Expresia renálneho vitamínu D a génov súvisiacich s fosfatonínom u ovčieho modelu osteoporózy
Jul 29, 2022
Prosím kontaktujteoscar.xiao@wecistanche.comPre viac informácií
Abstrakt:Osteoporóza je významným problémom verejného zdravia na celom svete, pričom postmenopauzálna osteoporóza spôsobená nedostatkom estrogénu má za následok približne 3/4 prípadov. V tejto štúdii sa ovariektómii 18 starým ovičkám plemena Merino a 10 kontrolám. Tri z ovariektomizovaných oviec boli liečené týždenne 400 mg metylprednizolónu počas 5 mesiacov a tri boli liečené týždenne počas 2 mesiacov, po ktorých nasledovalo 3-mesačné obdobie zotavenia. Po 2 mesiacoch bolo usmrtených päť kontrolných zvierat a šesť zvierat po odstránení vaječníkov. Po 5 mesiacoch boli všetky zostávajúce ovce utratené. Vzorky obličiek sa odobrali postmortem na qPCR analýzu NPT1, PTH1R, NPT2a, NPT2c, Klotho, FGFR1llc, VDR, CYP24A1, CYP27B1, TRPV5, TRPV6, CalD9k, CalD28k, PMCA a NCX1. Oviektomizované ovce mali významne vyššiu expresiu VDR v porovnaní s inými skupinami. Ovarektomizované ovce liečené glukokortikoidmi počas 2 mesiacov s následnou eutanáziou po 5 mesiacoch vykazovali významné rozdiely v expresii génov TRPV5, CYP24A1 a klotho v porovnaní s inými skupinami. Rozdiely v expresii klotho boli najvýraznejšie po úprave pre opakované merania (p=0.1). Klotho je známy ako „anti-aging“ hormón a podieľa sa na metabolizme vápnika a fosforu. Klotho sa môže podieľať na obnove minerálnej hustoty kostí u oviec po ovariektómii liečených glukokortikoidmi počas 2 mesiacov, po ktorých nasleduje eutanázia po 5 mesiacoch. Odporúča sa ďalší výskum o úlohe klotho.
Ak chcete vedieť viac, kliknite sem
Kľúčové slová:osteoporóza; ovce; vitamín D; fosfátovanie; qPCR; metabolizmus vápnika; metabolizmus fosforu; klotho
1. Úvod
Osteoporóza je hlavným problémom verejného zdravia čoraz starnúcej svetovej populácie, ktorá stála Spojené štáty americké v roku 205 takmer 17 miliárd USD a predpokladá sa, že v roku 2025 vzrastie na 25 miliárd USD [1,2]. Približne 70-75 percent osteoporózy je spôsobených postmenopauzálnou osteoporózou u žien [1], primárnou osteoporózou, pri ktorej nedostatok estrogénu vedie k zníženej tvorbe kostí a zvýšeniu kostnej resorpcie, čo vedie k zníženiu kostnej hmoty a krehkosti kostí [3]. . Osteoporóza sa môže vyskytnúť aj sekundárne v dôsledku špecifických príčin, ako je liečba glukokortikoidmi. Ovca je dobre zavedený veľký zvierací model pre rôzne ochorenia ľudského skeletu vrátane osteoporózy[4]. Jednou z výhod veľkého zvieracieho modelu, akým je napríklad ovca, je možnosť testovať ortopedické implantáty, chirurgické techniky a biomateriály [4]Ovca je navyše relatívne lacná, ľahko sa s ňou manipuluje a poskytuje dostatok materiálu na testovanie. [4,5].
