Extrakcia fenyletanoidných glykozidov z Cistanche Tubulosa pomocou vysokorýchlostnej strihovej homogenizačnej extrakcie

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com

Wenjing Pei a Ruili Guo

Pozadie:

Cistanche tubulosaje známa tradičná čínska medicína pochádzajúca zo Sin-ťiangu. Je široko rozšírený v severnej Afrike, Indii atď. Cieľ: Hlavná bioaktívna zložkaC. tubulosasú fenyletanoidové glykozidy (PhGs). Echinakozid a akteozid sú indikatívne zložky na stanovenie PhG a používajú sa hlavne na ochranu pečene, imunitnú ochranu atď. Preto je veľmi dôležité extrahovať PhG z C. tubulosa. Metódy: V tejto štúdii boli porovnávané metódy extrakcie za pomoci ultrazvuku (UAE), extrakcie za pomoci mikrovlnnej rúry (MAE) a extrakcie s vysokorýchlostnou šmykovou homogenizáciou (HSHE). Ďalej boli optimalizované extrakčné podmienky metódy HSHE. Výsledky: Výsledky ukázali, že metóda HSHE bola lepšia ako metóda SAE aj MAE a optimálne extrakčné parametre HSHE boli koncentrácia etanolu 50 percent, teplota extrakcie 70 stupňov, rýchlosť otáčania 16 000 ot./min., doba extrakcie 2 minúty, pomer tuhá látka ku kvapaline 1:9 a jeden extrakčný cyklus. Výťažky echinakozidu a akteozidu boli 1,366 a 0,519 percenta a prenosové rýchlosti echinakozidu a akteozidu dosiahli 87 a 94 percent. Závery: Možno konštatovať, že metóda HSHE je jednoduchá, rýchla a účinná technika na extrakciu PhG z C. tubulosa. Hlavné body: Na extrakciu PhG z C. tubulosa bola preskúmaná účinná a ekologická metóda HSHE. Boli získané optimálne podmienky metódy HSHE na extrakciu PhG z C. tubulosa. Tento výskum poskytuje novú metódu priemyselnej extrakcie PhGs zC. tubulosa.

Cistanche tubulosa

Cistanche tubulosaje bežná tradičná čínska medicína, ktorá pochádza zo Sin-ťiangu. Je široko rozšírený v severnej Afrike, na Arabskom polostrove, v Pakistane a Indii a bol oficiálne zaznamenaný v Čínskom liekopise v roku 2010. Hlavná bioaktívna zložkaC. tubulosasú fenyletanoidové glykozidy (PhGs), trieda vo vode rozpustných prírodných produktov vrátane echinakozidu, akteozidu, izoakteozidu a 2-acetylakteozidu (1, 2). Štruktúra PhGs pozostáva z kyseliny škoricovej a hydroxyfenyletylových skupín, pričom obe sú pripojené k -glukopyranóze prostredníctvom esterových a glykozidických väzieb (3). Farmakologické štúdie ukázali, že PhGs C. tubulosa majú mnoho liečivých funkcií, ako sú protiúnavové (4), neuroprotektívne (5–7), pečeňové ochranné (8–10) a imunoprotektívne účinky (11). Efektívna extrakcia PhG z C. tubulosa má preto veľký význam pre vývoj a využitie prírodných produktov.

Súčasné tradičné metódy extrakcie PhG sú extrakcia za horúca, extrakcia za pomoci ultrazvuku (UAE) a extrakcia za pomoci mikrovlnnej rúry (MAE; 12–16). Tieto metódy majú rôzne nevýhody, ako je nízka účinnosť, dlhé časy extrakcie a vysoké náklady. V porovnaní s tradičnými metódami je metóda vysokorýchlostnej strihovej homogenizačnej extrakcie (HSHE) novovznikajúca metóda extrakcie a má výhody rýchlejších extrakčných časov, menšieho odpadu rozpúšťadla, vyšších výťažkov, jednoduchšieho zariadenia a jednoduchšej obsluhy (17). Princíp práce metódy HSHE je založený na rotujúcej vnútornej fréze poháňanej vysokootáčkovým motorom. Vnútorné a vonkajšie frézy vytvárajú veľkú strihovú silu, ktorá rozrušuje a mieša vzorky. Medzitým fréza s vysokorýchlostnou rotáciou spôsobuje tlakové rozdiely medzi vnútornou a vonkajšou dutinou frézy, čo vedie k prenosu hmoty medzi vzorkami a rozpúšťadlami. Kombináciou vysokej šmykovej sily, nárazovej sily, tlaku a iných síl možno rýchlo dosiahnuť rozpustnú rovnováhu medzi pevnými vzorkami a rozpúšťadlami (18). Proces extrakcie HSHE teda môže byť dokončený za niekoľko minút a dokonca tak rýchlo ako desiatky sekúnd (19–22).

