakrát premyté v PBS a blokované 5 percentami FBS/PBS pri teplote miestnosti počas 20 minút, potom boli inkubované s primárnymi protilátkami pri 4 °C cez noc. Protilátky boli rovnaké ako tie, ktoré sa použili pri westernovom prenose: králičie anti-ľudské Ig (1:150), anti-ľudské IgK (1:250), anti-ľudské Igλ (1:250) a RP215 mAb (1:200 ); PBS sa použil ako negatívna kontrola. Po premytí v PBS boli sklíčka inkubované s fluoresceín izotiokyanátom označenými kozími antikráličími (kat. č. A11008) alebo kozími anti-myšími (kat. č. A11001) IgG protilátkami (1:1,000); Invitrogen; Thermo Fisher Scientific, Inc.) pri teplote miestnosti počas 1 hodiny. Jadrá boli zafarbené DAPI. Obrázky boli zachytené pod fluorescenčným mikroskopom Leica DFC300 FX (Leica Microsystems GmbH).

Imunohistochemické farbenie.Parakancerózne obličkové kôry boli odobraté od štyroch pacientov mužského pohlavia (vek, 38-49 rokov) s renálnym karcinómom. Normálne parakancerózne obličkové kôry po nefrektómii sa fixovali 10 percentným formalínom počas 48 hodín pri izbovej teplote a potom sa zaliali do parafínu. Vzorky ľudskej obličky zaliate do parafínu boli narezané na 3 μm rezy a zbavené parafínu a rehydratované prostredníctvom série odstupňovaných koncentrácií etanolu. Antigén sa získal varom v 0.05 M Tris‑EDTA (pH 9,0) v tlakovom hrnci počas 3 minút. Rezy sa potom inkubovali s 3 percentným roztokom H2O2 počas 10 minút pri teplote miestnosti, aby sa eliminovala endogénna peroxidáza a inkubovali sa s normálnym kozím sérom (kat. č. ZLI-9022, ZSGB-BIO, Čína) počas 30 minút pri teplote miestnosti, aby sa zablokovala nešpecifická väzbové miesta protilátky pri izbovej teplote. Následne sa uskutočnilo nepriame imunohistochemické farbenie s primárnymi protilátkami pri 4˚C cez noc, vrátane RP215 mAb (1:200; 5 µg/ml), králičích anti-ľudských Ig (1:2,000), anti-humánnych IgK (1:1,000), anti-humánne Igλ (1:1,000) (rovnaké protilátky, aké sa používajú pri westernovom prenose). Rezy bez primárnych protilátok sa použili ako negatívne kontroly. Sklíčka sa potom inkubovali s neriedenými sekundárnymi protilátkami značenými chrenovou peroxidázou (kat. č. PV-6001 a PV-6002; obe OriGene Technologies, Inc.) pri teplote miestnosti počas 30 minút. Naviazané protilátky boli detegované pomocou diaminobenzidínu. Nakoniec boli sklíčka kontrastne zafarbené hematoxylínom. Obrázky boli zachytené pomocou svetelného mikroskopu (zväčšenie x 200). Štatistická analýza. Údaje sú prezentované ako priemer ± štandardná odchýlka a boli analyzované pomocou SPSS 20.0 pre Windows (IBM Corp.). Všetky experimenty sa opakovali 3-krát. Rozdiely medzi viacerými skupinami boli analyzované pomocou jednosmernej ANOVA a Tukeyho posthoc testu. P<0.05 was="" considered="" to="" indicate="" a="" statistically="" significant="">

Účinky cistanche: prospieva obličkám

Výsledky

Expresia IgG v renálnych tubulárnych epiteliálnych bunkách kôry obličiek.Normálne obličkové kôry, ktoré boli odobraté od darcov podstupujúcich nefrektómiu v dôsledku karcinómu obličkových buniek, sa použili na stanovenie expresie IgG v renálnych tubulárnych epitelových bunkách imunohistochémiou s použitím protilátok proti ľudskému Ig, IgK, Igλ a RP215 (protilátka, ktorá prevažne sa viaže na non-B-IgG). Pozitívne farbenie ťažkých a ľahkých reťazcov IgG nebolo detegované len v PTEC, ale aj v epitelových bunkách distálnych stočených tubulov, buď v cytoplazme, bunkovej membráne alebo tubulárnom lúmene (obr. 1).

