Inhibítor farnesyltransferázy LNK-754 zmierňuje axonálnu dystrofiu a znižuje amyloidovú patológiu u myší, časť 1

Abstraktné

Pozadie:

Ukladanie amyloidných plakov a axonálna degenerácia sú skorými javmi v patogenéze AD. A narušuje mikrotubuly v presynaptických dystrofických neuritoch, čo vedie k akumulácii poškodených endolyzozomálnych a autofagických organel transportujúcich enzým štiepiaci amyloidový prekurzorový proteín (BACE1). V dôsledku toho dystrofické neurity generujú A42 a významne prispievajú k ukladaniu plakov.

Axonálna degenerácia je neurologická porucha, ktorá spôsobuje poškodenie axónov neurónov, čím ovplyvňuje nervové vedenie. Imunita je dôležitou líniou obrany ľudského tela, aby odolala invázii cudzích baktérií a vírusov. Existuje teda vzťah medzi axonálnou degeneráciou a imunitou?

Po prvé, axonálna degenerácia nie je choroba spôsobená imunitným systémom, takže sa netreba obávať, že ju imunita negatívne ovplyvní. Hoci špecifická príčina axonálnej degenerácie nie je známa, niektoré štúdie naznačujú, že axonálna degenerácia môže súvisieť so zápalovými reakciami imunitného systému. Zápalová odpoveď je ochranný mechanizmus imunitného systému proti invázii cudzích patogénov. Ak je však nadmerne aktivovaný, spôsobí zápalové poškodenie neurónov a podporí degeneráciu axónov.

Po druhé, silný imunitný systém môže zlepšiť odolnosť tela a znížiť riziko infekcie a ochorenia, čo je obzvlášť dôležité pre pacientov s axonálnou degeneráciou. Keďže nervový systém pacientov s axonálnou degeneráciou bol poškodený, schopnosť tela samoopravy je relatívne slabá. Ak trpia inými chorobami, stav sa zhorší a ďalej ovplyvní kvalitu ich života. Preto udržiavanie zdravej výživy a životných návykov a posilnenie imunity môže pomôcť znížiť riziko iných ochorení. Zároveň môže zlepšiť imunitnú odpoveď organizmu a podporiť opravu axónov a obnovu nervového vedenia.

Stručne povedané, hoci medzi axonálnou degeneráciou a imunitou nie je potrebné spojenie, zdravý imunitný systém môže poskytnúť potrebnú ochranu a podporu pacientom s axonálnou degeneráciou. Preto by sme mali venovať pozornosť dôležitosti udržiavania imunitného systému, počnúc aspektmi, ako je strava a životné návyky, a aktívne zlepšovanie imunitnej úrovne tela, aby sa položil pevný základ pre zdravie a dlhovekosť. Je vidieť, že potrebujeme zlepšiť pamäť a Cistanche deserticola môže výrazne zlepšiť pamäť, pretože Cistanche deserticola je tradičný čínsky liečivý materiál, ktorý má mnoho jedinečných účinkov, jedným z nich je zlepšenie pamäte. Účinnosť mletého mäsa pochádza z rôznych aktívnych zložiek, ktoré obsahuje, vrátane kyselín, polysacharidov, flavonoidov atď. Tieto zložky môžu podporovať zdravie mozgu rôznymi spôsobmi.

Kliknite na spoznajte 10 spôsobov, ako zlepšiť pamäť

Inhibítory farnezyltransferázy (FTI) boli nedávno skúmané na premiestnenie smerom k liečbe neurodegeneratívnych porúch a blokovanie účinku farnezyltransferázy (FTázy) na katalyzovanie farnezylácie, posttranslačnej modifikácie, ktorá reguluje proteíny zapojené do funkcie lyzozómov a stability mikrotubulov. V postmortem AD mozgoch je FTáza a jej downstream signalizácia upregulovaná. Vplyv FTI na amyloidnú patológiu a dystrofické neurity však nie je známy.

Metódy:

Testovali sme účinky FTIR LNK-754 a lonafarnibu na myšom modeli 5XFAD amyloidnej patológie.