Najbežnejšími modelmi osteoporózy u oviec sú 12-mesačné pooperačné ovariektomizované ovce a 6-mesačné ovariektomizované ovce na diéte s nedostatkom vápnika a vitamínu D s glukokortikoidmi[4]. Použitím kombinácie známych faktorov vyvolávajúcich osteoporózu vrátane ovariektómie, liečby glukokortikoidmi a diéty s nízkym obsahom vápnika sme dokázali vytvoriť model osteoporózy u oviec už za 5 mesiacov [6,7], čím sme znížili ustajnenie, pôrod, a náklady na krmivo spojené s vývojom modelu. V tomto modeli sa zistilo, že ovariektómia zvyšuje sérové koncentrácie C-terminálnych telopeptidov kolagénu typu I (CTX-I, marker kostnej resorpcie) a osteokalcínu (marker kostného obratu) v porovnaní s kontrolnou ovcou. Ovce, ktoré dostávali liečbu glukokortikoidmi počas 2 mesiacov, mali vyššie koncentrácie CTX-I v sére a nižšie koncentrácie osteokalcínu v sére. Okrem toho hustota kostí stehennej a driekovej chrbtice a celková a trabekulárna volumetrická kostná minerálna hustota proximálnej tibie boli nižšie v experimentálne liečených skupinách v porovnaní s kontrolnými skupinami, najmä u oviec liečených ovariektomizovanými glukokortikoidmi [6]. Zistilo sa, že metabolizmus aminokyselín a lipidov bol zmenený aj u oviec po ovariektómii a liečených glukokortikoidmi [7].cistanche wirkungPodobné zmeny sa zistili aj v iných modeloch osteoporózy oviec [8].
Cistanche môže proti starnutiu
Gény reagujúce na vitamín D a fosfátovací systém neboli predtým skúmané na modeloch oviec s odstránením vaječníkov. Vitamín D, z ktorého 1,25-dihydroxyvitamín D je aktívna forma, vedie v konečnom dôsledku k zvýšeným plazmatickým koncentráciám ionizovaného vápnika a fosforu väzbou na heterodimér receptora vitamínu D (VDR)-retinoid X receptora a mení expresiu mnohých vitamínov Gény reagujúce na D, ako sú proteíny viažuce vápnik (kalbindín D9 a 28k (CalD9k, CalD28k)) a vápnikové kanály (člen 5 a 6 podrodiny katiónových kanálov prechodného receptorového potenciálu (TRPV5, TRPV6), kalciová ATPáza plazmatickej membrány (PMCA) , sodíkovo-vápenatý výmenník 1(NCX1)[9]. Produkcia 1,25-dihydroxyvitamínu D je prísne regulovaný krok, pričom renálna lo hydroxyláza (CYP27B1) katalyzuje premenu 25-hydroxyvitamínu D na 1,25-dihydroxyvitamín D a enzým 24-hydroxyláza (CYP24A1) štiepi 25-hydroxyvitamín D aj 1,25-dihydroxy vitamín D na neaktívne vedľajšie produkty.cistanche UKFosfátovací systém tiež riadi koncentrácie fosforu a vápnika v plazme[10]. Základným prvkom v tomto systéme je fibroblastový rastový faktor 23, ktorý je produkovaný osteocytmi v kostiach a primárne riadi koncentrácie fosforu v plazme väzbou na kofaktor klotho, aby sa znížila expresia kotransportérov fosforečnanu sodného (NPT1, NPT2a, NPT2c) [11]. V dôsledku vzájomne súvisiacich účinkov parathormónu a 1,{11}}dihydroxy vitamínu D bolo stanovenie účinkov FGF23 na metabolizmus vápnika náročné, existujú však dôkazy, že môže regulovať absorpciu vápnika v čreve a obličky. reabsorpcia vápnika[12,13].
Glukokortikoidy majú početné účinky na metabolizmus vápnika a fosforu, vrátane inhibície črevnej absorpcie vápnika, zníženej renálnej tubulárnej reabsorpcie vápnika a zníženej renálnej reabsorpcie fosforu [14-16]. Okrem toho malý výskum skúmal účinok nedostatku estrogénu na gény reagujúce na vitamín D a fosfátovací systém [17,18].
Tento model osteoporózy oviec s diétou s nízkym obsahom vápnika po ovariektómii a glukokortikoidmi liečenej ovce poskytol príležitosť poskytnúť predbežné informácie o účinkoch týchto liečení na expresiu génov fosfátovania a génov reagujúcich na vitamín D v obličkách oviec. Ciele tejto štúdie boli dvojaké: (1) určiť, či ovariektómia alebo ovariektómia a liečba glukokortikoidmi zmenila expresiu vitamínu D a génov súvisiacich s fosfátovaním v obličkách; (2) určiť vzťahy medzi obličkovým vitamínom D a génmi súvisiacimi s fosfátovaním, sérový vitamín D a markery kostného obratu v sére (CTX-I a osteokalcín).