Transkripcia a V(D)J rekombinácia IgG v jednotlivých PTEC. Aby sa predišlo interferencii reziduálnej krvi, väzby a transcytózy IgG prostredníctvom PTEC v kôre obličiek a aby sa získal priamy dôkaz expresie IgG v PTEC, jednotlivé PTEC boli triedené z kôry ľudskej obličky pomocou spoločného značenia CD10 a CD13 podľa prietoku cytometria (20). Ako je znázornené na obr. 2A, CD10/CD13 dvojito pozitívne PTEC predstavovali 4,1 percenta životaschopných buniek vo vzorke. Izolované PTEC boli ďalej potvrdené pomocou špecifického markerového génu LRP2 a kontaminácia B-buniek bola eliminovaná CD19. Transkripty Ig variabilnej oblasti boli amplifikované v piatich jednotlivých PTEC pomocou nested PCR (obr. 2B a C). Výsledky Sangerovho sekvenovania odhalili, že PTEC vykazovali funkčnú a konzervatívnu VDJ rekombináciu ťažkého reťazca IgG (tabuľka I), čo naznačuje, že expresia IgG sa môže vyskytnúť v PTEC.

Expresia ťažkého a ľahkého reťazca IgG v bunkách HK-2. Keďže bolo ťažké detegovať expresiu IgG proteínu v jedinom PTEC a získať dostatok PTEC pre western blotting, na ďalšie potvrdenie expresie IgG proteínu bola vybraná bunková línia HK-2, ktorá pozostáva z imortalizovaných PTEC. Imunofluorescenčná analýza preukázala pozitívne farbenie Ig, IgK a IgX v cytoplazme a silnejšie pozitívne farbenie RP215 prevažne v cytoplazme a bunkovej membráne (obr. 3A).

Následne bola expresia ťažkých a ľahkých reťazcov IgG v bunkách HK-2 detegovaná westernovým prenosom za redukčných podmienok. Na elimináciu interferencie FBS v kultivačnom médiu bolo médium obsahujúce FBS blotované zodpovedajúcimi protilátkami a zafarbené negatívne. Komerčná IgG protilátka bola schopná detegovať IgG odvodený zo séra, ale nie IgG odvodený od HK-2. Naproti tomu RP215 dokázal detekovať IgG odvodený od HK‑2, ale nie sérový IgG. Komerčná IgG protilátka aj RP215 boli schopné detegovať Ig pri 55 kDa. V bunkách HK‑2 bol detegovaný pás Ig 4 (36 kDa), čo je v súlade s predpokladanou molekulovou hmotnosťou. Okrem toho sa v bunkových lyzátoch pozorovali expresie IgK (25 kDa) a IgX (50 kDa, dimér) (obr. 3B). Následne bol IgG v bunkovom supernatante purifikovaný proteínom G, potvrdený westernovým prenosom a sekvenovaný hmotnostnou spektrometriou, ktorá preukázala, že 55‑kDa pás obsahoval fragmenty Igκ reťazca a Ig variabilnej oblasti ťažkého reťazca, podľa Národného centra pre Databáza biotechnologických informácií (NCBI) (obr. 3C‑E). Tieto údaje naznačujú, že bunky HK‑2 produkovali a vylučovali IgG proteín.

Transkripcia a V(D)J rekombinácia ťažkých a ľahkých reťazcov IgG v bunkách HK‑2. Transkripcia génu Ig a funkčná rekombinácia V(D)J je predpokladom expresie Ig. Na potvrdenie expresie IgG v HK‑2 bunkách sa hodnotili Ig, IgK a Igλ transkripty amplifikáciou konštantných a variabilných oblastí v HK‑2 bunkách (obr. 4A a B). Sekvenovanie konštantných produktov PCR vykazovalo vysokú homológiu s publikovanou sekvenciou v databáze NCBI. T-A klonovanie a Sangerove sekvenovanie ukázali, že Ig v HK-2 bunkách vykazoval konzervatívnu V(D)J rekombináciu s VH4-4/D2-8/JH5. Na rozdiel od toho bola v PBMC pozorovaná rôznorodosť V(D)J rekombinácie, ktorá eliminovala skreslenie priméru (tabuľka II). Podobne ako B bunky, IgG odvodený od HK-2 vykazoval typickú produktívnu V(D)J rekombináciu s V-D a D-J spojeniami (obr. 4C). Okrem toho boli somatické hypermutácie detegované v Ig odvodených od HK-2 (rozsah, 6,8-8,4 percenta) so 7 z 15 motívov hotspotov (RGYW/WRCY, W=A/T, R= A/G, Y=C/T) s mutáciami.