Výsledky:

U 2-mesačných myší 5XFAD liečených chronicky počas 3 mesiacov LNK-754 znížila záťaž amyloidnými plakmi a hyperfosforyláciu tau a zoslabila akumuláciu BACE1 a LAMP1 v dystrofických neuritoch. U 5-mesačných myší 5XFAD liečených akútne počas 3 týždňov LNK-754 znížila veľkosť dystrofických neuritov a akumuláciu LysoTracker-Green pri absencii účinkov na usadeniny A. Akútna liečba pomocou LNK{13}} zlepšila deficity pamäti a učenia u hAPP/PS1 amyloidných myší.

Na rozdiel od LNK-754 bola liečba lonafarnibom menej účinná pri redukcii plakov, hyperfosforylácie tau a dystrofických neuritov, čo mohlo byť výsledkom zníženej účinnosti proti FTáze v porovnaní s LNK-754. Skúmali sme účinky FTI na axonálny prenos endolyzozomálnych organel a zistili sme, že lonafarnib a LNK-754 zvýšili retrográdny axonálny transport v primárnych neurónoch, čo naznačuje, že FTI by mohli podporovať dozrievanie axonálnych neskorých endozómov na lyzozómy. Okrem toho liečba FTI zvýšila hladiny LAMP1 v myších primárnych neurónoch a mozgoch myší 5XFAD, čo dokazuje, že FTI stimulovali biogenézu endolyzozomálnych organel.

Závery:

Ukazujeme nové údaje, ktoré naznačujú, že LNK-754 podporoval axonálny prenos a funkciu endolyzozomálnych kompartmentov, o ktorých predpokladáme, že znížili axonálnu dystrofiu, znížili akumuláciu BACE1 a inhibovali ukladanie amyloidu u myší 5XFAD. Naše výsledky súhlasia s predchádzajúcou prácou identifikujúcou FTázu ako terapeutický cieľ na liečbu proteinopatií a mohli by mať dôležité terapeutické dôsledky pri liečbe AD.

Kľúčové slová:

Alzheimerova choroba, dystrofické neurity, inhibítory farnesyltransferázy.

Pozadie

Alzheimerova choroba (AD) je progresívne neurodegeneratívne ochorenie, ktoré je najčastejšou príčinou demencie u starnúcej populácie a je charakterizované výrazným zhoršením učenia a pamäti. Na molekulárnej úrovni sú charakteristickými znakmi mozgu AD hromadenie amyloidných (A) plakov a prítomnosť hyperfosforylovaných tau inklúzií.

V skorých asymptomatických štádiách AD sa A hromadí v mozgu viac ako dve desaťročia alebo dlhšie pred nástupom poruchy pamäti [1–3]. V dôsledku toho bolo zníženie hladín A v mozgu ústredným cieľom liečebných stratégií pre AD [4]. V súčasnosti je jedinou terapiou modifikujúcou ochorenie podmienečne schválenou FDA protilátka anti-A, ktorá odstraňuje agregované formy A z mozgu [5], čo potvrdzuje, že zacielenie A v mozgu je sľubným prístupom k liečbe AD.

Väčšina klinických štúdií zameraných na A však zlyhala z dôvodu obáv o bezpečnosti alebo účinnosti a dôraz sa teraz kládol na ciele založené na rôznych hypotézach AD, vrátane propagácie tau, zápalu, kalciovej dyshomeostázy a neurovaskulárnych faktorov [4, 6, 7 ]. Okrem toho rastie záujem o terapeutický potenciál aktivácie lyzozomálnych degradačných dráh ako metódy na redukciu patogénnych proteínov, čo je črta spoločná pri neurodegeneratívnych ochoreniach [8–12].

Rozsiahla dysfunkcia endolyzozomálnych a autofagických dráh je dobre zdokumentovaná ako skorá udalosť patogenézy AD. Mnohé genetické lokusy náchylnosti na AD sú spojené so subcelulárnym endolyzozomálnym transportom a funkciou lyzozómov [13] a zväčšené dysfunkčné endolyzozomálne a autofagické organely sa hromadia v mozgu AD v rámci dystrofických neuritov [14, 15].