2. Materiály a metódy
Podrobné metódy vývoja modelu osteoporózy oviec po ovariektómii a liečení glukokortikoidmi už boli publikované [6]. Stručne povedané, staré ovce plemena Merino (7-9 rokov, n=28) boli náhodne rozdelené do skupín: kontrola (n=10) ovariektomizované (OVX) (n=12), ovariektomizované a liečba glukokortikoidmi (40 mg metylprednizolónu subkutánnou injekciou) mesačne počas 2 mesiacov, po ktorých nasledovala žiadna liečba počas 3 mesiacov (n=3) a liečba glukokortikoidmi (400 mg metylprednizolónu) mesačne počas 5 mesiacov (n=3) .citrusové bioflavonoidyOvce boli ustajnené v maštali a kŕmené buď kontrolnou (115 g/kg vápnika; 2,2 g/ovca za deň) alebo nízkovápenatou (5 g/kg vápnika; 1 g/ovca za deň) ovčím granulovaným koncentrovaným krmivom [19]. Požiadavky na udržiavanie negravidnej ovce sú 1,2 g/ovca za deň[19].
Vzorky krvi sa odoberali jugulárnou venepunkciou 2 mesiace a 5 mesiacov po operácii. Osteokalcín sa meral pomocou súpravy na imunoanalýzu Micro Vue Osteocalcin a CTX-I pomocou súpravy IDS Serum CrossLaps ELISA, ako už bolo uvedené [6]Koncentrácie celkového vápnika a fosforu v sére sa merali pomocou spektrofotometrie na analyzátore klinickej chémie AU680 (Beckman Coulter, Brea , CA, USA). Koncentrácia 25-hydroxyvitamínu D v sére bola meraná pomocou izotopového riediaceho kvapalinového chromatogramu; rapy hmotnostnej spektrometrie v Endolab, Canterbury Health Laboratories, Christchurch, Nový Zéland.
V mesiacoch bolo 5 oviec z kontrolnej skupiny a 6 oviec zo skupiny OVX utratených a pitvaných. Po 5 mesiacoch boli utratené aj zvyšné ovce (kontrolná skupina n =5, OVX skupina n=6, OVX plus 2 m glukokortikoidy n=3 a OVX plus 5 m glukokortikoidy n=5 ) a pitvané. Vzorky obličiek sa odobrali do 30 minút po smrti a rozdelili sa na dve, pričom jedna vzorka sa umiestnila do 10-percentného neutrálneho pufrovaného formalínu a spracovala sa na histológiu a druhá sa rýchlo zmrazila v tekutom dusíku a skladovala sa pri -80 stupni až do spracovania hematoxylínu a eozínom zafarbené rezy obličiek boli vyšetrené primárnym autorom a potvrdili absenciu významných lézií.
Všetky experimentálne postupy boli schválené výborom pre etiku zvierat Massey University (číslo schválenia 14/103) a boli vykonané podľa Kódexu etického správania pri používaní živých zvierat na výskum na Massey University, Palmerston North, Nový Zéland.
Extrakcia RNA a qPCR sa uskutočnili tak, ako už bolo opísané [20,21]. Stručne, Tri činidlo (Gigma-Aldrich Inc, Merck KGaA, Darmstadt, Nemecko) sa použilo na extrakciu RNA podľa pokynov výrobcu. Genómová DNA bola odstránená pomocou Ambion Turbo DNA free (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA) podľa pokynov výrobcu. Koncentrácia RNA bola stanovená pomocou fluorometra Qubit 2.{36}} a súpravy Qubit RNA širokorozsahového testu (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA) a kvalita RNA bola hodnotená stanovením pomeru 260/280 a spustením na agarózovom géli. Na syntézu cDNA sa použila súprava na syntézu cDNA prvého vlákna Transcriptor (Roche). Každých 20 μl reakčnej zmesi obsahovalo 600 ng RNA, 2,5 μM oligo（dT）, 8 mM RT reakčného pufra, 1 mM dNTP, 10 U reverznej transkriptázy, 20 U inhibítora RNázy a vody bez RNázy. Reakcia sa uskutočňovala pri 55 stupňoch počas 30 minút, 85 stupňoch počas 5 minút a potom sa ochladila na 4 stupne s použitím tepelného cyklovača Applied Biosystems Veriti (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA). qPCR v reálnom čase sa uskutočňovalo pomocou stroja StepOne Plus real-time PCR (Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific Inc, Waltham, MA, USA). Každá PCR zmes obsahovala 5 ul Power SYBR Green PCR master mix (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA), dopredné a reverzné priméry v koncentráciách uvedených v tabuľke S1, 10 ng cDNA a potom doplnené na 10 ul s RNázou, vodou bez DNázy. Protokol PCR pozostával z 95 stupňov počas 20 s, 40 cyklov pri 95 stupňoch a 60 stupňov a nakoniec krivky topenia v rozsahu od 60 stupňov do 95 stupňov s rýchlosťou ohrevu 0,3 stupňa /15 s. Voda a reakčná zmes bez reverznej transkriptázy boli zahrnuté ako negatívne kontroly v každom cykle PCR a všetky vzorky boli analyzované duplicitne. Hodnotili sa tieto gény: NPT1, PTH1R, NPT2a, NPT2c, Klotho, FGFR1IIC, VDR, CYP24A1, CYP27B1, TRPV5, TRPV6, CalD9k, CalD28k, PMCA a NCX1. V minulosti sa zistilo, že PKG1 a SDHA sú stabilne exprimované v obličkách oviec [20] a vzorky sa normalizovali vzhľadom na expresiu týchto génov a génovú účinnosť pomocou 2-metódy AACt [22].
