Vzorec expresie -tubulínu, inverzínu a jeho cieľového rozstrapatenia-1 a morfológie primárnych riasiniek pri normálnom vývoji ľudských obličiek a ochoreniach

edmund.chen@wecistanche.com

Abstrakt:Časopriestorová expresia -tubulínu, inverzia a rozcuchané-1 (DVL-1) proteíny spojené s Wnt-signalizačnou dráhou a primárna morfológia riasiniek sa analyzovali pri vývojiobličky(14. – 38. vývinový týždeň), zdravý postnatálny (1.5- a 7-ročný) a patologicky zmenený človekobličky,vrátane multicystickej dysplastikyobličky(MCDK), fokálna segmentálna glomeruloskleróza (FSGS) a nefrotický syndróm fínskeho typu (CNF). Analýza bola uskutočnená dvojitou imunofluorescenciou, elektrónovou mikroskopiou, semikvantitatívnymi a štatistickými metódami. Cytoplazmatická koexpresia -tubulínu, inverzia a DVL-1 sa pozorovala v proximálnych stočených tubuloch (pct), distálnych stočených tubuloch (dct) a glomeruloch (g) analyzovaných tkanív. Počasobličkysa celková expresia -tubulínu, inverzie a DVL-1zmenšila, zatiaľ čo v postnatálnom období mierne vzrástla. Najvyššie expresie -tubulínu a inverzia charakterizovali dct a g, zatiaľ čo vysoké DVL-1 charakterizovali pct. -tubulín, inverzia a vzory expresie DVL-1 v MCDK, FSGS a CNFobličkysa výrazne líšili od zdravej kontroly. V porovnaní so zdravýmiobličky, patologicky zmenenéobličkymal dysmorfickú primárnu mihalnicu. Rozdielna dynamika expresie -tubulínu, inverzie a DVL-1 počasobličkyvývoj by mohol naznačovať, že prepínanie medzi kanonickou a nekanonickou Wnt signalizáciou je nevyhnutné pre normálneobličkymorfogenéza. Naproti tomu ich narušený prejav v patologickýchobličkymôže byť spojená s abnormálnymi primárnymi mihalnicami, čo vedie k chronickýmochorenia obličiek.

Kľúčové slová:vývoj ľudských obličiek; -tubulín; inverzín; DVL-1; MCDK; FSGS; CNF; oblička, oblička

CISTANCHE ZLEPŠÍ OCHORENIE OBLIČIEK/OBLIVÍN

Úvod 

Vývoj definitívneho alebo metanefrickéhoobličkyzačína počas piateho gestačného týždňa (GW), ktorý sa potom kontinuálne diferencuje za vzniku trvalých obličiek [1,2]. Signalizačné interakcie medzi metanefrickým mezenchýmom a ureterickým pupeňom zabezpečujú správneobličkyvývoj počas nefrogenézy. Stručne povedané, ureterický pupeň indukuje mezenchymálny-epitelový prechod (MET) v metanefrickom mezenchýme, ktorý kondenzuje a tvoríobličkovévezikuly, po ktorých nasledujú telieska v tvare čiarky a S a nakoniec vedú k tvorbe glomerulov [3]. Na oplátku mezenchým indukuje ďalšie vetvenie ureterického pupene. Metanefrické obličky sa stávajú funkčnými vylučovacími jednotkami v 11. týždni ľudského vývoja. Nefrogenéza je však ukončená v 34. až 36. týždni vývoja plodu, keď sú ukončené viaceré vetvenia, ale ďalší proces diferenciácie obličiek pokračuje do postnatálneho obdobia [4,5]. Poruchy týchto komplexných interakcií vedú k rôznym vrodeným abnormalitám obličiek a močových ciest (CAKUT), vrátane dysplázie, polycystickej choroby obličiek, multicystickej dysplastickejochorenie obličiek(MCDK), čo následne vedie k chronickejochorenie obličiek(CKD) [6].

V tejto štúdii sme sa zamerali na vzhľad primárnych mihalníc a Wnt-signalizačnú dráhu, ktorá hrá dôležitú úlohu počas normálnej nefrogenézy aobličkyopravný proces po akútnom alebo chronickomochorenie obličiek[7]. Existencia primárnych mihalníc počas nefrogenézy a veľký počet vývinovýchobličkydefekty vyskytujúce sa u pacientov s ciliárnym ochorením poukazujú na to, že pre normálnu je nevyhnutná skutočná primárna funkcia mihalnícobličkyorganogenéza [8,9]. Primárne cilium je organela na báze mikrotubulov dôležitá pre tkanivovú homeostázu, kde základnou zložkou je -tubulín [10]. Strata acetylácie -tubulínu v imortalizovaných bunkách spúšťa prechod z epitelu na mezenchym (EMT), čo znamená, že acetylovaný tubulín je dôležitý pri stabilizácii mikrotubulov [11]. Počas ľudského vývoja umožňuje primárna dráha Wnt sprostredkovaná mihalnicami bunkovú proliferáciu, diferenciáciu a morfogenézu tkaniva [12]. U značného počtu detí s poruchou primárnej funkcie mihalníc a narušenou Wnt-signálnou dráhou sa vyvinie CKD, kde je vrodenáobličkovéporuchy sú zodpovedné za takmer polovicu prípadov [13]. Najčastejším vrodeným cystickým ochorením u detí je multicystická dysplastikaochorenie obličiek(MCDK) [14]. Mnohopočetné cysty, ktoré spolu nekomunikujú [15] a nemajú normálny stavobličkovéparenchýmu sú charakteristické mikroskopické nálezy pre MCDK. Fokálna segmentálna glomeruloskleróza (FSGS) je jedným z najčastejších glomerulárnych ochorení, ktoré vedú ku konečnému štádiuochorenie obličiek[16]. Na začiatku je FSGS charakteristický tým, že je fokálny, zahŕňa len menšinu glomerulov a segmentálny, zahŕňa zmeny len v segmente glomerulárneho kruhu [17]. Vrodený nefrotický syndróm fínskeho typu (CNF) je menej častý autozomálne recesívne dedičnýochorenie obličiekreprezentovaný prenatálnym prepuknutím rozsiahlej straty proteínov [18], spojenej s cystogenézou proximálnych tubulov [19]. U mnohých foriem primárnych glomerulárnych ochorení vzniká proteinúria v dôsledku poškodenej glomerulárnej filtračnej bariéry [20]. Značné množstvo štúdií naznačuje, že poškodenie a dysfunkcia podocytov zohrávajú vnútornú úlohu v patogenéze CKD proteinúrie [21]. Štúdia Vukojevica a kol. ukazuje zvýšený počet ciliovaných a slabo diferencovaných podocytov v CNF [22]. Predchádzajúce štúdie ukázali, že signálna dráha Wnt/-katenínu má zásadnú úlohu pri zmierňovaní dysfunkcie podocytov s proteinúriou [23]. Existujú dve hlavné Wnt-signalizačné dráhy, jedna známa ako kanonická závislá od katenínu a druhá nekanonická, nezávislá od katenínu. Počas myšiobličkyvývoj, kanonická signalizácia Wnt je aktívna na hrotoch ureterických pupenov a v telieskach tvaru S [24]. Okrem toho má Wnt prostredníctvom kanonickej signalizácie význam pri udržiavaní MET počas nefrogenézy [25]. Totiž väzba proteínového komplexu obsahujúceho Dvl na membránový receptor je povinná pre aktiváciu Wnt dráhy, zatiaľ čo deaktivácia kľúčových komponentov tejto dráhy vedie k skorej perinatálnej úmrtnosti v dôsledku absencie nefrogénnej zóny vobličky[25]. 