Zdá sa, že dystrofické neurity sú iniciované po poškodení neurónov a pri AD sa predpokladá, že ide o destabilizáciu mikrotubulov prostredníctvom A [16]. To má za následok fokálne axonálne opuchy, ktoré narúšajú normálne dráhy prenosu a degradácie kľúčových proteínov zapojených do produkcie A, vrátane BACE1 [16, 17]. Výsledkom je, že dystrofie generujú A 42 a významne prispievajú k ukladaniu extracelulárnych plakov a axonálnej dystrofii [18], čím spúšťajú doprednú dráhu vedúcu k synaptickej strate, neurodegenerácii a kognitívnym deficitom [16].

Terapeutické stratégie, ktoré zlepšujú transport a aktivitu endolyzozomálnych a autofagických organel, by mohli zabrániť neuritickej dystrofii udržať degradáciu patogénnych proteínov a byť kritickým mechanizmom na zníženie hladín BACE1 a A pri AD.

S pokračujúcim hľadaním účinnej liečby AD sa počet liekov s novým účelom v klinických štúdiách na AD podstatne zvýšil, pretože klinicky hodnotené lieky majú známe problémy s bezpečnosťou a účinnosťou, čím sa urýchli proces vývoja liekov [7, 19]. V posledných rokoch štúdie identifikovali FTI ako triedu liekov s potenciálom na opätovné použitie na liečbu neurodegeneratívnych ochorení.

FTI inhibujú farnezyláciu, posttranslačnú modifikáciu, ktorá reguluje proteíny, v ktorých je farnezylpyrofosfát kovalentne modifikovaný na cysteínové zvyšky v proteínoch, ktoré obsahujú motív CAAX [20]. FTI boli pôvodne navrhnuté tak, aby blokovali onkogénnu aktivitu Ras inhibíciou jeho prenylácie, ale boli prerušené v klinických štúdiách na liečbu rakoviny po objavení alternatívnych dráh prenylácie Ras [21, 22].

Existuje však veľa substrátov FTázy [23–25], čo vedie k hodnoteniu FTI pre širokú škálu porúch vrátane kardiovaskulárnych ochorení, hepatitídy D a progérie [20, 26]. Okrem toho sa FTI ukázali ako sľubné voči neurodegeneratívnym ochoreniam charakterizovaným akumuláciou proteínových agregátov. V modeloch proteinopatií na hlodavcoch a bunkových kultúrach indukujú FTI lyzozomálnu aktivitu a proteolýzu toxických proteínov špecifických pre ochorenie [8, 9, 27, 28].\

V minulosti sme ukázali, že LNK-754, FTI testovaný v štúdiách rakoviny, zosilnil prenos lyzozomálnej hydrolázy a znížil agregáty alfa-synukleínu (-synukleínu) v neurónoch pochádzajúcich od pacienta s Parkinsonovou chorobou (PD) a na modeloch myší s PD [8 ].

Iné štúdie uvádzajú podobné výsledky FTI smerom k redukcii proteínových agregátov; liečba modelov bunkovej kultúry PD pomocou FTI-277 redukovaného synukleínu [28] a lonafarnibu, FTI schválenej FTI na liečbu progérie [29], zvýšenej lyzozomálnej aktivity a znížených inklúzií tau v myšom modeli tauopatie [ 9]. Okrem toho nedávna štúdia ukázala, že genetický knockout neurónovej FTázy v myšom modeli AD APP/PS1 zabráni generácii A [30]. Ťažiskom predchádzajúcich štúdií hodnotiacich FTI pre proteinopatie bola úloha substrátov FTázy v lyzozómovej aktivite a autofágii.

Je však tiež známe, že FTI podporujú stabilitu mikrotubulov (MT) a synergizujú s liekmi stabilizujúcimi MT na zvýšenie acetylácie tubulínu prostredníctvom dráhy nezávislej od Ras [31–33]. Stabilizácia MT inhibuje patológiu AD u myší APP/PS1 [34] av súčasnosti sa klinicky skúma niekoľko činidiel stabilizujúcich MT na liečbu AD [35]. Podstatné dôkazy teda naznačujú, že FTI môžu byť prospešné pre choroby charakterizované dysfunkčnými mechanizmami homeostázy proteínov, ako je AD. Ciele a dráhy, ktoré spájajú proteínovú farnezyláciu so zníženými proteínovými agregátmi pri neurodegeneratívnych ochoreniach, však nie sú úplne pochopené.