Okrem toho sa v bunkách HK‑2 detegovali transkripty AID (základný prvok pre somatickú hypermutáciu a rekombináciu prepínania tried v B bunkách) a RAG1 a RAG2 [nevyhnutné pre V(D)J rekombináciu] (obr. 4B), čo naznačuje, že Mechanizmus, ktorý je základom syntézy Ig v HK-2 bunkách, môže byť podobný ako v B bunkách.

TGF‑1 upreguluje expresiu IgG v bunkách HK‑2. Bunky HK‑2 boli stimulované rôznymi koncentráciami TGF‑1 počas 48 hodín. Imunofluorescenčné farbenie odhalilo, že cytoplazmatický IgG vykazoval zvýšené pozitívne farbenie v porovnaní s kontrolnou skupinou (obr. 5A). Western blotting potvrdil, že IgG bol významne upregulovaný TGF-1 (P<0.05; fig.="" 5b="" and="">

Účinky cistanche: prospieva obličkám

Diskusia

Táto štúdia preukázala, že PTEC exprimovali IgG s génovou transkripciou a funkčnou konzervatívnou V(D)J rekombináciou, ktorá bola podobná non-B-IgG. TGF‑1 upreguloval expresiu IgG v bunkách HK2.

Aby sa zistilo, či PTEC exprimovali IgG, IgG sa prvýkrát detegoval v cytoplazme, bunkovej membráne a lúmene PTEC v normálnej ľudskej obličkovej kôre imunohistochémiou; výsledky ukázali, že PTEC produkovali a vylučovali IgG. To je v kontraste s naším rutinným patologickým vyšetrením, kde sa v PTEC nezistil žiadny zjavný IgG. Mohlo by to byť spôsobené veľmi slabým farbením PTEC, ktoré bolo príliš nízke na to, aby sa dalo zistiť, najmä pri imunitne podmienených glomerulárnych ochoreniach, pri ktorých sú Ig silne pozitívne v glomeruloch a farbenie PTEC sa môže neúmyselne, ale umelo stratiť. IgG transcytóza z cirkulácie PTEC cez Fc receptor bola čiastočne vylúčená, pretože v bunkovej membráne a cytoplazme bolo pozorované jasné farbenie IgG pomocou RP215. Tieto zistenia naznačujú, že IgG odvodený od PTEC bol podobný iným ako B-IgG a môže mať jedinečné glykozylované epitopy, ktoré môžu byť špecificky rozpoznané RP215 namiesto komerčnej anti-IgG protilátky (15). Zistenie, že iba časť tubulárnych epitelových buniek exprimuje IgG, možno vysvetliť dynamickou expresiou v rôznych bunkových cykloch, ktorá bola podobná vzoru expresie IgA odvodeného z mezangiálnych buniek (18). Spoločné farbenie IgG s tubulárnymi markermi (ako je aquaporín 1 a aquaporín 3) by bolo užitočné pre ďalšie štúdie na zlepšenie zistení tejto štúdie.

Jednobunkové sekvenovanie RNA môže jasne zobraziť transkripciu špecifického génu v danej bunke. Transkripty Ig reťazca a V(D)J rekombinácie boli detegované v jednotlivých PTEC. Aj keď sa použilo iba päť samostatných PTEC, proces bol prísny, pretože obličková kôra bola odoberaná ďaleko od nádoru a každá jednotlivá bunka bola triedená prietokovou cytometriou s dvoma markerovými génmi špecifickými pre PTEC, opätovne potvrdenými pomocou tretieho špecifického markerového génu (LRP2). a kontaminácia B-buniek bola eliminovaná. Výsledky odhalili, že PTEC nevykazujú len transkripty génov IgG, ale aj klasickú V(D)J rekombináciu vo variabilnej oblasti ako B bunky, ako je produktívna V(D)J rekombinácia s V-D a D-J spojenia (obr. 4), čo naznačuje, že PTEC majú potenciál produkovať IgG. Okrem toho konzervatívnejšia V(D)J rekombinácia ilustrovala, že PTEC prezentujú IgG génové transkripty a V(D)J rekombináciu, ktoré sú podobné iným non-B bunkám.

