Expresia neuronálnej syntázy oxidu dusnatého a renínu v dysplastických obličkách mladých psov

ABSTRAKT.

Renin aneuronálna syntáza oxidu dusnatéhov obličkách kontrolovaťrenín-angiotenzínatubuloglomerulárne spätnoväzbové systémy. Táto štúdia skúmala expresiu renínu a neurónovsyntáza oxidu dusnatéhovdysplastické obličkytroch mladých psov. Renínimunoreaktivita, ktorá sa vyskytuje v juxtaglomerulárnych a tubulárnych bunkách dysplastických obličiek, sa nelíšila od renínimunoreaktivity v normálnych obličkách mladých psov. Bunky s hustotou makuly v normálnych obličkách vykazovali neuronálnu imunoreaktivitu syntázy oxidu dusnatého, ale bunky v dysplastických obličkách nevykazovali žiadne zjavné signály. Toto pozorovanie môže korelovať s patologickými mechanizmami zlyhania obličiek u mladých psov.

KĽÚČOVÉ SLOVÁ: chronické ochorenie obličiek, dysplastická oblička, imunohistochémia, neuronálna syntáza oxidu dusnatého, renín

Zlyhanie obličiekobčas sa vyskytuje u mladých psov. V takýchto prípadoch histologické vyšetrenie často preukazuje dysplastické lézie obličiek. Avšak patofyziologické mechanizmy, ktoré sa vyskytujú v dysplastických obličkách psov, zostávajú nejasné. Nedávno sme pomocou imunohistochemickej analýzy preukázali zoslabenie cyklooxygenázy (COX)-2 pri chronických ochoreniach obličiek u mladých psov s dysplastickými obličkami [19].

Podpora doplnkov CistancheDoplnok funkcie obličiek

COX-2 je indukovateľný zápalový enzým, ktorý je nevyhnutný pre normálny vývoj obličiek vo fetálnom a neonatálnom štádiu [12, 15]. Po narodení sa COX-2 konštitutívne exprimuje v obličkách a koncentruje sa v obmedzenej oblasti macula densa (MD) hrubých vzostupných končatín [1, 4, 22]. MD je špecializovaná oblasť susediaca s vaskulárnym pólom glomerulu. Riadi sekréciu renínu a systém tubuloglomerulárnej spätnej väzby (TGF). COX-2 exprimovaný v MD bunkách reguluje tieto mechanizmy [6, 8]. Okrem COX-2 je hlavným regulátorom systému TGF neurónová syntáza oxidu dusnatého (nNOS), ktorá je tiež exprimovaná v MD bunkách [3, 18]. Je známe, že tieto dve molekuly, ktoré sú koexprimované pri MD, navzájom interagujú [2, 5, 9]. V tejto štúdii sme skúmali expresiu renínu a nNOS v dysplastických obličkách pomocou imunohistochémie, aby sme určili, či útlm COX-2 v dysplastických obličkách vyvoláva u mladých psov narušenie systému renín-angiotenzín a TGF

Parafínové bloky dysplastických obličiek mladých psov (n=3) fixované formalínom, normálnych obličiek mladých psov (n=3) a normálnych obličiek dospelých psov (n=4) boli rovnaké ako tie, ktoré boli použité v našej predchádzajúcej štúdii, v ktorej už bola klinická anamnéza a príprava tkaniva popísaná [19]. Štúdiu schválil Výbor pre experimentovanie na zvieratách Univerzity Kagoshima v Japonsku (VM15020). Rezy boli pripravené s hrúbkou 3- μm a imunohistochemická analýza na renín a nNOS sa uskutočnila podľa nasledujúcich protokolov: (1) deparafinizácia; (2) získanie antigénu mikrovlnným zahrievaním v 10 mM citrátovom pufri (pH 6,0) pre nNOS; (3) inkubácia s 3 % H202 počas 30 minút; (4) blokovanie 3% hovädzím sérovým albumínom (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) pre renín alebo 0,25% kazeínom (Sigma-Aldrich) pre nNOS, zriedené vo fosfátom pufrovanom fyziologickom roztoku, počas 30 minút; (5) inkubácia cez noc pri 4 stupňoch s 1:3,000 riedením králičieho anti-rekombinantného renínového polyklonálneho antiséra (dodáva Dr. Murakami, University of Tsukuba, Japonsko) alebo 1:3,{{32} }} riedenie králičieho anti-nNOS polyklonálneho antiséra (Cayman Chemical, Ann Arbor, MI, USA), v blokovacom roztoku; (6) inkubácia počas 30 minút pri izbovej teplote s univerzálnou protilátkou konjugovanou s peroxidázou a polymérom (anti-myší imunoglobulín (Ig) G a anti-králičí IgG; jednoduché farbenie MAX-PO [MULTI]; Nichirei Biosciences, Tokio, Japonsko) ; a (7) detekcia imunosignálu pomocou 3,3'-diaminobenzidínového systému (tableta s pufrom 3,3'-diaminobenzidínu; Merck, Darmstadt, Nemecko). Pre negatívne kontrolné rezy sa namiesto primárnej protilátky použil normálny králičí IgG (Lab Vision, Fremont, CA, USA).