V tejto štúdii sme hodnotili, či farmakologická liečba FTI môže zlepšiť patológiu AD spojenú s A. Hodnotili sme účinky LNK-754 a lonafarnibu, dvoch FTI, o ktorých je známe, že redukujú proteínové agregáty pri neurodegeneratívnych poruchách, na plakovú záťaž a dystrofické neurity na myšom modeli 5XFAD amyloidnej patológie. Naše výsledky poskytujú pohľad na dráhy ovplyvnené inhibíciou FTázy a silne podporujú ďalšie skúmanie opätovného použitia FTI ako terapeutika pre AD a iné neurodegeneratívne ochorenia charakterizované hromadením agregácie proteínov.

Materiály a metódy

Zvieratá a liečba drogami

Všetka práca na zvieratách bola vykonaná na základe schválenia Inštitucionálnym výborom pre starostlivosť o zvieratá a používanie zvierat (IACUC) Northwestern University. Myši boli kŕmené štandardnou stravou pre hlodavce a vodou ad libitum a boli umiestnené so štandardným 12-hodinovým cyklom svetlo/tma. Myši 5XFAD na pozadí C57BL6 (Jackson Laboratories) sa udržiavali krížením transgén-pozitívnych hemizygotných samcov myší C57BL6 s transgénne negatívnymi samicami myší C57BL6 (Jackson Laboratories).

V našom protokole chronickej liečby sa medikamentózna liečba začala vo veku 2 mesiacov, čo je vek, v ktorom sa začína ukladanie plakov [36, 37]. V protokole akútnej liečby sa medikamentózna liečba začala vo veku 5 mesiacov, po ktorom je rozšírené ukladanie plakov a axonálna degenerácia [38, 39].

LNK{{0}} bol syntetizovaný spoločnosťou Link Medicine (Massachusetts USA) a lonafarnib bol získaný od Cayman Chemical Company (Ann Harbor, MI). Na liečbu zvierat sa LNK-745 a lonafarnib pripravili v zahriatom roztoku 0,5 % karboxymetylcelulózy (Sigma-Aldrich) ako vehikula v koncentrácii 0,10 mg/ml, kým sa nerozpustili a roztok sa jasný.

Alikvóty na injekciu boli zmrazené pri -20 stupňoch a potom rozmrazené a skladované pri 4 stupňoch na každý týždeň liečby. Myši boli liečené podľa zavedeného protokolu, o ktorom je známe, že zvyšuje aktivitu lyzozómov [8]. V protokole chronickej liečby sa 2-mesačným myšiam 5XFAD injekčne podávali intraperitoneálnou (ip) injekciou buď vehikulum, LNK754 alebo lonafarnib denne pomocou 29-inzulínovej striekačky počas 12 týždňov, kým myši nedosiahli 5 rokov mesiacov staré. V režime akútnej liečby sa 5-mesačným myšiam 5XFAD podávali injekcie denne počas 3 týždňov.

Po dokončení liečby boli myši anestetizované a perfundované a mozgy boli odobraté na ďalšie analýzy (pozri časti nižšie). Pre experimenty s bunkovou kultúrou sa LNK{0}} a lonafarnib rozpustili v DMSO a pridali sa do kultúr myších primárnych neurónov v koncentrácii 10 nM počas 48 hodín. Spracovanie vehikulom bolo ekvivalentné množstvo DMSO. Bunky sa zhromaždili a analyzovali, ako je opísané nižšie.

Protilátky

Protilátky použité na imunofluorescenčné experimenty boli potkanie anti-LAMP1 (#1D4B, DSHB), králičie anti-A 42 (#700254, Invitrogen), králičie anti-BACE1 (#ab108394, Abcam), králičie anti-III tubulín (#ab18207, Abcam). Na imunobloting boli použité protilátky králičie anti-aktín (#926–42,210, LI-COR), králičie antip44/42 MAPK (pErk1/2) (#CS9101, Cell Signaling Technology), králičie anti-44/42 (Erk1/2) (#CS137F5, Cell Signaling Technology), králičie anti-LAMP1 (#CS3234, Cell Signaling Technology), myšie anti-BACE (3D5; Zhao et al., 2007), myšie anti-APP (6E10) ( #803001, BioLegend), králičie anti-p-tau (ser404) (#CS20194, Cell Signaling Technology), myšie anti-Tau1 (#MAB3420, Millipore Sigma), prelamin-A, (#MABPT858, Millipore Sigma) a myšie anti -HDJ-2 (#sc{50}},554, Santa Cruz). Na imunobloty sa použili anti-králičie alebo myšie sekundárne protilátky od Vector Laboratories.