Zistilo sa, že proteín rozhodujúci ako molekulárny prepínač medzi kanonickými a nekanonickými Wnt signálnymi dráhami je inverzia [26]. Hoci boli zistené interakcie rôznych proteínov s inverziou, jej presná funkcia ešte nie je úplne objasnená. Vobličkovéepitelových buniek, inverzia sa nachádza v primárnej mihalnici, pôsobí ako ciliárny proteín [27]. Okrem toho inverzia tvorí stabilný komplex s tubulínom v kultúrachobličkovébunky a kolokalizujú sa in vivo [27,28]. Zdá sa, že inverzia hrá zásadnú úlohu vo včasnej morfogenéze pronefrického systému a určovaní ľavo-pravej symetrie počas vývoja [29,30]. Významná udalosť pre kanonické aj nekanonické Wnt-signalizačné dráhy pri nábore cytoplazmatického Dvl do bunkovej membrány. Pretože predchádzajúce zistenia ukázali, že inverzia a Dvl sa kolokalizujú v renálnych epiteliálnych bunkách, možno špekulovať, že inverzia môže mať úlohu aj v nekanonickej signalizácii. Dysregulácia Wnt-signalizácie sprostredkovaná inverziou spúšťa aberantnú proliferáciu v tubuloch [31]. Genetické testy odhalili DVL-1 mutáciu u pacientov s autozomálne dominantným Robinowovým syndrómom, čo predstavuje heterogénne poruchy u niektorých pacientov spojené s urogenitálnym aobličkovéanomálie [32].

CISTANCHE ZLEPŠÍ DIALÝZU OBLIČIEK/RENÁL

Vzorec vývojovej expresie -tubulínu, inverzie a DVL-1 sa skúmal na rôznych zvieracích modeloch. Ich expresia v pronefros Xenopus laevis bola potvrdená použitím intravitálnej mikroskopie [31], zatiaľ čo boli nájdené v bunkových líniách odvodených z myších proximálnych tubulárnych buniek pomocou konfokálnej mikroskopie a hmotnostnej spektrometrie [33]. Okrem toho svetelná mikroskopia a dvojitá imunofluorescencia odhalili ich prítomnosť v rezoch myšíobličky[34]. Štúdie na myšiach s inverzným knockoutom hlásili zväčšené, difúzne cysty vobličkovédreň a kôra spojená s viscerálnou inverziou situs [35]. U ľudí bola prítomná mutácia inverzie s infantilnou nefronoftízou, ktorá viedla k ukončeniu gravidity [36]. Napriek početným štúdiám oobličkové-tubulín, inverzia a vzor a funkcia DVL{1}} expresie, pokiaľ je nám známe, vzorec expresie týchto proteínov v ľudskom fetálnom a postnatálnom ľudskom tkanive ešte nebol preskúmaný a daná korelácia. Okrem toho neboli hlásené žiadne dôkazy týkajúce sa prejavu inverzie a DVL-1 v ranom vývoji človeka. Preto sa táto štúdia zamerala na analýzu priestorového a časového vzoru expresie -tubulínu, inverzie a DVL-1 počas fetálnych a postnatálnych štádií zdravého človekaobličky, ako aj vobličkytkanivách MCDK, FSGS a CNFobličkys cieľom stanoviť prípadné chýbajúce prepojenie medzi týmito subjektmi. Konkrétne navrhujeme, že narušené vzorce expresie -tubulínových, inverzných a DVL-1 proteínov môžu byť základným procesom cystogenézy a abnormálnou funkciou primárnej mihalnice vedúcej k chronickejochorenia obličiek. 

Výsledky

Analýza vývinovej a postnatálnejobličkytkaniva bola vykonaná na zreteľne diferencovaných štruktúrachoblička:proximálne stočené tubuly (pct), distálne stočené tubuly (dct) a glomeruly (g). Počas analyzovaných vývinových štádií a v postnatálnom obdobíobličkytkanivá, -tubulín, inverzia a DVL-1 vykazovali pozitívne vzorce expresie, ale s rozdielmi v intenzite, distribúcii a množstve. Analýza patologického stavuobličkové tkanivoMCDK, FSGS a CNF sa uskutočňovalo na celom počte snímok pozitívnych buniek v porovnaní s kontrolou tkaniva zdravých obličiek.

2.1. Svetelná mikroskopia, elektrónová mikroskopia a imunohistochémia (-tubulín) zdravého a patologicky zmeneného postnatálneho ľudského obličkového tkaniva

2.1.1. Zdravé popôrodné svetlo obličiek

mikroskopia po pôrodeobličkytkanivo vykazuje dobre definovanéobličkyštruktúry, s výrazným rozdielom medzi dreňom a kôrou a tvorbou pct, dct a g v kortikálnej oblasti. Imunohistochemické farbenie -tubulínu odhaľuje prítomnosť jedného primárneho cilia v strede apikálneho bunkového povrchu každej tubulárnej bunky a v 0.018 percent ± 0,00014 percent SD na povrchu glomerulárnych buniek. Elektrónová mikroskopia ukazuje prítomnosť iba jedného primárneho cilia vychádzajúceho z bazálneho tela na apikálnom bunkovom povrchu tubulu (obrázok 1a).

2.1.2. CNF

Väčšina analyzovaných g je menších a laločnatých (80 percent), zatiaľ čo menšina má normálnu veľkosť alebo hypertrofická (20 percent, n=100). Zisťuje sa segmentová alebo globálna skleróza g, zatiaľ čo pct a dct sú čiastočne dilatované a potiahnuté atrofickým epitelom. Ultraštrukturálne sa pozoruje strata mikroklkov a zníženie výšky buniek s multifragmentáciou jadier. V podocytoch sa procesy nohy difúzne strácajú. Tubulárne primárne riasinky sú dezorganizované, najmä v cystách proximálnych tubulov, čo vykazuje zmeny v dĺžke a cytoplazmatickej polohe (obrázok 1b).

2.1.3. MCDK

V obličkovom tkanive možno sporadicky nájsť nezrelé a zrelé g.Obličkytkanivo je vyplnené početnými oválnymi cystami. Stĺpcové epitelové bunky pokrývajú cysty a sú obklopené voľným spojivovým tkanivom. Imunohistochemické farbenie na -tubulín ukazuje mnohopočetné dlhé a dezorganizované primárne riasinky na povrchu epitelových buniek (obrázok 1c).

2.1.4. FSGS

V 90 percentách g sa nachádza rozsiahla segmentálna skleróza (n=100), spojená s intersticiálnou fibrózou a známkami tubulárneho poškodenia. Zníženie výšky epitelových buniek so stratou mikroklkov sa nachádza v elektrónovom mikroskope, zatiaľ čo endotelové bunky a mezangiálne oblasti majú pravidelnú ultraštruktúru. V elektrónovom mikroskope je na povrchu distálnej tubulárnej bunky pozorované extrémne dlhé a dislokované (decentralizované) cilium (obrázok 1e). Podocyty vykazujú difúznu stratu procesov nohy s rozsiahlym tkanivom mikroklkov. Imunohistochemické farbenie na a-tubulín ukazuje viaceré dlhé a dezorganizované primárne riasinky na povrchu epitelových buniek (obrázok 1c).