Štatistická analýza bola vykonaná pomocou R Studio 1.3.1093[23] s verziou R
4.0.3 a tidyverse, nlme 3.1-150 a Gary
2.1.2 balíky. Lineárne modely boli aplikované na log10 transformované údaje o zložení génu. V prvom modeli bola génová expresia výslednou premennou, zatiaľ čo skupina (kontrola alebo OVX, ale s výnimkou oviec liečených glukokortikoidmi) a čas (eutanázia vo vzdialenosti 2 m alebo 5 m) boli závislé premenné, vrátane interakčného termínu (skupina: čas). V druhom modeli bola génová expresia výstupnou premennou, zatiaľ čo skupina (kontrola, OVX, OVX s liečbou glukokortikoidmi počas 2 m a OVX s liečbou glukokortikoidmi počas 5 m) bola závislou premennou.výhody cynomoriumKeďže sa testovali viaceré výsledné premenné (gény) na rozdiely medzi skupinami, hodnoty p boli upravené pre viacnásobné testovanie pomocou postupného Holmovho postupu [24]. Koncentrácie vápnika, fosforu a 25-hydroxyvitamínu D v sére boli testované v modeloch génovej expresie, ale neboli významné a vzhľadom na nedostatok významných rozdielov medzi skupinami boli odstránené. Okrem toho sa na posúdenie, či sa údaje o expresii log10 transformovaného génového násobku líšili podľa skupiny, času eutanázie alebo koncentrácie 25-hydroxyvitamínu D v sére, použila analýza hlavných zložiek. Spearmanova párová korelácia a rozptylové grafy sa použili na štúdium korelácie medzi log10 transformovanými údajmi o násobku expresie génu a sérovými analytmi.
3. Výsledky
3.1. Vplyv ovariektómie, čas od ovariektómie a liečba glukokortikoidmi na sérové koncentrácie vápnika, fosforu a 25-hydroxyvitamínu D
Úplné výsledky koncentrácií vápnika, fosforu a 25-hydroxyvitamínu D v sére v každej skupine sú uvedené na obrázku 1." Medzi skupina s ovariektómiou a diétou s nízkym obsahom vápnika a skupina s adekvátnou diétou vápnika bez ovariektómie a čas od ovariektómie 2 mesiace a 5 mesiacov. Tieto výsledky naznačujú, že ovariektómia kombinovaná s diétou s nízkym obsahom vápnika nemala žiadny vplyv na koncentrácie vápnika v sére. a liečených glukokortikoidmi počas mesiacov, po ktorých nasledovala eutanázia po 5. mesiaci, mali významne nižšie koncentrácie vápnika v sére (p =0.0462, adj R20.13) v porovnaní s 5 m ovariektomizovaných na diéte s nízkym obsahom vápnika a 5 m ovariektomizovaných diéta s nízkym obsahom vápnika a ovce liečené glukokortikoidmi. Skúmanie údajov však naznačuje, že to môže byť spôsobené jedným zvieraťom, ktoré bolo hypokalcemické (1,52 mmol/l, referenčný rozsah 2.0-2 0,7 mmol/l); odstránenie z toto zviera odstránilo akýkoľvek význam.púštny hyacintVšetky ostatné ovce mali koncentrácie vápnika v sére v referenčnom rozsahu. Nepozorovali sa žiadne rozdiely v koncentráciách fosforu alebo 25-hydroxyvitamínu D v sére u 5 m ovariektomizovaných oviec a oviec liečených glukokortikoidmi.