Behaviorálne testovanie

Zvieratá a liečba drogami

Behaviorálne analýzy vykonala spoločnosť reMYND, Inc. s použitím myšacieho modelu hAPP/PS1 s neurónovo špecifickou expresiou klinického mutantu ľudského amyloidového prekurzorového proteínu spolu s klinickým mutantom ľudského presenilínu 1 [40]. Táto dvojito transgénna myš vykazuje spontánnu, progresívnu akumuláciu A v mozgu, čo nakoniec vedie k amyloidným plakom v subikule, hipokampe a kortexe vo veku 6 mesiacov. Na túto štúdiu sa použilo 48 samíc myší hAPP/PS1 na pozadí FVB x C57Bl/6J vo veku 6 mesiacov v kombinácii s 12 vekovo zodpovedajúcimi samicami divokého typu kontrol na pozadí FVB x C57Bl/6J. Podávanie 0,9 mg/kg/deň LNK-754 sa uskutočnilo perorálnou sondou raz denne počas 12 po sebe nasledujúcich dní. Usmrtenie zvierat sa uskutočnilo 2 hodiny po konečnom dávkovaní.

Všetky myši boli genotypizované pomocou polymerázovej reťazovej reakcie (PCR) vo veku 3 týždňov a dostali jedinečné identifikačné číslo, keď boli známe výsledky PCR. Všetky myši boli pred začiatkom štúdie dvakrát skontrolované druhou PCR. Všetky myši boli randomizované naslepo a vekovo zodpovedajúce. Myšiam bolo počítačom pridelené náhodné číslo a náhodne pridelené liečbe. Zvieratá boli 15 dní pred začiatkom štúdie znovu umiestené do klietok liečebnou skupinou, aby sa im umožnilo zoznámiť sa s kontextom novej klietky. Myši mali voľný prístup k vopred prefiltrovanej a sterilnej vode a štandardnému krmivu pre myši (Snif® Ms-H, Snif Spezialdiäten GmbH, Soest, Nemecko). Potraviny sa skladovali v suchých a chladných podmienkach v dobre vetranej skladovacej miestnosti. Množstvo vody a jedla bolo denne kontrolované, dodávané v prípade potreby a štandardne dopĺňané raz týždenne. Myši boli spočiatku umiestnené v obrátenom rytme deň-noc (14 hodín svetlo/10 hodín tma) so začiatkom o 19:00 v štandardných kovových klietkach typu RVS T2 (plocha 540 cm2).

Klietky sú vybavené pevnými podlahami a vrstvami podstielky. Počet myší na klietku bol obmedzený miestnou legislatívou o dobrých životných podmienkach zvierat. 15 dní pred začiatkom liečby boli myši znovu umiestnené do individuálnych ventilovaných makrolonových T2 klietok a transportované do laboratória na aklimatizáciu na laboratórne prostredie v rámci prípravy na liečbu. V laboratóriu sa zmenil rytmus deň-noc na 12 hodín svetlo/12 hodín tma so začiatkom o 19.00 hod.

Morrisovo vodné bludisko

Morrisovo vodné bludisko sa uskutočnilo v dňoch 8 až 12 liečby a zvieratá sa usmrtili priamo po teste sondy. Bazén (biela kruhová nádoba s priemerom 1 m) obsahovala vodu s teplotou 20 stupňov s oxidom titaničitým ako netoxickou prísadou bez zápachu na zakrytie únikovej plošiny (1 cm pod hladinou vody). Plávanie každej myši bolo zaznamenané na video a analyzované (Ethovision, Noldus Information Technology, Wageningen, Holandsko). Pred tréningom bola každá myš umiestnená na vrch platformy na 15 sekúnd. Pre testy navigácie na mieste boli myši trénované na nájdenie skrytej platformy v siedmich blokoch troch pokusov počas štyroch po sebe nasledujúcich dní.