Nedávno sa HSHE skúmala pri extrakcii bioaktívnych zložiek z rôznych prírodných produktov (23–25). Cheng a kol. použil HSHE na extrakciu piatich lignanov z ovocia Schisandra Chinensis (26). Výsledky ukázali, že optimálne podmienky boli koncentrácia etanolu 75 percent, doba extrakcie 1 minúta, pomer tuhej látky ku kvapaline 1:19, extrakčné napätie 180 V a častice vzorky veľkosť 120 ôk. Celkový výťažok piatich lignanov bol 13,89 ± 0,014 mg/g za optimalizovaných podmienok. Tang a kol. použili HSHE na získanie bioaktívneho oleja zo semien perily (27). Optimálne podmienky boli čas extrakcie 2 minúty, pomer pevnej látky ku kvapaline 1:10, extrakčné napätie 150 V a dva extrakčné cykly. Výťažnosť oleja zo semien perily dosiahla 59,3 percenta . Vyššie uvedené výsledky naznačujú, že HSHE má výhody krátkych extrakčných časov, nízkych nákladov a vysokých výťažkov. Existuje však nedostatok výskumu o extrakcii PhG pomocou HSHE.

V tejto štúdii sa HSHE použil na preskúmanie jeho potenciálnej aplikácie pri extrakcii PhG zC. tubulosa. Výťažok PhGs bol stanovený pomocou HPLC. Tri extrakčné metódy, HSHE, SAE a MAE, sa porovnávali za rovnakých podmienok. Skúmali sa účinky koncentrácie etanolu, extrakčnej teploty, rýchlosti rotácie, extrakčného času, pomeru tuhej látky ku kvapaline a počtu extrakčných cyklov na výťažok. Výhody a nevýhody tejto práce a referencií sú porovnávané a diskutované.

Materiály a metódy

Materiál a chemické činidlá

C. tubulosabol zakúpený od Xinjiang Congrongtang Biological Technology Co., Ltd (Xinjiang, Čína). Štandardy echinakozidu (čistota väčšia alebo rovná 98 percentám) a akteozidu (čistota väčšia alebo rovnajúca sa 98 percentám) boli zakúpené od spoločnosti Shanghai Standard Biological Technology Co., Ltd (Shanghai, Čína). Acetonitril, metanol a kyselina octová boli čistoty pre HPLC (Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ). Etanol analytickej kvality bol zakúpený od Tianjin Yongsheng Fine Chemical Co., Ltd (Tianjin, Čína). Počas experimentov bola použitá deionizovaná voda.

HPLC analýza

HPLC analýza sa uskutočnila na kvapalinovej chromatografii Waters e2695 (Waters, Milford, MA) vybavenej 2489 UV/Visible Detector a kolónou Symmetry C18 (Waters), 250 x 4,6 mm, veľkosť častíc 5 um. Koncentrácie echinakozidu a akteozidu sa analyzovali metódou HPLC. Mobilná fáza pozostávala z (1) acetonitrilu a (2) 2 % vodného roztoku ľadovej kyseliny octovej. Program gradientovej elúcie je uvedený v tabuľke 1.

Detegovaná vlnová dĺžka bola 330 nm, prietok bol 1 ml/min, vstrekovaný objem bol 10 ul a teplota pece bola nastavená na 30 stupňov. Chromatografický pík analytu bol potvrdený porovnaním jeho retenčného času s retenčným časom štandardov. Kvantifikácia sa uskutočňovala integráciou píku pomocou metódy externého štandardu.