3.2. Vplyv ovariektómie a čas od ovariektómie na vitamín D a expresiu génu súvisiaceho s fosfatonínom v obličkách
Génová expresia vitamínu D a génov súvisiacich s fosfátovaním nebola spojená s ovariektómiou alebo časom od ovariektómie (obrázok 2). Výnimkou bol receptor vitamínu D (VDR), pričom skupina OVX mala významne vyššiu expresiu VDR (p=0.05, adj R2 0.16); tento význam však po úprave na opakované opatrenia zmizol.
3.3. Účinok ovariektómie a liečby glukokortikoidmi na expresiu vitamínu D a génu súvisiaceho s fosfatonínom v OBLIČKE 5 mesiacov po operácii
Úplné výsledky sú uvedené na obrázku 3. Expresia PTH1R bola významne vyššia u OVX oviec liečených glukokortikoidmi počas 5 mesiacov v porovnaní s ostatnými skupinami (p=0.04, adj R40.18), zatiaľ čo TRPV5 (p{ Expresia {8}}.01, adj R20.31) a CYP24A1(p=0.005, adj R40.40) bola významne vyššia u OVX oviec liečených glukokortikoidmi počas 2 mesiacov v porovnaní s ostatnými skupinami.
Expresia klotho bola signifikantne rozdielna medzi všetkými skupinami (p =0.01, adj R20.48), s najnižšou expresiou u kontrolných oviec. Ovce OVX liečené glukokortikoidmi počas 2 mesiacov mali najvyššiu expresiu (p =0,002), nasledovali ovce OVX (p=0,008) a potom ovce OVX liečené glukokortikoidmi počas 5 mesiacov (p{ {10}}.03). Po úprave na opakované merania sa však génová expresia medzi týmito skupinami významne nelíšila, pričom klotho vykazovalo najväčší rozdiel u oviec OVX liečených glukokortikoidmi počas 5 mesiacov (p=0.1).
Podobne bola expresia VDR medzi všetkými skupinami významne odlišná (p=0.03, adj R20.38). Najväčšia expresia VDR bola u oviec OVX liečených glukokortikoidmi počas mesiacov (p=0.009), nasledovali ovce OVX (p=0.01), potom ovce OVX liečené glukokortikoidmi počas 5 mesiacov (p=0.05) a najnižšia expresia bola prítomná u kontrolných oviec.
3.4. PCA celkovej génovej expresie medzi skupinami
PCA analýza OVX, kontroly a eutanázie po 2 a 5 mesiacoch nedokázala oddeliť rôzne skupiny (obrázok S1). PCL a PC2 vysvetlili 69,6 percent variácií. Podobne analýza PCA skupín usmrtených po 5 mesiacoch tiež nedokázala oddeliť rôzne skupiny. PCL a PC2 vysvetlili 53,2 percenta variácií (obrázok S2). Analýza PCA ukázala, že celkovú génovú expresiu nemožno vysvetliť koncentráciami vápnika a fosforu v sére 25-hydroxyvitamínu D (obrázok S3).
