Flavonoidy ako sľubné antivirotiká proti infekcii SARS-CoV-2: Mechanistický prehľad

Pre viac info. kontakttina.xiang@wecistanche.com

Abstraktné: Novo diagnostikovaný koronavírus v roku 2019(COVID-19) ovplyvnilo všetky ľudské aktivity od svojho objavenia.Flavonoidybežne sa vyskytujúce v ľudskej strave priťahujú veľkú pozornosť vďaka svojim pozoruhodným biologickým aktivitám. Táto práca poskytuje komplexný prehľad o výhodách flavonoidov pri ochorení COVID{0}}. Predtým hlásené účinky flavonoidov na päť RNA vírusov s podobnými klinickými prejavmi a/alebo farmakologickou liečbou, vrátane chrípky, vírusu ľudskej imunodeficiencie (HIV), závažného akútneho respiračného syndrómu (SARS), respiračného syndrómu na Blízkom východe (MERS) a eboly, boli zvážiť. Flavonoidy pôsobia priamoantivírusovévlastnosti, kde inhibujú rôzne štádiá vírusového infekčného cyklu a nepriame účinky, keď modulujú odpovede hostiteľa na vírusovú infekciu a následné komplikácie. Flavonoidy preukázali antivírusovú aktivitu prostredníctvom inhibície vírusovej proteázy, RNA polymerázy, mRNA, replikácie vírusu a infekčnosti. Zlúčeniny boli tiež účinné pri regulácii interferónov, prozápalových cytokínov a subcelulárnych zápalových dráh, ako sú nukleárny faktor-kB a Jun N-terminálne kinázy. Baicalin,kvercetín, a jeho deriváty, hesperidín a katechíny sú v tomto smere najviac študovanými flavonoidmi. Na záver možno povedať, že flavonoidy v strave sú sľubnými možnosťami liečby infekcie COVID{0}}; avšak budúce výskumy sa odporúčajú na posúdenie antivírusových vlastností týchto zlúčenín na túto chorobu.

Kľúčové slová: zápal;pľúca; oxidačné poškodenie; antivírusové; polyfenol

Kliknutím sem sa dozviete viac produktov

1. Úvod

Do konca roka 2019 bol z Číny hlásený nezvyčajný zápal pľúc, ktorý bol ďalej diagnostikovaný ako nový koronavírus (CoV) spôsobujúci závažný akútny respiračný syndróm (SARS) a nazývaný COVID{1}}[1,2]. Neskôr sa vírus (SARS-CoV-2) rozšíril do ďalších krajín a WHO ho 11. marca 2020 vyhlásila za pandémiu [3]. Thevírussa prenáša väčšinou respiračnými kvapôčkami a závažnosť sa pohybuje od miernych až po ťažké smrteľné symptómy. Asymptomatické prípady v inkubačnej dobe sa považujú za dôležitý zdroj nákazy [4]. Vo väčšine prípadov trvá zmiernenie miernych symptómov 1-2 týždňov, zatiaľ čo závažné prípady môžu viesť k smrti [5].

SARS-CoV-2 postihuje dýchací systém, spôsobuje horúčku a suchý kašeľ [4]; vírus však môže spôsobiť zlyhanie orgánov, najmä v srdci a obličkách, ako aj spôsobiť búrky cytokínov, ktoré ďalej zvyšujú úmrtnosť. Vírusový životný cyklus SARS-CoV-2 zahŕňa

prichytenie, penetrácia, biosyntéza, zrenie a uvoľnenie. Po pripojení vírusová RNA vstúpi do bunkového jadra na replikáciu a vírusová mRNA začne generovať vírusové štrukturálne proteíny, vrátane spike (S), membrány (M), obalu (E) a nukleokapsidových (N) proteínov [6]. Receptor angiotenzín konvertujúceho enzýmu 2 (ACE2), ktorý je vysoko exprimovaný v pľúcach, sa tiež ukázal ako koreceptor pre SARS-CoV [7].

SARS, MERS a SARS-CoV-2 sú všetky RNA CoV. Genóm SARS-CoV-2 je na 88 percent identický so závažnými akútnymi respiračnými syndrómami podobnými SARS (SARS) pochádzajúcich z netopierov, na 79 percent podobný SARS-CoV a na 50 percent podobný MERS-CoV [8,9]. SARS-CoV-2 proteíny sú na 90 percent -100 percent homológne so SARS-CoV; hoci orf10 a orf8 sa medzi SARS-CoV-2 a SARS-CoV líšia. Orf8 je doplnkový proteín pre CoV. Tvorí šesťvláknový proteín alfa helixu, ktorý zvyšuje schopnosť vírusu šíriť sa. SARS-CoV-2 orfla/b, hrot, obal, membrána a nukleoproteín tiež úzko súvisia so SARS-CoV [10] .