Skúška presnosti sa uskutočnila vstreknutím rovnakých extrakčných vzoriek päťkrát. Pre test stability boli rovnaké vzorky analyzované v prírastkoch 0, 1, 2, 4, 12, 24 a 48 hodín. Testy výťažnosti echinakozidu a akteozidu sa uskutočnili pridaním štandardov do extrakčných vzoriek. Zaznamenali sa všetky plochy píkov a retenčné časy echinakozidu a akteozidu. Výsledky kalibračných kriviek pre echinakozid a akteozid sú uvedené v tabuľke 2.

Výpočet výnosu

Echinakozid a akteozid sa použili ako indikatívne zložky na stanovenie PhG. Výťažok echinakozidu alebo akteozidu sa vypočítal pomocou nasledujúcej rovnice:

Y=CV/Š×100 percent (1)

kde Y=výťažok echinakozidu alebo akteozidu ( percent ); C=koncentrácie echinakozidu alebo akteozidu (mg/ml); V=objem extrakčného roztoku (ml); a W=hmotnosť prášku C. tubulosa (mg).

Metódy extrakcie PhG

Stonky C. tubulosa sa najskôr pomleli na elektrickom mlynčeku (JC-500g; Yongkang Kaiyuan Industry & Trade Co., Ltd, Yongkang, Čína) a prefiltrovali sa cez filtračné sito (približne 380 μm). Potom sa prášok C. tubulosa sušil v sušiarni pri 70 stupňoch, kým nebola hmotnosť konštantná. Päť gramov prášku C. tubulosa sa zmiešalo s extrakčným rozpúšťadlom a umiestnilo sa do extrakčnej fľaše. Potom sa kvapalná zmes predhrievala (30–80 stupňov) počas 5 minút vo vodnom kúpeli s konštantnou teplotou (DF-101S; Jintan Analytical Instrument Co., Ltd, Jintan, Čína).

(a) Metóda HSHE. — HSHE bola vykonaná systémom FA25 (FLUKO Co., Ltd, Šanghaj, Čína), ktorý pozostával z rotujúceho rezača, vysokorýchlostného motora a ovládača. Rýchlosť otáčania vnútornej frézy bola regulovaná v rozsahu 10 000 – 28 000 ot./min. a časy extrakcie boli nastavené v rozsahu 2 – 15 min.

(b) Metóda SAE. – 5 gramov vysušenej vzorky a 300 ml metanolu sa presne odvážilo a pridalo do extrakčnej fľaše. Extrakčná fľaša bola ponorená do ultrazvukového kúpeľa a vykonávaná pri výkone ultrazvuku 300 W počas 10 minút. Teplota extrakcie bola nastavená na 30 stupňov.

(c) Metóda MAE. – 5 gramov vysušenej vzorky a 300 ml metanolu sa presne odvážilo a pridalo do extrakčnej fľaše. Extrakčná fľaša bola vložená do mikrovlnného reaktora a vykonávaná pri 180 W počas 10 minút. Teplota extrakcie bola nastavená na 30 stupňov.

Metóda HSHE bola porovnaná s metódami UAE a MAE s rovnakým extrakčným rozpúšťadlom, extrakčným časom, extrakčnou teplotou, pomerom tuhej látky ku kvapaline a číslom extrakčného cyklu. Extrakčný roztok sa prefiltroval cez 0 0,22 μm membránu a analyzoval sa pomocou HPLC na stanovenie koncentrácií echinakozidu a akteozidu. Všetky extrakčné procesy sa opakovali trikrát

Stanovenie transferových sadzieb

Na základe štandardnej metódy v 2015 China Pharmacopoeia sa stanovil obsah echinakozidu a akteozidu v prášku C. tubulosa (28). Jeden gram prášku C. tubulosa a 50 ml 50 % metanolu sa presne odvážili a pridali sa do 50 ml hnedej odmernej banky. Kvapalná zmes bola odvážená a namočená počas 30 minút. Potom bola hnedá odmerná banka ponorená do ultrazvukového kúpeľa a vykonávaná pri výkone ultrazvuku 250 W a frekvencii 35 kHz počas 40 minút. Kvapalná zmes sa znovu odvážila a pridalo sa 50 percent metanolu, aby sa dosiahlo množstvo rozpúšťadla. Extrakčný roztok sa prefiltroval cez 0,22 um membránu a analyzoval sa pomocou HPLC na stanovenie koncentrácií echinakozidu a akteozidu. Procesy extrakcie sa opakovali trikrát.