HK‑2, zvečnená línia PTEC, sa ľahko pestuje vo veľkých množstvách. Táto štúdia potvrdila expresiu IgG proteínu v kultivovaných bunkách HK‑2; IgG sa detegoval v bunkách HK‑2 imunofluorescenciou aj westernovým prenosom. Ig4, podtrieda Ig, bola tiež detegovaná vo veľkosti pásu konzistentnej s predpovedanou molekulovou hmotnosťou. Hmotnostná spektrometria odhalila, že proteín purifikovaný z bunkového supernatantu pomocou proteínu G obsahoval fragmenty variabilnej oblasti ťažkého reťazca Ig a reťazca IgK, čo poskytuje dôkaz o sekrécii IgG prostredníctvom PTEC. IgG transkripcia v HK‑2 bunkách ďalej podporovala IgG expresiu v PTEC a konzervatívna V(D)J rekombinácia s IGHV4‑4/IGHD2‑8/IGHJ5 v HK‑2 bunkách ďalej podporovala prítomnosť IgG v HK‑2 bunkách podobne na iné non-B bunky.

Táto štúdia tiež skúmala základný mechanizmus produkcie IgG v PTEC skúmaním transkripcie RAG1, RAG2 a AID v bunkách HK-2. Zistilo sa, že RAG1, RAG2 a AID boli transkribované v bunkách HK-2. Okrem toho boli transkripty RAG1, RAG2 alebo AID predtým detegované v mnohých iných non-B bunkách, ako sú podocyty (19) a niekoľko rakovinových bunkových línií (23). Tieto výsledky naznačujú, že iné ako B bunky, vrátane PTEC, môžu mať podobné mechanizmy syntézy Ig ako B bunky. Či sú však AID a/alebo RAG1/2 nevyhnutné gény pre IgG odvodené od PTEC, si vyžaduje ďalšie skúmanie. Okrem toho sú folikulárne pomocné CD4 T bunky dôležité na reguláciu diferenciácie B-buniek zárodočného centra na plazmatické bunky a podporujú produkciu Ig (24). Naše nepublikované údaje odhalili, že non-B-Igs boli stále detegované u myší NOD-SCID s deficitom T a B buniek, čo naznačuje, že non-B-Ig neboli úplne závislé od pomocných T buniek. Či sú pomocné T bunky potrebné na to, aby PTEC exprimovali IgG, si vyžaduje ďalší výskum.

TGF‑1 má kľúčovú imunomodulačnú úlohu pri tvorbe Ig. Napríklad TGF‑1 indukoval prepínanie triedy IgA a sekréciu v stimulovaných B bunkách v myšacej slezine (25) a B bunkách ľudských mandlí (26). McIntyre et al (27) preukázali, že TGF‑1 selektívne stimuloval sekréciu IgG2b lipopolysacharidmi aktivovanými B bunkami s najväčšou pravdepodobnosťou indukciou zmeny triedy IgM na IgG2b. Duan et al (28) preukázali, že TGF‑1 zvyšuje expresiu IgA zvýšením regulácie transkripčného faktora Ets‑1 v epiteliálnych rakovinových bunkách. Táto štúdia preukázala, že TGF-1 upreguloval expresiu IgG v bunkách HK-2. Vzhľadom na to, že v bunkách HK‑2 bol detegovaný iba IgG, predpokladalo sa, že TGF‑1 indukuje expresiu IgG nezávisle od prepínania triedy Ig. Regulačný mechanizmus produkcie IgG prostredníctvom TGF‑1 si vyžaduje ďalšie skúmanie.

PTEC zohrávajú dôležitú úlohu pri tubulárnej intersticiálnej fibróze prostredníctvom EMT a TGF‑1 pôsobí ako hlavný profibrotický mediátor. V tejto štúdii pridanie TGF-1 ku kultivovaným bunkám HK-2 zvýšilo expresiu IgG, čo naznačuje, že IgG odvodený od HK-2 môže byť pozitívne spojený s EMT. Predchádzajúce štúdie uviedli, že rakovina-IgG bola spojená s metastázami a podporovala EMT znížením E-kadherínu pri slinnom adenoidnom cystickom karcinóme (29) a rakovine pľúc (30). Stojí za to preskúmať, či IgG odvodený od PTEC môže zohrávať úlohu pri renálnej tubulárnej EMT a intersticiálnej fibróze za chorobných stavov, ako je ischémia/reperfúzne poškodenie alebochronické ochorenie obličiek.

Na záver, podľa našich najlepších vedomostí, táto štúdia bola prvou, ktorá preukázala, že PTEC môžu exprimovať a vylučovať IgG a TGF-1 môže upregulovať expresiu IgG v bunkách HK-2. Potenciálna úloha IgG odvodených od PTEC pri tubulointersticiálnej fibróze si však vyžaduje ďalšie skúmanie.