3.5. Párová korelácia medzi všetkými analytmi a génovou expresiou
Bez ohľadu na stav ovariektómie, obsah vápnika v strave, čas od ovariektómie (2 m alebo 5 m) alebo stav liečby glukokortikoidmi, expresia génu NPT1 významne a pozitívne korelovala (p<001) with="" pth1r,="" npt2c,="" klotho,="" cyp24a1,="" trpv5,="" cald9k,="" and="" cald28k="" gene="" expression.="" pth1r="" was="" significantly="" positively="" correlated=""><001) with="" npt2c,="" klotho,="" cyp24a1,="" cyp27b1,="" trpv5,="" and="" cald28k.="" npt2a="" was="" significantly="" positively="" correlated=""><0.001) with="" fgfr1wic.="" klotho="" was="" significantly="" positively="" correlated=""><0.001) with="" cyp24a1,="" cyp27b1,="" trpv5,="" and="" cald28k.="" cyp24a1="" was="" significantly="" positively="" correlated=""><0.001) with="" trpv5="" and="" cald28k.="" trpv6="" was="" significantly="" positively="" correlated=""><0.001) with="" cal9dk="" and="" pmca,="" while="" cal9dk="" was="" significantly="" positively="" correlated=""><0.001) with="" cald28k="" and="" pmca.="" none="" of="" the="" serum="" analytes="" measured="" (osteocalcin,="" ctx,="" 25ohd,="" ca,="" and="" p)="" were="" correlated="" with="" the="" expression="" of="" any="" genes.="" the="" full="" pairwise="" correlations="" are="" shown="" in="" figure="">
4. Diskusia
Výsledky tejto štúdie naznačujú, že liečba ovariektomizovaných oviec glukokortikoidmi mala najväčší vplyv na génovú expresiu, zatiaľ čo samotná ovariektómia a čas od ovariektómie (2 a 5 mesiacov) mali malý vplyv na génovú expresiu. V univariačnej analýze boli pozorované významné rozdiely v expresii génov TRPV5, CYP24A1 a klotho u oviec po ovariektómii liečených glukokortikoidmi počas 2 mesiacov, po ktorých nasledovala eutanázia po 5 mesiacoch, a v PTH1R u oviec po ovariektómii liečených glukokortikoidmi počas 5 mesiacov. Rozdiely boli najvýraznejšie v expresii klotho po úprave na opakované merania.
Kvantitatívna periférna počítačová tomografia proximálnej holennej kosti týchto oviec ukázala, že ovariektómia znížila celkovú objemovú minerálnu hustotu kostí (vBMD) o 8 percent, ovariektómia s liečbou glukokortikoidmi na 5 mesiacov o 27 percent a ovariektómia s glukokortikoidmi na 2 mesiace a eutanázia o 13 percent [6]. Je zaujímavé, že trabekulárna BMD, trabekulárna plocha a minerálny obsah trabekulárnej kosti boli podobné alebo väčšie ako u kontrol u oviec po ovariektómii liečených glukokortikoidmi počas 2 mesiacov a usmrtených po 5 mesiacoch, čo svedčí o obnovení kostnej hmoty [6]. Glukokortikoidy majú niekoľko dobre zdokumentovaných účinkov na kosti, ktoré vedú k rozvoju osteoporózy vyvolanej glukokortikoidmi. Tieto účinky zahŕňajú inhibíciu tvorby progenitorových buniek osteoblastov a osteoblastov, zvýšenie apoptózy osteoblastov a zníženie produkcie osteoidov, pričom všetky tieto účinky znižujú tvorbu kosti [25,26]. Glukokortikoidy zároveň zvyšujú kostnú resorpciu znížením expresie OPG, zvýšením expresie RANKL, zvýšením tvorby osteoklastov, znížením apoptózy osteoklastov a zvýšením sekrécie katepsínov a matrixových metaloproteináz osteoklastmi [25,26].
Klotho je integrálnou súčasťou fosfátovacieho systému, čím sa viaže na fibroblastový rastový faktor 23 (FGF23) v obličkách. Komplex klotho-FGF23 sa potom viaže na receptor FGFR1IIC, ktorý iniciuje niekoľko bunkových dráh a v konečnom dôsledku vedie k zvýšeniu expresie renálnej 24-hydroxylázy (CYP24A1) a zníženiu renálnej la-hydroxylázy (CYP27B1) a renálnej tubulárnej Kotransportéry Na/P II (NPT2a a 2c) [10]. Zvýšená expresia (rozdiely, v ktorých boli najvýraznejšie po úprave na opakované opatrenia) klotho u oviec užívajúcich glukokortikoidy počas 2 mesiacov a následne usmrtených po 5 mesiacoch môže vysvetliť zvýšenú expresiu CYP241 pozorovanú aj v tejto skupine oviec, napriek žiadnym významným rozdielom v sérové koncentrácie 25OHD.