2.2. Imunohistochemické farbenie na 心tubulín, inverzia a DVL-1- a štatistická analýza vývoja a zdravých postnatálnych ľudských obličiek

V 14., 15. a 16. gestačnom týždni saobličkytkanivo má rôzne vývojové štádiá tvorby nefrónov: z metanefrických pohárikov,obličkovéštádia vezikúl na príkaz nefrónov v tvare písmena S, čím sa vytvorí nefrogénna zóna vo vonkajšom kortexe (obrázok 2). Rozlišovanie pct, dct a g možno pozorovať v kortikálnych oblastiach bližšie kobličkydreň. Počas 22. GW sa časti drene a kôry stali jasne výraznými, zatiaľ čo v 38. GWobličkyštruktúry sa javia ako vysoko diferencované, obsahujúce zrelé formy pct, dct a g

2.2.1. a-tubulín

Počas vývinu je a-tubulín silne exprimovaný vo všetkých vývinochobličkyštruktúry, primárne vizualizujúce formu primárnych mihalníc na povrchoch parietálnych epitelových buniek Bowmanovho puzdra, g, pct a dct. Vnútriobličkytkanive, 82-97 percent buniek pct exprimuje a-tubulín, zatiaľ čo v dct expresia klesá z 99 percent na 72 percent v 38. GW (pozri obrázok 3, tabuľka 1). Spomedzi rôznych vývojových štádií sa najsilnejšia expresia a-tubulínu nachádza v g 16. GWobličky, obsahujúci 93 percent pozitívnych buniek. pružný 14., 15. a 22. GW (pozri obrázok 3a,b, tabuľka 1), približne 70 percent g buniek exprimuje a-tubulín, zatiaľ čo najmenšia expresia sa pozoruje v 38. GW (p < 0,01)="" s="" 34="" percentami="" pozitívnych="" buniek="" (obrázok="" 3c).="" v="">obličkytkaniva (1.5-rok a 7-rokobličky), najsilnejšia imunoreaktivita na a-tubulín sa pozoruje na apikálnom bunkovom povrchu pct a dct (obrázok 3d-f). Expresia a-tubulínu je tiež prítomná v perinukleárnej cytoplazme dct a parietálnych epiteliálnych bunkách Bowmanovho puzdra. a-tubulín škvrny všetkyobličkovéštruktúry s priemerom 50 percent pozitívnych buniek v pct, 94 percent v dct a 85 percent v g (obrázok 3f). Dct škvrny výrazne odlišné od pct (p < 0,0001).="" všetky="" skúmané="" štruktúry="" sa="" farbia="" pozitívne="" na="" a-tubulín,="" pričom="" 77="" percent="" pozitívnych="" buniek="" v="" pct,="" 72="" percent="" v="" dct="" a="" 58="" percent="" v="" g="">

Obrázok 3. Imunofluorescenčné farbenie -tubulínu a DAPI vo vyvíjajúcich sa a postnatálnych ľudských obličkových tkanivách (a–e). Obličky 14., 15./16., 38. GW (a–c);obličkyz 1.5- a 7-ročných detí (d,e). Pozitívne farbenie -tubulínu (šípky) je znázornené v každej štruktúre v kortexe prostredníctvom vývojových a postnatálnych fáz (a–e), proximálnych stočených tubulov (pct), distálnych stočených tubulov (dct) a glomerulov (g). Podrobnosti primárnych riasiniek v pct (d) a dct (a–c,e) sú zobrazené ako vložky s vyšším zväčšením (biely rámček). Zväčšenie × 40, mierka 100 µm. Distribúcia buniek pozitívnych na tubulín na štruktúru v rôznych štádiách vývoja a v postnatálnom období je znázornená v grafe (f). Graf (g) (celkový počet proteín-pozitívnych buniek v pozorovaných štruktúrach) ukazuje proteínovú expresiu súvisiacu s vývojovým časom (lineárna regresia) a vzájomný vzťah -tubulínu k DVL-1 počas vývoja a dozrievania (Two-Way ANOVA, po ktorej nasleduje posthoc test SIDAK). Údaje sú uvedené ako priemer ± SD.

Distribúcia -tubulín-pozitívnych buniek na štruktúru v rôznych štádiách vývoja a v postnatálnom období je znázornená v grafe (f). Graf (g) (celkový počet proteín-pozitívnych buniek v pozorovaných štruktúrach) ukazuje proteínovú expresiu súvisiacu s vývojovým časom (lineárna regresia) a vzájomný vzťah -tubulínu k DVL-1 počas vývoja a dozrievania (dvojcestná ANOVA nasledovaná Sidakov post hoc test). Údaje sú uvedené ako priemer ± SD.

2.2.2. Dvojité imunofluorescenčné farbenie na inverziu a DVL-1 a DAPI jadrové sfarbenie vo vývoji a zdravých postnatálnych obličkách Inverzná expresia vo vyvíjajúcom sa a postnatálnom obličkovom tkanive

V 14., 15. a 16. GW inverzia vykazuje silnú granulárnu expresiu vg a miernu granulárnu expresiu v cytoplazme pct a dct (obrázok 4a,b), zatiaľ čo v 22. a 38. GW (pozri obrázok 4c), silne pozitívna expresia sa pozoruje v g (tabuľka 1). Medzi 14. a 22. GW približne 50 percent buniek exprimuje verziu. V 16. GW bunky pct exprimujú inverziu v 73 percentách buniek, zatiaľ čo pokles na 29 percent buniek (p < 0,05)="" v="" 38.="" gw="" (pozri="" obrázok="" 4f).="" pozitívna="" expresia="" inverzie="" sa="" nachádza="" v="" približne="" 80–90="" percentách="" dct="" a="" g="" buniek="" vo="">obličkytkanivách 14. a 16. GW, s najnižšou expresiou v dct 38. GW (p < 0.05,="" p="">< 0,0001,="" v="" tomto="" poradí),="" kde="" 66="" percent="" buniek="" bolo="" pozitívnych.="" v="">obličky, pct sa silno farbí na apikálnej bunkovej membráne, zatiaľ čo dct sa farbí väčšinou na bazálnej bunkovej membráne a v perinukleárnej cytoplazme (obrázok 4d, e). V tomto štádiu sme u všetkých skúmaných našli prejav inverzieobličkovéštruktúry, vrátane pct, dct a g, s priemernou expresiou pozitívnych buniek 92 percent pre pct, 88 percent pre dct a 90 percent pre g (obrázok 4f). Nepozorovali sme signifikantný rozdiel v sile signálu inverznej expresie medzi štruktúrami. Najvyššia expresia inverzie sa nachádza v g, s priemerom 94 percent pozitívnych buniek (obrázok 4f). Významný rozdiel sa zistil porovnaním farbenia g (kde sa 94 percent buniek farbí pozitívne) s pct, kde sa 58 percent buniek farbí pozitívne (p < 0.01)="" a="" s="" dct,="" kde="" je="" 49="" percent="" buniek="" pozitívne="" (p="">< 0,0001,="" obrázok="">