Keďže neexistuje žiadne špecifické antivírusové činidlo proti SARS-CoV-2, na liečbu COVID-19 sa zvažujú v súčasnosti dostupné antivírusové lieky. Remdesivir je nové antivírusové liečivo špecificky zavedené proti vírusu Ebola v roku 2015. Má inhibičný účinok na vírusovú RNA polymerázu a nedávno sa použilo v niektorých štúdiách na liečbu COVID-19 [11]. Favipiravir má inhibičný účinok na chrípku a vírus Ebola s rovnakým mechanizmom a hodnotí sa aj pri SARS-CoV-2 [12-14]. Lopinavir je inhibítor vírusovej proteázy a bol prvýkrát vyvinutý na liečbu HV. Štúdie in vitro ukázali inhibičný účinok lopinaviru na bunky infikované CoV [15,16]; systematické prehľady však nepreukázali žiadny priaznivý účinok proti SARS-CoV-2 [17].

Liečivé rastliny sú už od staroveku spoľahlivým zdrojom prírodných liečiv, vrátane antivírusových látok. Tradičná medicína a etnofarmakologické štúdie rôznych krajín po celom svete vždy otvárali nové cesty pre objavovanie liekov [18-22]. Oseltamivir, ktorý je konvenčným antivírusovým činidlom, je derivát kyseliny šikimovej, sekundárneho metabolitu badiánu (Illicium verum Hook.f.). V prípade SARS-CoV-2 štúdie in silico odhalili možné antivírusové vlastnosti rastlinných zložiek [23-25]. Flavonoidy sú veľkou triedou fytochemikálií, ktoré sa bežne vyskytujú v niekoľkých potravinách a zelenine v ľudskej strave s mnohými cennými farmakologickými aktivitami, vrátane antivírusových vlastností. Preukázalo sa, že tieto zlúčeniny môžu inhibovať vírusovú patogenézu zacielením na základné štádiá životného cyklu vírusu [26]. Kvercetín, katechíny, kempferol a baicaleín sú príklady najdôležitejších flavonoidov s antivírusovými vlastnosťami [18,27,28]. Cieľom tejto štúdie je prediskutovať dostupné antivírusové dôkazy o flavonoidoch ako možnej liečbe SARS-CoV-2 vzhľadom na predtým hlásené účinky týchto zlúčenín na päť RNA vírusov s podobnými klinickými prejavmi a/alebo farmakologickou liečbou vrátane chrípky, vírus ľudskej imunodeficiencie (HIV), závažný akútny respiračný syndróm (SARS), respiračný syndróm na Blízkom východe (MERS) a ebola.

2. Výsledky

Antivírusová aktivitaflavonoidov možno kategorizovať na priame antivírusové účinky, kde je vírus priamo ovplyvnený flavonoidom, a nepriame účinky, kde flavonoid zlepšuje obranné mechanizmy hostiteľa proti vírusovej infekcii. Tu sú diskutované základné antivírusové mechanizmy flavonoidov s odkazom na najdôležitejšie flavonoidy demonštrujúce tieto mechanizmy.

2.1.Priame antivírusové mechanizmy

2.1.1. Inhibícia vírusovej proteázy

Vírusové proteázy sa používajú na štiepenie vírusových polyproteínových prekurzorov na určitých miestach, aby sa uvoľnili funkčné proteíny. Ukázalo sa tiež, že špecifické vírusové proteázy štiepia proteíny hostiteľskej bunky, vrátane iniciačných faktorov translácie (eF4 a elF3d) v HIV, aby zabránili translácii hostiteľského proteínu [29,30]. Koronavírusy generujú tri typy vírusových proteáz, vrátane 3-cysteínu podobného chymotrypsínu (3CLpro), proteázy podobnej papaínu (PLpro) a hlavnej proteázy (M pro)[31]. 3CLpro je dôležitý pre život SARS-CoV cyklu, PLpro hrá úlohu pri replikácii SARS-CoV-2 a Mopar je zodpovedný za dozrievanie funkčných proteínov v SARS-CoV-2 [32,33]. V dôsledku toho sú tieto molekuly vhodnými cieľmi liekov v antivírusovom výskume a objavovaní liekov [34].