Obr. 1. Imunohistochémia pre renín v dysplastickej psej obličke. Odpoveď: Renín-pozitívne signály boli pozorované v juxtaglomerulárnych bunkách blízko cievnych pólov a niektorých glomerulárnych bunkách (šípky). Stĺpec: 50 um. B: Iná oblasť rezu je znázornená na paneli A. Tubuly v neidentifikovanom segmente nefrónu vykazujú imunoreaktivitu renínu. Stĺpec: 50 um.

Randomizovaná morfometrická analýza renínovej imunoreaktivity sa uskutočnila podľa skôr opísanej metódy [20]. Stručne, renínový index bol definovaný ako pomer celkového počtu renín-pozitívnych arteriol k celkovému počtu glomerulov a vyjadrený na 100 glomerulov. Rozdiely medzi skupinami boli analyzované použitím Bonferroniho metódy viacnásobného porovnávania s SPSS verzie 24 (IBM SPSS Statistics, Armonk, NY, USA).

Histopatologická diagnóza bola vykonaná podľa mikroskopických kritérií renálnej dysplázie psov podľa Picuta a Lewisa [14]. Histologické rezy všetkých troch prípadov predstavovali asynchrónnu diferenciáciu, čo naznačuje prítomnosť lézií s fetálnymi/nezrelými glomerulami. V zrelých obličkových tkanivách boli pozorované sekundárne zmeny rôznej závažnosti, ako je poškodenie tubulov, intersticiálna fibróza a sklerotické glomeruly.

V dysplastických obličkách boli signály renínovej imunoreaktivity pozorované v juxtaglomerulárnych bunkách (JGC) (obr. 1A) a tubulárne bunky boli lokalizované v distálnych nefrónoch (obr. 1B). V niektorých glomeruloch niekoľko buniek vykazovalo renín-pozitívne signály blízko cievnych pólov (obr. 1A). V mladých kontrolných obličkách sa renínové signály detegovali aj v JGC aj v distálnych tubuloch, vrátane MD buniek. V kontrolných obličkách dospelých boli renín-pozitívne signály obmedzené na JGC. Štatisticky počet renín-pozitívnych oblastí v dysplastických obličkách nevykazoval žiadne významné rozdiely od tých v mladých a dospelých obličkách.

Je známe, že stimulácia produkcie renínu hrá úlohu v signalizácii COX{0}} a predchádzajúce štúdie preukázali, že aktivita a koncentrácia renínu v plazme sa znížili po podaní inhibítora COX{1}} alebo pri vyradení COX -2 gén [10, 11]. Keďže dysplastické obličky skúmané v tejto štúdii nevykazovali žiadnu expresiu renálnej COX-2 [19], redukcia imunosignálov renínu v JGC sa pôvodne predpokladala ako možná fyziologická abnormalita v dysplastických obličkách. Súčasná imunohistochemická analýza však nemohla potvrdiť túto hypotézu a v JGC nebola navrhnutá žiadna zjavná redukcia renínu. Hoci fyziologická úloha tubulárneho renínu nebola predtým objasnená, renálna manipulácia so sodíkom môže byť možnou úlohou tubulárneho renínu, pretože zvýšenie expresie renínu bolo indukované v distálnom nefrone po kŕmení potkanov diétou s nízkym obsahom soli. [16] a dysplastické obličky psov skúmaných v tejto štúdii si mohli zachovať túto tubulárnu funkciu.

COX-2 je tiež dôležitá pri regulácii systému TGF, ktorý je dôležitý na udržanie rýchlosti glomerulárnej filtrácie. Štúdia na potkanoch s použitím mikropunkčnej metódy preukázala potlačenie odpovede TGF po liečbe COX-2 inhibítorom [2]. Odpoveď TGF v dysplastických obličkách môže byť oslabená v dôsledku nedostatočnej renálnej expresie COX-2. Predtým však neboli hlásené žiadne relevantné zistenia. V obličkách je nNOS exprimovaný v MD bunkách a pomáha regulovať systém TGF [18].

V súčasnej analýze nNOS neboli zistené žiadne zjavné signály v oblastiach MD vo všetkých prípadoch (obr. 2). Toto zníženie nNOS sa považovalo skôr za etiopatogénnu udalosť v dysplastických obličkách ako za získanú po zlyhaní obličiek. Naša predchádzajúca štúdia s použitím potkanov OLETF (Otsuka Long-Evans Tokushima Fatty) ako modelu diabetu 2. typu preukázala, že nNOS bol nadmerne exprimovaný v MD a jeho okolí tubulárnych buniek v neskoršom štádiu diabetickej nefropatie [21]. Pri regulácii systému TGF je funkcia nNOS podobná a interaguje s funkciou COX-2. Niektoré štúdie naznačujú, že nNOS je umiestnený pred signálnou dráhou a stimuluje expresiu COX-2 [5, 9]. Na druhej strane, iné štúdie naznačujú opak, že COX-2 je umiestnená pred NOS [2, 13]. Bez ohľadu na rozdiel v signálnej dráhe môže nedostatok nNOS-imunosignálov v MD bunkách spustiť zníženie expresie renálnej COX-2 v dysplastických obličkách.