Expresia DVL-1 vo vývoji a postnatálnom obličkovom tkanive

Mierna až silná expresia DVL{{0}} sa pozoruje v cytoplazme pct, dct ag vo fetálnom období (pozri obrázok 4a–c, tabuľka 1). V pct 76–86 percent buniek exprimuje DVL-1 v 14.–22. GW, zatiaľ čo v 38. GW je 57 percent pozitívnych buniek (obrázok 4g). V dct 14. a 15. GW 68–70 percent buniek exprimuje DVL-1, v 16. a 22. GW počet pozitívnych buniek klesne na 42–5{{41} } percent, zatiaľ čo v 38. GW expresia (p < 0,001),="" je="" pozorovaná="" u="" 19="" percent="" dct="" buniek.="" expresia="" dvl-1="" sa="" zvyšuje="" v="" g="" počas="" fetálnych="" štádií:="" v="" 14.="" gw="" je="" to="" 6="" percent,="" zatiaľ="" čo="" v="" 15.,="" 16.="" a="" 22.="" gw="" sa="" zvyšuje="" na="" 10="" percent="" (p="">< 0,01).="" v="" 38="" gw="" 14="" percent="" g="" buniek="" exprimuje="" dvl-1="" (obrázok="" 4="" g).="" v="" postnatálnom="" období="" je="" imunoreaktivita="" dvl="" -1="" rozptýlená="" v="" cytoplazme="" (tabuľka="" 1)="" pct="" aj="" dct="" (obrázok="" 4d,="" e).="" signál="" sa="" nachádza="" vo="" všetkých="" skúmaných="" štruktúrach,="" ale="" väčšinou="" v="" perinukleárnej="" cytoplazme.="" intenzita="" expresie="" dvl-1="" je="" významne="" vyššia="" v="" pct="" v="" porovnaní="" s="" dct="" ag="" (p="">< 0,01).="" 39–45="" percent="" buniek="" v="" pct="" a="" dct="" exprimuje="" dvl-1,="" zatiaľ="" čo="" v="" g="" je="" 21="" percent="" buniek="" pozitívnych="" (obrázok="" 4="" g).="" nezistili="" sme="" signifikantný="" rozdiel="" medzi="" percentom="" imunoreaktívnych="" buniek="" v="">obličkovéštruktúry. Percento DVL-1 imunoreaktívnych buniek je 34 percent v pct, 36 percent v dct a 27 percent v g, v uvedenom poradí (obrázok 4g).

Obrázok 4. Dvojité imunofluorescenčné farbenie inverzie (zelená), DVL-1 (červená) a DAPI (modrá) vo vyvíjajúcich sa a postnatálnych obličkových tkanivách (14. – 38. GW, 1.5- a {{6 }}ročné tkanivá obličiek). Pozitívne farbenie (šípky) je znázornené v každej štruktúre vo všetkých fázach vývoja (a–c) a v postnatálnom období (d, e). Zlúčené mikrofóny spolu so štruktúrami záujmu v kôre: proximálne stočené tubuly (pct), distálne stočené tubuly (dct) a glomeruly (g). Kolokalizácia inverzie/DVL-1 (šípka) je znázornená na zlúčených mikrofotografiách. Negatívne kontrolné zafarbenia sú zobrazené ako vložky na inverziu a DVL-1 (a). Erytrocyty možno vidieť ako silne zafarbené bunky blízko dct. Podrobnosti sú zobrazené ako vložky s väčším zväčšením. Zväčšenie × 40, mierka 100 µm. Dynamická pozitívna bunková distribúcia inverzie a DVL-1 v obličkových štruktúrach (pct, dct, g) počas vývojových a postnatálnych štádií je znázornená v grafoch (f, g). Graf (h) ukazuje expresiu proteínu (celkový počet pozitívnych buniek v štruktúrach) súvisiacu s vývojovým časom (lineárna regresia) a vzájomný vzťah inverzie k DVL-1 prostredníctvom vývoja a dozrievania (obojsmerná ANOVA nasledovaná Sidakovým post hoc testom ). Údaje sú uvedené ako priemer ± SD.

Spoločná expresia inverzie a DVL-1 sa pozoruje v cytoplazme obličiek g, dct a pct počas vývoja (pozri obrázok 4a–c, zlúčenie). V postnatálnom období koexpresia inverzie a DVL-1 charakterizuje rôzne bunkové kompartmenty tubulárnych buniek v pct a dct, zatiaľ čo koexpresia v g je charakterizovaná silnou prevalenciou inverznej expresie (pozri obrázok 4d, zlúčiť ). V 7-rokoch postnatálnych obličiek sa koexpresia inverzie a DVL-1 pozoruje v tubulárnych bunkách dct a pct a v g, kde mierne prevažuje expresia inverzie v porovnaní s DVL-1 (Obrázok 4e, zlúčiť).

2.2.3. Rozdiely v expresii -tubulínu, inverzie a DVL-1 medzi rôznymi vývojovými štádiami obličiek a postnatálnymi obličkami

Počet -tubulín-pozitívnych buniek v pct tkaniva obličiek plodu bol štatisticky významne vyšší v porovnaní s tkanivom obličiek 7-ročných detí (13. miesto (p < 0).0{="" {11}}1),="" 15.="" (p="">< 0.0001)="" a="" 16.="" (p="">< 0.00001)="" gw).="" dct="" raných="" štádií="" plodu="" (13.,="" 15.,="" 16.="" a="" 22.="" gw)="" malo="" viac="" pozitívnych="" buniek="" v="" porovnaní="" s="" 38.="" gw="" a="" 1,{19}}ročným="" tkanivom="" obličiek="" u="" detí="" (p="">< 0,0001,="" v="" uvedenom="" poradí,="" obrázok="" 3f).="" pri="" porovnaní="" rôznych="" vývojových="" štádií="" sme="" zistili="" nižšie="" úrovne="" expresie="" inverzie="" v="" pct="" 13.="" (p="">< 0,0001),="" 15.="" (p="">< 0,00001),="" 22.="" (p="">< 0,001)="" a="" 38.="" (p="">< 0,0001)="" gw="" v="" porovnaní="" s="">obličkovétkaniva od 1{1}}ročného dieťaťa. V dct bola zistená štatisticky významne nižšia expresia inverzie v porovnaní s tkanivom obličiek 16. GW a 38. GW (p < 0.0001).="" okrem="" toho,="" nižšia="" expresia="" inverzie="" v="" dct="" bola="" pozorovaná="" v="" tkanive="" obličiek="" 7-ročného="" dieťaťa;="" porovnaním="" 13.,="" 15.="" (p="">< 0,001,="" obe),="" 16.="" a="" 1.{15}}ročného="" tkaniva="" obličiek="" s="" dct="" 7-ročného="" tkaniva="" obličiek="" (p="">< 0,00001,="" v="" tomto="" poradí,="" obrázok="" 4f).="" pozorovaný="" signál="" expresie="" dvl-1="" v="" rôznych="" štádiách="" odhalil,="" že="" pct="" z="" 13.="" (p="">< 0,01),="" 15.,="" 16.="">< 0.001,="" respectively)="" and="" 22nd="" (p="" <="" 0.0001)="" gw="" had="" higher="" expression="" of="" immunoreactive="" cells="" compared="" to="" the="" pct="" of="" 7-year-old="" children="" kidney="" tissue.="" dvl-1="" immune-expression="" in="" dct="" of="" the="" kidney="" from="" 13th="" and="" 15th="" gw="" was="" significantly="" higher="" than="" in="" the="" 38th="" gw="" tissue="" (p="" <="" 0.0001,="" respectively,="" figure="">