Kaempferol, ktorý je hojným flavonoidom v niekoľkých potravinách, znížil CPE v bunkách Vero E6 infikovaných klinickými izolátmi SARS-CoV-2 s približne 88-percentnou inhibíciou pri koncentrácii 125 μM. Vyšetrenie spojené in silico naznačuje, že hlavným mechanizmom účinku je inhibícia enzýmu SARS-CoV-2 3CLpro [35]. Pridanie kaempferolu k 3CLpro a PLpro SARS-CoV a MERS-CoV exprimovaným v E. coli spôsobilo antivírusové účinky prostredníctvom inhibície týchto enzýmov [36]. Park a spolupracovníci (20}17) ukázali, že prítomnosť hydroxylovej skupiny v kempferole spôsobuje silnejšiu antivírusovú aktivitu prostredníctvom inhibície 3CLpro a PLpro [37]. Epigalokatechín galát (EGCG) je flavonoid nachádzajúci sa v čaji (Camellia sinensis L.) s protiplesňovými, antibakteriálnymi a antivírusovými vlastnosťami [38.39]. Štúdie ukázali, že EGCG inhibuje aktivitu reverznej transkriptázy (RT), aktivitu proteázy, p24, vstup vírusu a produkciu vírusu v THP-1 a H9 bunkách infikovaných HIV-1 a lipozómová modifikácia EGCG zosilnila jeho inhibičnú aktivitu účinky. Štúdie bez buniek tiež ukázali významné zníženie kinetiky proteázy po liečbe EGCG. Galloylová skupina v EGCG sa považuje za zodpovednú za jeho antibakteriálne a antivírusové aktivity [40]. Isoliquiritigenín, chalkón, sa môže použiť ako terapeutické činidlo pri bakteriálnych a vírusových infekciách [41]. Táto zlúčenina preukázala inhibičný účinok na SARS-CoV a MERS-CoV 3CLpro a PLpro exprimované v E. coli. Prítomnosť prenylovej funkčnej skupiny na rezorcinolovom kruhu umožňuje tvorbu hydrofóbnych interakcií s proteázami [37]. Theaflavíny sú polyfenoly nachádzajúce sa v rôznych druhoch čaju [42]. Experimenty na rekombinantnej proteáze SARS-CoV ukázali významné zníženie aktivity 3CLpro po liečbe theaflavín-3,3'-digalátom s hodnotou IC50 9,5 uM. Galátová skupina pripojená k polohe 3' v niektorých theaflavínoch môže byť nevyhnutná pre interakciu s proaktívnym miestom 3CL [43]. Prenylisoflavonoidy extrahované z Erythrina senegalensis DC. sa použili na vyhodnotenie anti-proteázovej aktivity proti rekombinantnej HIV-1 proteáze. Výsledky ukázali, že zlúčeniny môžu inhibovať HIV-1 rekombinantnú proteázu in vitro s hodnotami 0,5 až 30 μMIC50. Hydroxy a prenylové skupiny môžu byť zodpovedné za inhibíciu HIV proteázy [44]. Kvercetín a kvercetín- -galaktozid znížili aktivitu PLpro, 3CLpro, deubikvitináciu a DelSGyláciu pri SARS-CoV, MERS-CoV a HIV-1. Poloha hydroxylových skupín môže byť účinná pri antiproteázovej aktivite. Kvercetín s piatimi hydroxylovými skupinami v polohách 3, 5, 7, 3' a 4' vykazoval silný inhibičný účinok na vírusové proteázy; zatiaľ čo prítomnosť glykozylovej skupiny v pozíciách 3,7A' znížila inhibičný účinok [37,45].

2.1.2. Inhibícia vírusovej RNA polymerázy a vírusovej mRNA

RNA-dependentná RNA polymeráza (RdRp) je dôležitý enzým katalyzujúci replikáciu RNA zo sekvencie RNA [46]. Tento enzým je kódovaný vo všetkých RNA vírusoch, ako aj v niektorých eukaryotoch [47]. Vírusy sú povinné intracelulárne parazity, tj nemôžu nezávisle prežiť mimo buniek. Musia použiť bunkové translačné zariadenie na preklad mRNA na produkciu proteínov, ktorá je potrebná na replikáciu. Akákoľvek interferencia s transláciou mRNA by teda inhibovala replikáciu, šírenie a evolúciu vírusu [48].