Každá skúška pozostáva z testu núteného plávania v dĺžke maximálne 120 sekúnd, po ktorom nasleduje 10 minút odpočinku. Meral sa čas, ktorý každá myš potrebovala na lokalizáciu platformy. Výsledkom siedmich po sebe nasledujúcich blokov je krivka učenia. 24 hodín po poslednom tréningu malo každé zviera testovanú sondu s odstránenou platformou. Myši sa nechali hľadať 60 sekúnd a meral sa kvadrantový čas hľadania a prekročenia pôvodnej polohy plošiny. Počas posledného testu sondy sa myšiam umožnilo hľadať predchádzajúce umiestnenie platformy počas 60 sekúnd po odstránení platformy.

Primárna neurónová kultúra

Predné mozgy sa pitvali v Hanksovom vyváženom soľnom roztoku (HBSS) (Thermo Fisher #14185–052) gravidným divokým myšiam C57BL6 (Jackson) na E15.5, aby sa získali primárne neuróny. Vypreparované predné mozgy sa trávili v 2,5 % trypsíne pri 37 stupňoch počas 20 minút. Na disociáciu neurónov v HBSS sa použila ohňom leštená Pasteurova pipeta. Neuróny sa potom umiestnili na šesťjamkovú platňu potiahnutú poly-L-lyzínom, 2 x 106 neurónov na jamku v neurobazálnom médiu doplnenom 2 % B-27, 500 uM glutamínom, 10 % konským sérom a 2,5 uM glutamát (všetko od Thermo Fisher).

Médium sa o 2 hodiny neskôr vymenilo za Neurobasal s 2 % B-27, 500 uM glutamínu a 2,5 uM glutamátu. O 24 hodín neskôr sa médium vymenilo za Neurobasal plus 2 % B-27 a 500 uM glutamínu. Polovičné zmeny médií sa robili každé 2 až 3 dni. Primárne neuróny boli kultivované počas 7 dní a ošetrené vehikulom (DMSO) alebo 10 nM koncentráciami LNK-754 alebo lonafarnibom počas 48 hodín. Neuróny boli potom fixované alebo zobrazené naživo, ako je opísané nižšie.

Na fixáciu boli neuróny inkubované počas 20 minút v 4% paraformaldehyde, 0,12M sacharóze v 1XPBS, permeabilizované v 0,5% Triton X-100 a inkubované s primárnymi protilátkami cez noc a následne oslie anti-myšie sekundárne protilátky konjugované s Alexafuorom (Molecular Probes, 1:1000) a spoločne farbené s 300 nM DAPI. Krycie sklíčka boli pripevnené pomocou Prolong Gold (Molecular Probes) a snímky boli získané na konfokálnom mikroskope Nikon A1 s objektívom 60X (NA 1.4) a softvérom NIS Elements.

Živé zobrazovanie neurónov

Na experimenty so živým zobrazovaním sa neuróny pripravili ako je uvedené vyššie a naniesli sa na misky so skleneným dnom s priemerom 35 mm (MatTek # P35G-1.5-14C) počas 7 dní v kultúre. 10 nM LNK-754 alebo lonafarnib sa potom pridal do upraveného média, kontrolné kultúry sa ošetrili DMSO ako vehikulom. Po 48 hodinách pôsobenia sa médium nahradilo upraveným médiom z neošetrených paralelných platní neurónov. Do upraveného média sa pridalo 25 nM LysoTracker-Green DND-26 (č. L7526, Invitrogen) a neuróny sa inkubovali 30 minút pri 37 stupňoch.

Časozberné zobrazovanie neurónov sa uskutočnilo pomocou mikroskopu so širokým poľom Ti2. Zobrazovanie začalo okamžite po 30 minútach a nepokračovalo dlhšie ako 30 minút. Expozície 1-s sa robili každú minútu a 20 až 30 samostatných oblastí na misku sa zobrazilo v priebehu 30 minút. Kvantifikácia vzdialenosti a rýchlosti častíc LysoTracker a analýzy kymografu sa uskutočňovali pomocou softvéru NIS Elements a sú podrobne opísané nižšie. V samostatných experimentoch sa do upraveného média pridal 1μM Lysosensor-Green DND{10}} (#L7535, Invitrogen) a zachytené snímky živých neurónov sa robili nie dlhšie ako 15 minút pomocou konfokálneho mikroskopu Nikon A1 s objektívom 60X (NA 1.4) a softvér NIS Elements.

For more information:1950477648nn@gmail.com