2.2.4. Vzťah medzi prejavmi -tubulínu a inverziou k DVL-1 vo vyvíjajúcom sa a postnatálnom obličkovom tkanive

-Expresie tubulínu a inverzie sa porovnávali s expresiou DVL-1 počas vývojových štádií a v postnatálnom tkanive obličiek. -tubulín mal štatisticky vyššiu expresiu vo všetkých pozorovaných štádiách v porovnaní s expresiou DVL-1 (p < 0.001,="" obrázok="" 3g).="" vo="" všetkých="" pozorovaných="" štádiách="" mala="" inverzia="" vyššiu="" expresiu="" v="" porovnaní="" s="" dvl-1="" (p="">< 0,0001,="" obrázok="" 4="">

2.2.5. Porovnanie imunohistochemického farbenia s -tubulínom, verzia a DVL-1- a štatistická analýza patologicky zmeneného obličkového tkaniva (MCDK, CNF, FSGS) -tubulín Rozdiel vo farbení -tubulínom v MCDK, FSGS a CNF bol štatisticky významný v porovnaní na zdravé postnatálne obličkové tkanivo ako kontrolnú skupinu (p < 0,0001,="" v="" tomto="" poradí).="" dysplastické="" obličkové="" tkanivá="" mali="" významne="" vyššiu="" expresiu="" v="" porovnaní="" s="" kontrolnou="" skupinou,="" zatiaľ="" čo="" fsgs="" a="" cnf="" vykazovali="" významne="" nižšiu="" expresiu="" -tubulínu="" v="" porovnaní="" so="" zdravou="" kontrolou="" (obrázok="">

Inverzia

Inverzia je exprimovaná v cytoplazme dezorganizovaných epiteliálnych buniek a tubuloch MCDK (obrázok 5a). V CNF inverzná expresia charakterizuje g a dct, zatiaľ čo v cystách pct sa prejavuje menej intenzívne (obrázok 5b). Pri FSGS je inverzia silne exprimovaná v g a dct, ale menej intenzívne v cystách pct (obrázok 5c). Priestorová expresia inverzie vykazovala štatisticky významne vyššiu mieru zafarbenia v tkanivách zdravých obličiek (obrázok 5g) v porovnaní s MCDK, FSGS a CNF (p < 0,0001,="" v="" tomto="">

Obrázok 5. Dvojité imunofluorescenčné farbenie inverzie (zelená), DVL-1 (červená) a DAPI (modrá) v patologických obličkových tkanivách v MCDK (a), CNF (b) a FSGS (c): tubuly (t) , glomeruly (g), pct cysta (c), výška pct epitelových buniek (*). Štruktúra a ko-lokalizácia buniek inverzie a DVL-1 (šípky) sú zobrazené v zlúčených sekciách s podrobnosťami vo väčších zväčšeniach. Negatívne kontrolné zafarbenia sú zobrazené ako vložky na inverziu a DVL-1 (a). Zväčšenie ×40, mierka 10{{20}} µm. Vzťah -tubulínu (d) a inverzie (e) k DVL-1 expresii v MCDK, FSGS a CNF (dvojcestná ANOVA nasledovaná SIDAKovým post hoc testom). Rozdiel vo výške epitelových buniek (f) FSGS, CNF a MCDK pct v porovnaní so zdravou kontrolou (jednosmerná ANOVA nasledovaná Tukeyho post hoc testom, n=50). Rozdiel v celkovom percente pozitívnych buniek -tubulínu, inverzie a DVL-1 v MCDK, CNF a FSGS v porovnaní so zdravou kontrolou (g–i), jednosmernou ANOVA nasledovanou Tukeyho post hoc testom. Údaje sú uvedené ako priemer ± SD. Významné rozdiely indikuje p-hodnota (* p < 0,05,="" **="" p="">< 0,01,="" ****="" p="">< 0,0001).="" dvl-1="" dvl-1="" je="" veľmi="" mierne="" exprimovaný="" iba="" v="" dezorganizovaných="" tubuloch="" mcdk,="" zatiaľ="" čo="" v="" cnf="" jeho="" expresia="" charakterizuje="" dct="" a="" g="" (obrázok="" 5a,b).="" v="" fsgs="" sa="" dvl-1="" pozoruje="" ako="" mierna="" reaktivita="" v="" g,="" dct="" a="" pct="" (obrázok="" 5c).="" tkanivá="" zdravých="" obličiek="" zafarbené="" na="" dvl-1="" vykazovali="" významne="" vyššiu="" mieru="" zafarbenia="" (obrázok="" 5="" h)="" na="" rozdiel="" od="" mcdk="" a="" fsgs="" (p="">< 0,0001,="" obe),="" zatiaľ="" čo="" pri="" cnf="" sa="" nezistil="" žiadny="" významný="">

2.2.6. Vzťah medzi expresiou -tubulínu a inverziou k DVL-1 v patologicky zmenenom tkanive obličiek (MCDK, CNF, FSGS)V MCDK, FSGS a CNF je -tubulín zafarbený výrazne vyššie ako DVL-1 (p < 0.0001,="" v="" tomto="" poradí,="" obrázok="" 5d).="" inverzia="" sa="" zafarbila="" významne="" vyššie="" v="" porovnaní="" s="" dvl-1="" v="" mdck="" (p="">< 0,0001)="" a="" vo="" fsgs="" (p="">< 0,01,="" obrázok="">

2.2.7. Rozdiely vo výške epiteliálnych buniek proximálnych stočených tubulov medzi zdravým kontrolným tkanivom a patologicky zmeneným obličkovým tkanivom (MCDK, CNF, FSGS)Výška epitelových buniek pct (n {{0}} na skupinu) sa porovnávala medzi tubulárnymi bunkami v tkanivách zdravých obličiek a patologicky zmenenými obličkovými tkanivami (obrázok 5b, c, f). Priemerná výška epitelových buniek v HC bola 12,91 um ± 1,847 um a bola významne vyššia v porovnaní s CNF a FSGS (p < 0,0001,="" v="" tomto="" poradí).="" priemerná="" výška="" buniek="" v="" cnf="" pct="" bola="" 9,011="" um="" ±="" 1,453="" um,="" zatiaľ="" čo="" vo="" fsgs="" bola="" 8,114="" um="" ±="" 0,9248="" um.="" pct="" epitelové="" bunky="" mcdk="" nevykazovali="" významné="" zmeny="" vo="" výške="" (12,17="" um="" ±="" 1,476="" um)="" v="" porovnaní="" s="">

2.2.8. Rozdiely v dĺžke primárnej mihalnice medzi zdravou kontrolou a patologicky zmeneným obličkovým tkanivom (MCDK, CNF, FSGS)