Nedávny výskum Zandi a kol. odhalili in vitro antivírusový účinok baicalínu a baicaleínu proti infekcii SARS-CoV-2 v bunkovej línii Vero CCL-81 prostredníctvom inhibície RdRp, s vyššou účinnosťou pomocou baicaleínu. Ďalšie hodnotenia in silico ukázali, že tieto dve zlúčeniny majú vyššiu afinitu k RdRp v porovnaní s opätovným podávaním: Miesto pripojenia baicalínu a baicaleínu sa tiež zdá byť odlišné od miesta pripojenia remdesiviru; teda tieto flavonoidy možno použiť ako adjuvantnú liečbu spolu s remdesivirom [49]. Účinky kvercetín-7--O-glukozidu (Q7G) sa hodnotili v in vitro štúdii na bunkách MDCK infikovaných vírusmi chrípky A a B v porovnaní so štandardným antivírusovým činidlom oseltamivirom. Oseltamivir bol použitý ako kontrolovaný liek a vykazoval miernu antivírusovú aktivitu s hodnotami IC50 25,4 až 42,2 ug/ml; zatiaľ čo Q7G inhiboval vírus chrípky A a B s hodnotami IC50 3,10 ug/ml až 8,19 ug/ml. Oseltamivir tiež vykazoval slabšiu aktivitu proti chrípke B ako chrípke A; zatiaľ čo Q7G preukázal silnú aktivitu proti všetkým vírusom chrípky. Okrem toho kvantitatívne testy PCR uvádzali vyšší pokles syntézy vírusovej RNA po liečbe Q7G v porovnaní s oseltamivirom, čo naznačuje inhibičný účinok Q7G na vírusovú RNA polymerázu. Analýza molekulárneho dokovania odhalila, že táto interakcia je spôsobená pripojením Q7G k podjednotke PB2 vírusovej RNA polymerázy [50].

Oroxylín A(OA) je flavonoid nachádzajúci sa v Oroxylum Indicum(L.)Kurz. Ukázalo sa, že OA môže inhibovať niekoľko kmeňov chrípky A v bunkách MDCK spôsobom závislým od dávky. Perorálna liečba myší infikovaných chrípkovým vírusom H1N1 s OA tiež znížila vírusom indukovanú smrť, stratu telesnej hmotnosti a poškodenie pľúc, pričom miera prežitia bola 60,0 percent pri dennej dávke 100 mg/kg. Uvádza sa, že antivírusové účinky OA sú spôsobené downreguláciou transkripcie H1N1 matrix1 (M1) mRNA a syntézy proteínov (in et al. 2018). Proteín M1 je proteín vo vírusovom obale, ktorý sa viaže na vírusovú RNA a môže sprostredkovať enkapsidáciu nukleoproteínových jadier RNA do membránového obalu [51]. Hoci OA mohla inhibovať syntézu proteínov, nemohla blokovať vstup vírusu do hostiteľskej bunky alebo vstup nukleoproteínu (NP) do jadra hostiteľskej bunky [52]. Baikalín a biochanín A by mohli inhibovať infekciu chrípkou H5N1 v bunkách A549 s hodnotami IC50 18,79 a 8,92 μM. Tento účinok bol sprostredkovaný potlačením exportu jadrového vírusového ribonukleoproteínu (RNP) [53]. Ďalšie štúdie tiež ukázali, že baikalín môže znížiť expresiu chrípkového proteínu M1 [54,55].

Hostiteľská cdc2-kináza 1 (CLK1) má kľúčovú úlohu pri zostrihu génu M2 vírusu chrípky H1N1 a je dôležitým protichrípkovým cieľom. M2 je protónový kanál vo vírusovom obale vírusu chrípky A [56,57]. Ukázalo sa, že galokatechín{10}}galát izolovaný z Pithecellobium clypearia je inhibítorom hostiteľskej cdc{11}}kinázy 1 (CLK1), čo je protichrípkový cieľ vďaka svojej úlohe v alternatívnom zostrihu vírusovej M2 mRNA. Skúmanie účinku galokatechín-7-galátu v dennej dávke 30 mg/kg na ICR myšiach infikovaných vírusom H1N1 preukázalo výrazne vyššie prežitie až 8 dní. Tiež inhiboval vírusom vyvolané akútne poškodenie pľúc a úbytok hmotnosti. Okrem toho hodnotenia buniek A549 infikovaných H1N{23}} preukázali významnú downreguláciu vírusových NP a M2 mRNA. Okrem toho sa fosforylácia zostrihových faktorov SF2/ASF a SC35, kľúčových faktorov pre alternatívny zostrih vírusu M2, výrazne znížila po liečbe galokatechín-7-galátom [58]. Cirsimaritín (CST), flavonoid z Artemisia scoparia Waldst. a Kitam bol hodnotený z hľadiska jeho in vitro antivírusových účinkov na MDCK a THP-1 bunky infikované tromi kmeňmi chrípkového vírusu, ktoré vykazovali hodnoty IC50 v rozsahu od 5,8 do 11,1 ug/ml, v porovnaní s 3,4 až 8,9 ug/ml pre ribavirín. Údaje ukázali, že CST môže účinne znížiť expresiu chrípkového M2 a proteínu spôsobom závislým od dávky, takže sila CST pri 20 ug/ml bola vyššia ako 10 uM štandardného antivírusového ribavirínu [59]. Luteolín je ďalší flavonoid s inhibičným účinkom na expresiu M2mRNA. V bunkách MDCK infikovaných rôznymi kmeňmi chrípky bolo 15 μM luteolínu účinnejších ako 10 μM oseltamiviru v bunkách infikovaných H1N1 aj H2N3. Luteolín tiež znížil expresiu obalového proteínu I vírusu chrípky (COPI), sprostredkujúci vstup vírusu a endocytickú dráhu v infikovaných bunkách [60]. Santin je flavonoid extrahovaný z Artemisia rupestris L., o ktorom sa tiež predpokladá, že má účinky proti vírusu chrípky prostredníctvom supresie expresie M2 mRNA v závislosti od dávky [61].