Účinky cistanche: prospieva obličkám

Financovanie

Táto štúdia bola podporená grantmi od National Natural Science Foundation of China (grant č. 82070736, 91642109 a 81870488), Hainan Natural Science Foundation (grant č. 819QN355), Hainan Medical University Scientific Research Cultivation Foundation (grant č. HYPY201926) a kľúčové podporné projekty hlavného výskumného programu Národnej nadácie pre prírodné vedy (č. grantu 91642206).

Dostupnosť údajov a materiálov

Súbory údajov použité a/alebo analyzované počas súčasnej štúdie sú k dispozícii od príslušného autora na primeranú žiadosť.

Príspevky autorov

Ako príslušní autori, YW a XQ koncipovali a navrhli štúdiu. ZD sa podieľal na návrhu výskumu, robil histologické a jednobunkové experimenty, pripravoval vzorky pre hmotnostnú spektrometriu, analyzoval dáta a napísal rukopis. ZJ sa podieľal na dizajne výskumu, väčšine experimentov týkajúcich sa expresie IgG v bunkách HK‑2 a analýze relevantných údajov. YG, JM, HD a YL uskutočnili čiastočné experimenty s bunkovou líniou. ZC a YP vybrali vhodné prípady pre jednobunkové experimenty podľa klinických charakteristík. HY a ZS sa zúčastnili jednobunkových experimentov. SW sa podieľal na imunohistochemickom farbení, analyzoval údaje o farbení tkaniva a vypracoval a revidoval rukopis. YW, ZD a ZJ potvrdili pravosť všetkých nespracovaných údajov. Všetci autori prezreli rukopis a zrevidovali údaje. Všetci autori prečítali a schválili konečný rukopis.

Etický súhlas a súhlas s účasťou

Táto štúdia bola v súlade so zásadami Helsinskej deklarácie a bola schválená Lekárskym etickým výborom Tretej nemocnice Pekingskej univerzity (číslo schválenia S2020121) a vykonaná v súlade s protokolom. Všetci darcovia dobrovoľne darovali obličkové kôry a poskytli písomný informovaný súhlas pred darovaním obličkovej kôry do štúdie. Všetky metódy boli vykonané v súlade s príslušnými smernicami a nariadeniami. Tieto vzorky boli prísne anonymizované. Ľudské sérum a PBMC, použité ako pozitívne kontroly pri westernovom prenose alebo reverznej transkripcii-PCR v tejto štúdii, boli získané z krvi zdravého dobrovoľníka, ktorý poskytol písomný informovaný súhlas na odber vzoriek.

Účinky cistanche: prospieva obličkám

Referencie

1. Schlondorff DO: Prehľad faktorov prispievajúcich k patofyziológii progresívneho renálneho ochorenia. Kidney Int 74: 860-866, 2008.

2. Donadio ME, Loiacono E, Peruzzi L, Amore A, Camilla R, Čile F, Vergano L, Boido A, Corrieri M, Bianciotto M,et al: Toll-like receptory, imunoproteazóm a regulačné T bunky u detí s Henoch-Schonleinovou purpurou a primárnou IgA nefropatiou. Pediatr Nephrol 29: 1545-1551, 2014.

3. Breda PC, Wiech T, Meyer‑Schwesinger C, Grahammer F, Huber T, Panzer U, Tiegs G a Neumann K: Renálne proximálne tubulárne epitelové bunky vykonávajú imunomodulačnú funkciu riadením zápalových reakcií CD4 plus T buniek. Am J Physiol Renal Physiol 317: F77-F89, 2019.

4. Liu BC, Tang TT, Lv LL a Lan HY: Poškodenie obličkových tubulov: Hnacia sila smerom k chronickému ochoreniu obličiek. Kidney Int 93: 568-579, 2018.

5. Kobayashi N, Suzuki Y, Tsuge T, Okumura K, Ra C a Tomino Y: FcRn-sprostredkovaná transcytóza imunoglobulínu G v ľudských renálnych proximálnych tubulárnych epiteliálnych bunkách. Am J Physiol Renal Physiol 282: F358-F365, 2002.

6. Qiu X, Zhu X, Zhang L, Mao Y, Zhang J, Hao P, Li G, Lv P, Li Z, Sun X,et al: Ľudské epitelové rakoviny vylučujú imunoglobulín g s neidentifikovanou špecifickosťou na podporu rastu a prežitia nádorových buniek. Cancer Res 63: 6488-6495, 2003.