Klotho je známy ako proteín proti starnutiu a myši s deficitom klotho majú nízku tvorbu kostí a resorpciu kostí, čo vedie k osteopénii s nízkym kostným obratom [27,28]. Okrem toho, špecifické polymorfizmy klotho génu sú spojené so zníženou hustotou kostných minerálov u ľudí [29,30]. Rozpustné klotho upreguluje skorý rastový proteín 1 (EGR-1) a indukuje expresiu kostných diferenciačných markerov v bunkovej kultúre osteoblastov [31]Glukokortikoidy môžu navyše potlačiť fibroblastový rastový faktor 232]. Možno, že väčšie prejavy klotho u oviec užívajúcich glukokortikoidy počas 2 mesiacov a potom usmrtené po 5 mesiacoch odzrkadľujú proces obnovy pre túto ovčiu po liečbe glukokortikoidmi a vzhľadom na jej úlohu pri tvorbe a resorpcii kostí, možno aj kľúčovou hnacou silou obnovy kostí a preto je potenciálne cieľom liečby osteoporózy u ľudí.
Ovce OVX však mali tiež zvýšené klotho expresie v porovnaní s kontrolnými ovcami. Podobne jedna štúdia na myšiach s deficitom aromatázy ukázala, že nedostatok estrogénu zvýšil hladiny klotho proteínu a liečba estradiolom znížila expresiu klotho u týchto myší [17]. U myší estrogén downreguluje NPT2a v procese, ktorý je nezávislý od klotho/FGF23 a PTH[18]. Tento účinok sa však v tejto štúdii nepozoroval u oviec po ovariektómii. Inak o vplyve nedostatku estrogénu na klotho je málo literatúry. Ďalší výskum by mal preskúmať účinky ovariektómie a glukokortikoidov na expresiu klotho, vzhľadom na jeho úlohu pri starnutí a chronickom ochorení obličiek.
TRPV5 je epiteliálny vápnikový kanál exprimovaný najmä v distálnych stočených tubuloch a spojovacích tubuloch obličky [20,33]. Kanál TRPV5 je konštitutívne otvorený, ale podlieha inaktivácii závislej od vápnika v spojení s kalmodulínom, proteínom citlivým na vápnik [34]. Expresiu TRPV5 možno zvýšiť pomocou PTH a 1,25(OH)D3 [35]. Jedna ovca, ktorá užívala glukokortikoidy 2 mesiace a potom bola usmrtená po 5 mesiacoch, bola hypokalcemická a koncentrácie vápnika v sére boli významne nižšie u oviec v tejto skupine v porovnaní s ostatnými skupinami. Je preto pravdepodobné, že zvýšená expresia TRPV5 je výsledkom zníženej koncentrácie vápnika v sére u týchto zvierat. Ukázalo sa, že glukokortikoidy znižujú črevnú absorpciu vápnika znížením expresie TRPV6 a CalD9k [36,37] a zvýšením vylučovania vápnika močom [14], ale klinicky významná hypokalciémia u zdravých jedincov nie je častá. Podobne ovce s nízkou koncentráciou vápnika v sére nevykazovali žiadne klinické príznaky hypokalcemickej tetánie. Alternatívne by zvýšená expresia TRPV5 u oviec na glukokortikoidoch počas 2 mesiacov a potom usmrtená po 5 mesiacoch mohla odrážať proces obnovy, pričom na nahradenie obnovenej trabekulárnej BMD, plochy a obsahu kostných minerálov je potrebná zvýšená resorpcia vápnika z obličiek.
U oviec liečených glukokortikoidmi počas 5 mesiacov bola expresia PTH1R zvýšená v porovnaní s ostatnými skupinami. Okrem toho v porovnaní s inými skupinami boli medzi ovcami v skupine malé rozdiely v prejave. Hoci sa nepozorovali žiadne rozdiely v koncentráciách vápnika v sére u oviec liečených glukokortikoidmi počas 5 mesiacov, možno by to mohlo súvisieť so zvýšeným účinkom PTH a jeho receptora. Účinky glukokortikoidov na sekréciu a pôsobenie PTH sú nejasné. Niektoré štúdie u ľudí zistili, že pacienti liečení glukokortikoidmi majú zvýšené koncentrácie PTH v sére spolu so zníženou absorpciou vápnika, zvýšeným vylučovaním vápnika močom a zníženou kostnou hmotou [38,39]. Väčšina štúdií však nezistila žiadne zmeny sérových koncentrácií PTH u ľudí pri liečbe glukokortikoidmi [38,40,41]. Jedna štúdia ukázala, že vplyv glukokortikoidov je možno na zmenu sekrécie PTH so zvýšenou pulzatilnou sekréciou PTH u jedincov liečených glukokortikoidmi[4]. Iní tiež preukázali zvýšenú expresiu PTH1R v mezenchymálnych kmeňových bunkách a bunkách podobných osteoblastom ako odpoveď na liečbu dexametazónom [43,44]. Zvýšenie renálnej expresie PTH1R u oviec liečených glukokortikoidmi počas 5 mesiacov je pravdepodobne spôsobené 5-mesačnou liečbou glukokortikoidmi.