Primárna dĺžka riasiniek (n= 50 na skupinu) sa porovnávala medzi HC a patologicky zmenenými obličkovými tkanivami (obrázok 6c). Zdravé obličkové tkanivá a MCDK boli zafarbené -tubulínom, aby sa uistila špecifickosť farbenia -tubulínom cilium (obrázok 6a, b). V zdravých obličkových tkanivách bolo primárne cilium dlhé 5,065 µm ± 1,229 µm, zatiaľ čo v MCDK, CNF a FSGS boli výrazne dlhšie (p<0.0005, respectively).="" primary="" cilium="" length="" in="" mcdk="" was="" 9.908="" µm="" ±="" 2.434="" µm,="" in="" cnf="" 13.65="" µm="" ±="" 3.218="" µm,="" while="" in="" fsgs="" was="" significantly="" longer,="" 18.29="" µm="" ±="" 4.717="" µm,="" when="" compared="" to="" hc=""><0.0001) and="" other="" pathological="" kidney="" tissues="" of="" mcdk=""><0.0001) and="" cnf=""><>

Diskusia

Cieľom našej štúdie bolo preskúmať imunohistochemickú expresiu a-tubulínu, inverziu a DVL-1 u ploduobličkovétkaniva a postnatálneho tkaniva obličiek. Ďalej sme chceli preskúmať, či je expresia a vzor farbenia a-tubulínu, inverzie a DVL-1 narušená pri rôznych ochoreniach obličiek v porovnaní so zdravou kontrolou. Konkrétne, napriek rozsiahlemu záujmu ostatných výskumníkov o úlohu a-tubulínu, inverzie a DVL-1 počas vývoja obličiek, väčšina predchádzajúcich štúdií používala zvieratá alebo experimentálne modely in vitro. Pokiaľ vieme, toto je prvá štúdia, ktorá preukázala expresiu a lokalizáciu a-tubulínu spolu s inverziou a DVL-1 vo fetálnych a postnatálnych ľudských obličkách a ktorá skúmala expresiu uvedených proteínov v obličkách choroby, ako sú MCDK, FSGS a CNF. Analyzovali sme aj zmeny v dĺžke a vzhľade mihalníc pomocou svetelnej a elektrónovej mikroskopie, keďže naša predchádzajúca štúdia už naznačila, že ciliárne poruchy môžu byť spojené s cystogenézou v FSGF a CNF [19].

V kanonickej Wnt-signalizačnej dráhe väzba Wnt ligandov na receptory získava Dvl [37]. Procesy MET a dráha polarity planárnych buniek počas skorých štádií morfogenézy obličiek sú riadené signalizáciou Wnt. Sprostredkovaním dráhy Wnt riadi primárna mihalnica bunkovú proliferáciu, diferenciáciu a morfogenézu tkaniva [12] prostredníctvom organizovania bunkového cytoskeletu a orientácie bunky, ako aj predlžovania tubulárnej štruktúry [2,38]. V našej štúdii boli -tubulín, inverzia a DVL-1 všetky prítomné v obličkových štruktúrach a všetky boli kolokalizované nielen počas vývoja fetálnej obličky, ale aj v obličkovom tkanive od 1.5- a {{9} }}ročné deti. Tieto zistenia sú v súlade s aktiváciou Wnt-signalizačnej dráhy, ku ktorej dochádza už počas tubulogenézy [39]. Naše výsledky navyše odhalili, že expresia -tubulínu a inverzia sú recipročne spojené s DVL-1 a že vykazujú štatisticky významný rozdiel medzi ich vzormi expresie. To je v korelácii s experimentálnymi modelmi, pretože mutácia celej rodiny proteínov Dvl u myší vedie k nedostatku procesu gastrulácie, zatiaľ čo mutácie, ktoré nezahŕňajú celú rodinu proteínov, vykazujú defekty v umiestnení nodálnych mihalníc spolu s orgánovými defektmi [40]. . Predchádzajúce zistenia naznačujú, že inverzia má úlohu pri migrácii buniek v Xenopus pronepros. Keďže tento segment koreluje s cicavčou slučkou Henleho a distálnych tubulov, mohlo by to naznačovať dôležitosť inverzie počas vývoja obličiek aj u ľudí [41]. V súlade s týmto predpokladom predchádzajúce štúdie odhalili, že mutácia inverzného génu by mohla viesť k nefronoftíze typu 2, ktorá je sprostredkovaná abnormálnou expresiou DVL-1 [42]. Napriek tomu, že úloha primárneho cilia je kontroverzná v regulácii Wnt-signalizačnej dráhy, zistili sme, že -tubulín sa v analyzovaných vzorkách obličiek kolokalizoval s inverziou a DVL-1. Okrem toho predchádzajúce štúdie poukázali na to, že primárne cilium spolu s inverziou reguluje degradáciu Dvl ovplyvňovaním Wnt-signalizačnej dráhy [43]. Pri ochoreniach ľudských obličiek spojených s vývojom cýst bola pozorovaná abnormálna lokalizácia a funkcia primárnych mihalníc [19]. Podobne táto štúdia tiež potvrdila morfologické zmeny tvorby primárnych mihalníc pri patologických stavoch, ako sú CNF, FSGS a MCDK. Predchádzajúce zistenia potvrdili, že nadmerná aktivácia kanonickej dráhy Wnt po poškodení obličiek vedie k ireverzibilným štrukturálnym zmenám tkaniva obličiek [44]. Naopak, primárne cilium dostalo úlohu prechodu z kanonickej na nekanonickú dráhu Wnt pri pomociobličkovéoprava. Okrem toho sa zistilo, že nadmerná aktivácia kanonickej dráhy Wnt v tkanive transplantovanej obličky má pozitívnu predikčnú hodnotu pre fibrózu obličiek [45]. Ak prevláda kanonická dráha Wnt na úkor nekanonickej, podporuje to teóriu fibrózy obličiek ako výsledok. Naše zistenia o zníženej expresii tubulínu a inverzii v CNF a FSGS naznačujú nečinnosť nekanonickej dráhy Wnt, najmä preto, že oba stavy majú tendenciu viesť ku konečnému štádiuobličkové ochorenie.Menovite sa predpokladá, že normálna lokalizácia a funkcia primárneho cilia by mohla byť faktorom udržiavania pravidelnej dráhy Wnt, a teda predpokladom pre normálny vývoj. Naopak, ak je dráha Wnt posilnená, môže to viesť k dysregulovanej bunkovej proliferácii a diferenciácii vedúcej ku karcinogenéze [46]. Ako už bolo opísané, kanonická dráha Wnt je povinná pre iniciáciu MET a tvorbu nefrónu, zatiaľ čo jej narušenie môže viesť kobličkovéhypoplázia [47]. Naše výsledky podporujú túto myšlienku odhalením najnižšej expresie DVL-1 s najvyššou expresiou -tubulínu v MCDK v porovnaní so zdravou kontrolou. Tieto výsledky môžu znamenať najnižšiu aktiváciu kanonickej dráhy Wnt, čo by mohlo byť základnou príčinou absencie tvorby nefrónov. Na rozdiel od toho, najvyššia expresia -tubulínu s najnižšou expresiou DVL-1 by mohla vysvetliť zistenia viacerých cýst, pretože neexistuje žiadne organizované predlžovanie a polarizácia buniek riadená nekanonickou dráhou Wnt. Predchádzajúce štúdie tiež ukázali, že inverzia inhibuje kanonickú Wnt signálnu dráhu zacielením Dvl na degradáciu [26]. Zistilo sa, že tento krok v ich interakcii je nevyhnutný na inhibíciu kanonickej Wnt-signalizácie pri udržiavaní normálneho tubulárneho predĺženia a polohy. Inverzná mutácia má za následok upreguláciu kanonickej Wnt signalizácie, ktorá následne vyvolala abnormálnu proliferáciu v tubulárnych bunkách. Tento krok sa ukázal ako kľúčový pri cystogenéze [42], zatiaľ čo knockout inverzie u myší vedie k polycystickej chorobe obličiek [48]. Podľa teórie oobličkovécystogenéza, inverzia sa považuje za „mykoproteín“, pretože sa nachádza v primárnej mihalniciobličkovétubulárne bunky. V našej štúdii boli primárne riasinky prítomné na apikálnom bunkovom povrchu tubulárnych buniek vo všetkých analyzovaných štádiách, zatiaľ čo počas fetálnych štádií bola expresia -tubulínu silnejšia ako v postnatálnom období.