Rýchlosti prenosu echinakozidu alebo akteozidu sa vypočítali pomocou nasledujúcej rovnice:

X= M1/M2 × 100 percent (2)

kde X=rýchlosť prenosu echinakozidu alebo akteozidu ( percent ); M1=kvalita echinakozidu alebo akteozidu v extrakte (mg); a M2=kvalita echinakozidu alebo akteozidu v prášku C. tubulosa (mg).

Výsledky a diskusia

Validácia metódy HPLC

HPLC profily echinakozidu a akteozidu z C. tubulosa s použitím HSHE sú znázornené na obrázku 1. RSD plôch píkov echinakozidu a akteozidu boli 1,89 a 1,4 0 percent, v tomto poradí. Výsledky ukázali, že metóda HPLC má dobrú presnosť pri kvantitatívnej analýze echinakozidu a akteozidu. V rôznych časoch (0–48 h) boli RSD oblastí píkov echinakozidu a akteozidu 1,71 a 1,70 percent, čo naznačuje, že vzorka bola stabilná po 48 hodinách. Výťažnosť echinakozidu a akteozidu bola 99,3 a 99,1 percenta a ich RSD bola 0,70 a 0,67 percenta, čo potvrdilo spoľahlivosť metódy HPLC.

Porovnanie rôznych extrakčných metód

Uskutočnilo sa porovnanie metódy HSHE s metódami MAE a UAE, pokiaľ ide o výťažky echinakozidu a akteozidu, ktorého výsledky sú znázornené na obrázku 2. Zistilo sa, že výťažky echinakozidu a akteozidu získané pomocou HSHE boli vyššie ako získané zo strany MAE aj SAE. V porovnaní s MAE boli výťažky echinakozidu a akteozidu získané pomocou HSHE vyššie o 20,5 a 20,8 percent. A v porovnaní so Spojenými arabskými emirátmi boli výťažky echinakozidu a akteozidu získané pomocou HSHE vyššie o 6,6 a 7,4 percenta. Tieto výsledky naznačujú, že HSHE môže významne zvýšiť výťažky PhG.

Optimalizácia metódy HSHE

Medzi extrakčné parametre PhGs pomocou HSHE patrí koncentrácia etanolu, teplota extrakcie, rýchlosť rotácie, čas extrakcie, pomer tuhá látka ku kvapaline a počet extrakčných cyklov (26, 29).

Vplyv koncentrácie etanolu na extrakciu PhG

Koncentrácia etanolu je dôležitým faktorom, ktorý ovplyvňuje výťažky PhG. Ako je znázornené na obrázku 3, skúmali sa výťažky echinakozidu a akteozidu z C. tubulosa pri rôznych koncentráciách etanolu. Ukázalo sa, že výťažok echinakozidu sa zvýšil z 0 na 30 percent a potom sa znížil z 30 na 90 percent so zvyšujúcou sa koncentráciou etanolu. Výťažok akteozidu sa zvýšil z 0 na 70 percent a potom sa znížil zo 70 na 90 percent so zvyšujúcou sa koncentráciou etanolu. Keď bola koncentrácia etanolu 50 percent, súčet výťažkov echinakozidu a akteozidu bol na svojom maxime. Rôzne koncentrácie etanolu majú rôzne polarity, čo vedie k rôznym rozpustnostiam echinakozidu a akteozidu. Optimálna koncentrácia etanolu bola teda 50 percent.

Vplyv rýchlosti rotácie na extrakciu PhG

Obrázok 5 ukazuje účinky rôznych rýchlostí rotácie na výťažky PhG. Výťažky echinakozidu a akteozidu sa zvyšovali so zvyšujúcou sa rýchlosťou otáčania. Zvýšenie rýchlosti otáčania môže zvýšiť strihovú silu vnútornej a vonkajšej frézy, čím sa zvýši výťažok PhG. Optimálna rýchlosť otáčania bola 16 000 ot./min.