7. Zheng J, Huang J, Mao Y, Liu S, Sun X, Zhu X, Ma T, Zhang L, Ji J, Zhang Y,et al: Transkripty imunoglobulínového génu majú v ľudských epiteliálnych rakovinových bunkách odlišné charakteristiky rekombinácie VHDJH. J Biol Chem 284: 13610-13619, 2009.

8. Jiang D, Ge J, Liao Q, Ma J, Liu Y, Huang J, Wang C, Xu W, Zheng J, Shao W,et al: IgG a IgA s potenciálnou mikrobiálnou väzbovou aktivitou sú exprimované normálnymi epidermálnymi bunkami ľudskej kože. Int J Mol Sci 16: 2574-2590, 2015.

9. Zhu Z, Zhang M, Shao W, Wang P, Gong X, Ma J, Qiu X a Wang B: Imunoglobulín M, nová molekula buniek myokardu myší. Int J Biochem Cell Biol 88: 172-180, 2017.

10. Niu N, Zhang J, Sun Y, Wang S, Sun Y, Korteweg C, Gao W a Gu J: Expresia a distribúcia imunoglobulínu G a jeho receptorov v imunitne privilegovanom mieste: oko. Cell Mol Life Sci 68: 2481-2492, 2011.

11. Huang J, Sun X, Mao Y, Zhu X, Zhang P, Zhang L, Du J a Qiu XY: Expresia imunoglobulínového génu s klasickým V-(D)-J preskupením v myšacích mozgových neurónoch. Int J Biochem Cell Biol 40: 1604-1615, 2008.

12. Niu N, Zhang J, Guo Y, Zhao Y, Korteweg C a Gu J: Expresia a distribúcia imunoglobulínu G a jeho receptorov v ľudskom nervovom systéme. Int J Biochem Cell Biol 43: 556-563, 2011.

13. Li J, Korteweg C, Qiu Y, Luo J, Chen Z, Huang G, Li W a Gu J: Dva vzory ultraštrukturálnej distribúcie imunoglobulínu G v ľudskej placente a funkčné dôsledky. Biol Reprod 91: 128, 2014.

14. Huang J, Zhang L, Ma T, Zhang P a Qiu X: Expresia imunoglobulínového génu s klasickým V-(D)-J preskupením v myších semenníkoch a nadsemenníkoch. J Histochem Cytochem 57: 339-349, 2009.

15. Tang J, Zhang J, Liu Y, Liao Q, Huang J, Geng Z, Xu W, Sheng Z, Lee G, Zhang Y,et al: Bunky skvamocelulárneho karcinómu pľúc exprimujú nekanonicky glykozylovaný IgG, ktorý aktivuje signalizáciu integrín-FAK. Cancer Lett 430: 148-159, 2018.

16. Cui M, You L, Zheng B, Huang X, Liu QF, Huang J, Pan B, Qiu X, Liao Q a Zhao Y: Vysoká expresia glykozylovaného imunoglobulínu G odvodeného od rakoviny predpovedá zlú prognózu duktálneho adenokarcinómu pankreasu. J Cancer 11: 2213-2221, 2020

17. Cui M, Hu Y, Zheng B, Zhang S, Zhang X, Wang M, Qiu XY, Liao Q a Zhao YP: Imunoglobulín G odvodený od rakoviny: Nový marker pre diferenciálnu diagnostiku a predikciu relapsu pri karcinóme prištítnych teliesok. Clin Endocrinol (Oxf) 92: 461-467, 2020.

18. Deng H, Ma J, Jing Z, Deng Z, Liang Y, AL, Liu Y, Qiu X a Wang Y: Expresia imunoglobulínu A v ľudských mezangiálnych bunkách a jej účinky na bunkovú apoptózu a adhéziu. Mol Med Rep 17: 5272-5282, 2018.

19. Jing Z, Deng H, Ma J, Guo Y, Liang Y, Wu R, AL, Geng Z, Qiu X a Wang Y: Expresia imunoglobulínu G v ľudských podocytoch a jeho úloha v životaschopnosti a adhézii buniek. Int J Mol Med 41: 3296-3306, 2018.

20. Van der Hauwaert C, Savary G, Gnemmi V, Glowacki F, Pottier N, Bouillez A, Maboudou P, Zini L, Leroy X, Cauffiez C,et al: Izolácia a charakterizácia primárneho modelu proximálnych tubulárnych epitelových buniek z ľudskej obličky dvojitým značením CD10/CD13. PLoS One 8: e66750, 2013.