CISTANCHE ZLEPŠÍ BOLESŤ OBLIČIEK/OBLIVÍN

Predchádzajúce štúdie ukázali, že primárna funkcia mihalníc môže byť ovplyvnená dysreguláciou -tubulínu počas vývoja, čo môže viesť k cystogenéze, abnormálnemu vývoju obličiek a možnému chronickému ochoreniu obličiek v detstve [31,49]. To je v súlade s našimi zisteniami o skrátených a dysmorfných primárnych mihalniciach pozorovaných v MCDK alebo s viacnásobnými a extrémne predĺženými alebo dislokovanými mihalnicami nájdenými v dilatovaných tubuloch CNF a FSGS v porovnaní so zdravou kontrolou. Na podporu skutočnosti, že kanonické a nekanonické Wnt-signalizačné dráhy, regulované primárnymi mihalnicami, sa považujú za povinné pre normálny vývoj obličiek, sme zistili výrazne nižšie zafarbenie inverzie a DVL-1 v MCDK v porovnaní so zdravou kontrolou [31,49]. Rozdielna dynamika expresného vzoru -tubulínu, inverzie a DVL-1 v rôznych fázach vývoja obličiek môže naznačovať prepínanie medzi kanonickou a nekanonickou Wnt-signalizačnou dráhou počas normálnej morfogenézy obličiek. Navrhujeme, aby ich výmena určovala transkripciu v kanonickej dráhe alebo poradie migrácie a polarizácie buniek počas vývoja obličiek v nekanonickej signálnej dráhe. Ich rovnováha a expresia vo všetkých skúmaných obličkových štruktúrach naznačuje ich dôležitú úlohu pri normálnom vývoji obličiek. Počas normálneho vývoja obličiek (od 13. GW do 38. GW) celková expresia -tubulínu, inverzie a DVL-1 klesá, pretože obličkové tkanivo nadobúda zrelú morfológiu. V 1.5- a 7-ročnom obličkovom tkanive, -tubulín a inverzia vykazovali mierne zvýšenie expresie, čo podporuje skutočnosť, že nekanonická dráha Wnt zostáva aktívna aj po narodení. Naopak, DVL-1 pretrváva so zníženým vzorcom expresie, čo by mohlo prispieť k záveru, že kanonická dráha Wnt je v zdravom tkanive obličiek umlčaná. V dôsledku patologických stavov obličiek môžu epiteliálne bunky obličiek reagovať s opätovným objavením sa EMT a fibrózy [50] spojenej s reaktiváciou kanonickej dráhy Wnt [44]. Poruchy -tubulínu, inverzie a DVL-1 zistené v chorých obličkách preto môžu byť základným patologickým mechanizmom a výsledkom prechodu z nekanonickej na kanonickú dráhu Wnt vo vyvíjajúcej sa obličke, čo poukazuje na zmenu medzi reverzibilnými obličkami na ireverzibilné škody. Ďalej zmeny v ich prenatálnom a postnatálnom obdobíobličkovévzor expresie môže byť spojený s poškodením funkcie obličiek v dospelosti, čo vedie k vrodeným ochoreniam a chronickému zlyhaniu obličiek.

4. Materiály a metódy

4.1. Ľudské vzorky

Vzorky tkaniva obličiek plodu boli odobraté po strate tehotenstva v 14., 15., 16., 22. a 38. GW na Gynekologicko-pôrodníckej klinike Univerzitnej nemocnice Center Split. Všetok získaný fetálny materiál bol vyšetrený patológom a na štúdiu boli použité iba tkanivá bez známok abnormalít, macerácií alebo vnútromaternicového odumretia a s normálnym karyogramom. Lekárske záznamy matiek boli preskúmané pred odberom vzoriek a v prípade zdravotných problémov, ktoré by mohli ovplyvniť výsledok tehotenstva, boli tkanivá obličiek zo štúdie vylúčené. Zrelosť bola určená obvodom hlavy, obvodom brucha a dĺžkou stehennej kosti [51] v korelácii s menštruačnými kalendármi pacientok. Vzorky 1.5- a 7-ročného tkaniva obličiek boli odobraté po náhodných úmrtiach. Vzorky boli získané na Oddelení patológie Univerzitnej nemocnice Center Split. Vzorky tkanív multicystických dysplastických obličiek (MCDK) boli získané po strate tehotenstva, fokálnej segmentálnej glomeruloskleróze (FSGS) a nefrotickom syndróme fínskeho typu (CNF) v dôsledku nefrektómie. Všetok získaný materiál vyšetril a vyhodnotil patológ, ktorý klasifikoval diagnózy. Protokol štúdie schválila Etická komisia Lekárskej fakulty Univerzity v Splite (20. mája 2016) v súlade s Helsinskou deklaráciou a jej aktualizáciami (klasifikačné číslo: 003-08/16-03/0001, registračné číslo: 2181-198-03-04-16-0024, 20. máj 2016) [52].

4.2. Imunohistochémia

Fixácia odobratej vzorky tkaniva bola spracovaná so 4 percentami paraformaldehydu vo fosfátom pufrovanom fyziologickom roztoku (PBS) počas 24 hodín pri 22 °C. Po dehydratácii v 100-percentnom etanole boli vzorky zaliate do parafínu, ako už bolo opísané [53]. Vzorky boli narezané na 5 um hrubé rezy pomocou mikrotómu a následne pripevnené na mikroskopické sklíčka. Na overenie zachovania tkaniva bol každý 10. rez zafarbený hematoxylínom a eozínom [54]. Oddelenie feminizácie a imunohistochémia sa uskutočnili tak, ako už bolo opísané [2,55,56]. Po opláchnutí v PBS boli mikroskopické sklíčka cez noc inkubované s primárnymi protilátkami vo vlhkej komore pri 22 °C (systém farbenia sklíčok StainTray; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA). Primárne použité protilátky boli králičie monoklonálne anti-alfa tubulínové protilátky (riedenie 1:1000; ab179484, Abcam, Cambridge, Spojené kráľovstvo), králičia polyklonálna antiinverzná protilátka (riedenie 1:100; ab65187, Abcam, Cambridge, Spojené kráľovstvo), myšia monoklonálna DVL -1 protilátka (riedenie 1:150; sc-8025, Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA) a králičia polyklonálna anti-gama tubulínová protilátka (na overenie primárneho zafarbenia špecifického pre riasinky pomocou alfa- tubulín, riedenie 1:500, ab11321, Abcam, Cambridge, UK). Po opláchnutí v PBS sa hodinu podávali sekundárne protilátky, ako je uvedené: oslie anti-králičie IgG H&L, Alexa Fluor 488 (riedenie 1:400; ab150073, Abcam, Cambridge, UK) a kozie anti-myšie IgG H&L, TRITC (riedenie 1:400; ab6786, Abcam, Cambridge, UK) 4',6-diamidino-2-fenylindol dihydrochlorid (DAPI) sa použil na farbenie jadier a po 2-minútovej inkubácii sa sklíčka boli premyté v PBS a prekryté montážnym médiom a krycími sklíčkami. Nešpecifickému zafarbeniu sa predišlo použitím proteínového bloku (ab64226; Abcam, Cambridge, UK) pred aplikáciou primárnej protilátky. Ako negatívna kontrola bol vykonaný predadsorpčný test, pričom špecifickosť sekundárnych protilátok bola kontrolovaná vynechaním primárnych protilátok z postupov farbenia.