Vplyv doby extrakcie na extrakciu PhG

Výťažky echinakozidu a akteozidu pri rôznych časoch extrakcie sú znázornené na obrázku 6. Výťažky echinakozidu a akteozidu boli stabilné so zvyšujúcimi sa časmi extrakcie. Dá sa teda vyvodiť záver, že PhG je možné úplne extrahovať z C. tubulosa za 2 minúty a optimálny čas extrakcie bol 2 minúty.

Vplyv pomeru tuhej látky ku kvapaline na extrakciu PhG

Ako je znázornené na obrázku 7, diskutovali sa výťažky echinakozidu a akteozidu pri rôznych pomeroch pevnej látky ku kvapaline. Výťažky echinakozidu a akteozidu sa zvýšili z 1:3 na 1:9 a ustálili sa z 1:9 na 1:24. Pretože malé množstvo extrakčného rozpúšťadla nemôže úplne rozpustiť echinakozid a akteozid, rýchlosti prenosu hmoty sa znížili. Nadmerná extrakcia rozpúšťadiel spôsobila zbytočné plytvanie. Preto bol optimálny pomer pevnej látky ku kvapaline 1:9.

Vplyv počtu extrakčných cyklov na extrakciu PhG

Obrázok 8 ukazuje účinky množstva extrakčných cyklov na výťažky PhG. Výťažky echinakozidu a akteozidu sa zvyšovali so zvyšujúcim sa počtom extrakčných cyklov. Časy extrakcie sa však so zvyšujúcimi sa cyklami extrakcie výrazne predĺžili a spotrebovalo sa viac energie. Optimálny počet extrakčných cyklov bol jeden.

Porovnanie metódy HSHE s inými extrakčnými metódami na extrakciu PhG

Výsledky metódy HSHE v porovnaní s inými extrakčnými metódami na extrakciu PhG z C. tubulosa sú uvedené v tabuľke 3. HSHE je jednoduchšia a jednoduchšia ako spojovacie metódy, akými sú napríklad ultrazvukom asistovaná vodná dvojfázová extrakcia a technológia ultrazvukovej mikrovlnnej extrakcie. metódy. Okrem toho je extrakčný tlak HSHE nižší ako pri metóde extrakcie tlakovou kvapalinou a prevádzkové podmienky prvej metódy sú bezpečnejšie. Čo je dôležitejšie, z tabuľky 3 je možné vidieť, že HSHE vykazuje najkratší čas extrakcie a najmenšiu spotrebu rozpúšťadla spomedzi všetkých extrakčných metód. Možno konštatovať, že metóda HSHE má mnoho výhod, ako je vysoká účinnosť, mierne prevádzkové podmienky, nízka spotreba, jednoduché vybavenie a jednoduchá obsluha na extrakciu prírodných produktov.

Závery

V tejto štúdii bola skúmaná účinná a ekologická metóda HSHE na extrakciu PhG z C. tubulosa. V porovnaní s metódami SAE a MAE nová metóda HSHE produkuje vyšší výťažok PhG za rovnakých podmienok. V porovnaní s metódou MAE sa výťažky echinakozidu a akteozidu zvýšili o 20,5 a 20,8 percenta. A v porovnaní so SAE sa výťažky echinakozidu a akteozidu zvýšili o 6,6 a 7,4 percenta. Boli optimalizované extrakčné parametre HSHE PhGs z C. tubulosa. Pri optimalizovaných parametroch výťažky echinakozidu a akteozidu dosiahli 1,366 a 0,519 percenta a prenosové rýchlosti echinakozidu a akteozidu dosiahli 87 a 94 percent. Metóda HSHE má výhody vysokej účinnosti, miernych prevádzkových podmienok, nízkej spotreby, jednoduchého vybavenia, ľahkej obsluhy a nízkych nákladov. Tento výskum poskytuje novú metódu priemyselnej extrakcie PhG z C. tubulosa.