Zatiaľ čo ovariektómia v kombinácii s diétou s mierne nízkym obsahom vápnika viedla k minimálnym zmenám génovej expresie, zdá sa, že zmenila expresiu VDR, pričom ovariektómia oviec na diéte s mierne nízkym obsahom vápnika mala vyššiu expresiu VDR v porovnaní s kontrolnými ovcami. To je v protiklade so štúdiou na potkanoch po ovariektómii, kde tie, ktoré dostávali stravu s normálnymi hladinami vápnika, vykazovali zvýšenú renálnu expresiu VDR, zatiaľ čo tie, ktoré dostávali diétu s nízkym obsahom vápnika, mali zníženú expresiu VDR [45]. V tejto súčasnej štúdii s ovcami je ťažké oddeliť účinok ovariektómie na renálnu expresiu VDR od účinku diéty s nízkym obsahom vápnika. Neexistovali však žiadne významné rozdiely v koncentráciách vápnika v sére medzi skupinami (s výnimkou skupiny s glukokortikoidmi), čo naznačuje, že diéta s mierne nízkym obsahom vápnika mala minimálny účinok a možno, že účinky na VDR sú spôsobené ovariektómiou. Na preskúmanie týchto vzťahov však bude potrebný ďalší výskum.
Dve predchádzajúce štúdie skúmali oddelené vzťahy medzi génmi reagujúcimi na vitamín D a génmi súvisiacimi s fosfátovaním v obličkách oviec [20,21]. Vzťahy medzi vitamínom D a fosfátovými cestami však neboli preskúmané. Je zaujímavé, že najvýznamnejšie korelácie medzi génmi uvedené v týchto dvoch dokumentoch platia aj pre génové vzťahy v tejto súčasnej štúdii oviec, čo naznačuje konzistentnosť výsledkov medzi štúdiami a vzťahmi medzi týmito génmi.cistanche salsa extraktZo zaujímavých vzťahov, ktoré neboli predtým uvedené, ako by sa dalo očakávať vzhľadom na jeho kľúčovú úlohu v metabolizme vápnika, expresia PTH1R vysoko korelovala s CalD28k, CalD9k, TRPV5 CYP27B1, CYP24A1, VDR, Klotho a NPT2c. Expresia klotho silne korelovala s génovou expresiou TRPV5, čo je v súlade s inou literatúrou, ktorá ukazuje, že klotho upreguluje TRPV5 a podporuje renálnu reabsorpciu vápnika [46,47].
Bohužiaľ, rôzne skupiny nebolo možné oddeliť na základe génovej expresie reagujúcej na vitamín D a expresie fosfátovania pomocou PCA analýzy. Je to pravdepodobne spôsobené hlavným obmedzením tejto štúdie - malou veľkosťou vzorky. Keďže v každej zo skupín je iba 3-6 zvierat, pravdepodobne to obmedzilo schopnosť zistiť rozdiely v génovej expresii medzi skupinami.
5. Závery
Výsledky z tejto štúdie ukazujú, že najvýraznejšie rozdiely v génovej expresii boli v renálnej klotho expresii u oviec po ovariektómii liečených glukokortikoidmi počas 2 mesiacov, po ktorých nasledovalo obdobie zotavenia 5 mesiacov. Vzhľadom na to, že klotho je hormón „proti starnutiu“ a má rozhodujúcu úlohu v metabolizme vápnika a fosfátov, je možné, že tento hormón sa rozhodujúcim spôsobom podieľa na obnove hustoty a plochy trabekulárnej kosti u liečených oviec, a preto môže byť potenciálne cieľ liečby osteoporózy u ľudí. Je však potrebný ďalší výskum účinkov glukokortikoidov a ovariektómie na klotho.
Tento článok je prevzatý z knihy Animals 2022, 12, 67. https://doi.org/10.3390/ani12010067 https://www.mdpi.com/journal/animals