4.3. Elektrónová mikroskopia

Fixáciaobličkytkanivách sa uskutočňovali v 4 percentnom paraformaldehyde počas 24 hodín, po čom nasledovala post-fixácia v 1 percente oxidu osmičelého počas 1 hodiny. Proces dehydratácie sa uskutočňoval s etanolovými sériami a skončil sa zaliatím do živice LX 112 [22]. Tenké rezy s veľkosťou jeden mikrometer sa zafarbili pomocou toluidínovej modrej a študovali sa na výber ultratenkých rezov. Ultratenké rezy s hrúbkou 0,05 mikrometrov sa skúmali po farbení octanom uranylom a citrátom olovnatým. Na získanie mikrofotografií bol použitý mikroskop JEOL 1200 EX.

4.4. Genetická analýza

Ako už bolo opísané [19], pomocou leukocytov z periférnej krvi sa extrahovala genómová DNA. Našla sa homozygotná missense mutácia v géne NPHS1 (c.1096A > C; p.Ser366Arg), čo potvrdilo diagnózu kongenitálneho nefrotického syndrómu fínskeho typu (CNF) [57].

CISTANCHE ZLEPŠÍ INFEKCIU OBLIČIEK/OBLIVÍN

4.5. Analýza dát

Analýza rezu sa uskutočnila na fluorescenčnom mikroskope FL s použitím 3 fluorescenčných kanálov FL (Olympus BX51, Tokio, Japonsko). Snímky boli zachytené digitálnym fotoaparátom DP71 (Olympus, Tokio, Japonsko) pri vysokom zväčšení (×40). Lenobličkovékôra obsahujúca proximálne stočené tubuly (pct), distálne stočené tubuly (dct) a glomeruly (g). Snímky boli následne spracované softvérom ImageJ (Rasband, WS, ImageJ, US National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA, https://imagej.nih.gov/ij/ (prístup 15. októbra 2018), 1997–2021. ) a Adobe Photoshop (Adobe Inc., San Jose, Kalifornia, USA) na ďalšie vyhodnotenie. Pred počítaním buniek sa použil nástroj ImageJ s rozdelenými kanálmi. Potom sa pôvodná imunofluorescenčná mikroskopická fotografia odčítala od červeného alebo zeleného kanála (v závislosti od pôvodného kanála) pomocou nástroja ImageJ na kalkuláciu obrazu, aby sa zabránilo úniku signálu. Hodnoty pod prahovou úrovňou 50 sa považovali za negatívne. Počítali sme imunoreaktívne signály v bunkách s najmenej 20 štruktúrami (pct, dct alebo g) na štádium alebo celkový pozitívny počet buniek na mikrofotografiu multicystickej dysplastikyobličkytkaniva, FSGS a CNF. Bunky sme klasifikovali ako pozitívne, ak sa imunofluorescenčný signál nahromadil na akejkoľvek úrovni membrány, cytoplazmy alebo jadra nad hodnotou 50 meranou na softvéri ImageJ pomocou príkazu prahu. Negatívne bunky boli kategorizované ako bunky s absenciou akejkoľvek imunoreaktivity. Údaje analyzovali dvaja nezávislí vyšetrovatelia.

4.6. Semikvantitatívna analýza

Intenzitu signálu -tubulínu, inverzie a DVL-1 farbenia hodnotili dvaja nezávislí výskumníci pomocou softvéru ImageJ. Celková intenzita signálu sa merala po nastavení obrazu v 8-bitovom type; potom sa intenzita zafarbenia markerov vyhodnotila v 20 pct, dct ag meraním vyznačenej oblasti štruktúry. Ak boli výsledky medzi hodnotiteľmi odlišné, tretí nezávislý výskumník objasnil pochybnosti. Maximálna intenzita signálu pre -tubulín bola 84,125 ± 3,214 SD, pre inverziu bola 71,50 ± 2,715 SD a pre DVL -1 80 0,916 ± 1,875 SD. Najvyššia sýtosť farby signálu na fotografiách mikroskopu bola označená ako 3 (66,66 – 99,99 percent celkovej intenzity obrazu signálu), nasledovala 2 (33,33 – 66,66 percent) pre strednú intenzitu signálu a 1 (0,33 percent – ​​33,33 percenta). pre nízku intenzitu signálu (tab. 1.).

4.7. Štatistická analýza

Na určenie rozdielov medzi štádiami a štruktúrami sa vykonal Kruskal-Wallisov test, po ktorom nasledoval Dunnov post hoc pomocou softvéru GraphPad Prism (Graphpad Software Inc., San Diego California, USA, www.graphpad.com (prístup 15. októbra 2018.)). Počet pozitívnych buniek bol vyjadrený v percentách ako stredná hodnota ± štandardná odchýlka (SD), zatiaľ čo štatistická významnosť bola potvrdená pri p < 0,05.="" počet="" analyzovaných="" štruktúr="" bol="" 4200="" v="" 35="" vzorkách,="" s="" celkovým="" počtom="" 135="" 256="" spočítaných="" buniek.="" použili="" sme="" 2-spôsob="" anova="" so="" sidakovým="" post="" hoc="" testom="" na="" testovanie="" rozdielov="" v="" expresii="" -tubulínu,="" inverzii="" a="" dvl-1="" v="" rôznych="" vývojových="" štádiách.="" na="" štúdium="" proteínovej="" expresie="" týkajúcej="" sa="" vývojového="" času="" sme="" použili="" lineárnu="" regresiu.="" jednosmerná="" anova="" nasledovaná="" tukeyho="" post="" hoc="" testom="" sa="" použila="" na="" preskúmanie="" rozdielov="" v="" expresii="" -tubulínu,="" inverzii="" a="" dvl-1="" u="">obličkytkaniva v porovnaní s tkanivami MCDK, FSGS a CNF. Rozdiely v expresii proteínov medzi MCDK, FSGS a CNF boli skúmané pomocou 2-way ANOVA, po ktorej nasledoval Sidakov post hoc test. Jednosmerná ANOVA nasledovaná Tukeyho post hoc testom sa použila na vyhodnotenie rozdielov v dĺžke mihalníc a výške epitelových buniek pct medzi zdravou kontrolou a patologickouobličkytkanív. Údaje boli uvedené ako priemerná hodnota ± štandardná odchýlka (SD) so štatistickým rozdielom potvrdeným pri p <>