Bolo naznačené, že kvercetín by mohol byť pravdepodobným terapeutickým činidlom proti chrípkovej infekcii v skorých štádiách infekcie, takže môže byť použitý na profylaxiu vírusu chrípky. Skúmanie účinkov kvercetínu na bunky MDCK a A549 infikované kmeňmi chrípkového vírusu A odhalilo, že by mohol inhibovať vírusovú NP mRNA v závislosti od dávky, s najvyššou aktivitou pri koncentrácii 50 μM 【62】.

Výskum ukázal, že tricín (4'5,7-trihydroxy-3',5'-dimetoxyflavón) vykazuje antivírusovú aktivitu proti kmeňom chrípky A a B. Testy RT-PCR ukázali, že tricín môže potlačiť syntézu mRNA proteínu M v bunkách MDCK infikovaných vírusom chrípky; bez významných účinkov na biosyntézu neuraminidázy a hemaglutinínu. 50-percentná účinná koncentrácia tricínu, ktorá by mohla inhibovať syntézu vírusovej mRNA, bola 3.4-10 uM

pre kmene vírusu chrípky A a 4,9 μM pre vírus chrípky B. U myší infikovaných vírusom chrípky tricín v dávke 20 ug/kg zlepšil úbytok telesnej hmotnosti a čas prežitia [63].

2.1.3. Vstup vírusu, replikácia a infekčnosť

RNA vírusy kódujú proteíny využívajúce mechanizmus hostiteľskej bunky pre svoj životný cyklus. Pochopenie týchto potrieb hostiteľskej bunky nás nielen informuje o molekulárnych dráhach používaných vírusom, ale predstavuje aj ďalšie ciele pre vývoj liečiv [64].

Štúdia in vitro hodnotila účinok kvercetínu a izohamnetínu na vstup SARS-CoV-2 do buniek ACE2h. ACE2 exprimovaný na pľúcnych bunkách je koreceptorom vírusového spike proteínu, a preto je hlavným cieľom antivírusových činidiel proti SARS-CoV-2. Pozorovalo sa, že tieto dva flavonoidy majú vysokú väzbovú afinitu k ACE2 a následne znižujú vstup vírusu prostredníctvom inhibície pripojenia spike proteínu k tomuto receptoru [65]. Ďalšia štúdia hodnotila účinok baicaleínu na infekciu SARS-CoV{11}} v bunkách Vero E6 a hACE2 transgénnych myšiach. Významné zníženie sa pozorovalo pri replikácii vírusu in vitro a in vivo, ako aj pri strate telesnej hmotnosti a poranení pľúc u zvierat [66]. Dihydroxy-6'-metoxy-3',5'-dimetylchalkón a myricetín-3'5'-dimetyléter 3-O- -D-galaktopyranozid sú flavonoidy odvodené od Cleistocalyx operculate(Roxb.) Merry. a LM Perry. Test redukcie cytopatického účinku (CPE) ukázal, že tieto flavonoidy inhibujú replikáciu vírusu chrípky H1N1 v bunkách MDCK. Štúdie vzťahu medzi štruktúrou a aktivitou (SAR) ukázali, že OH skupiny na C-7 a C-4, dvojitá väzba medzi C-2 a C-3, a najmä karbonylová skupina v pozícii C-4 sú kritické funkčné skupiny, ktoré významne zlepšujú antivírusové vlastnosti flavonoidov [67].{35}}deoxysappanchalcon (3DSC) izolovaný z Caesalpinia sappan L. by mohol inhibovať replikáciu vírusu chrípky vo vysokých koncentráciách prostredníctvom inhibícia expresie vírusového NP v MDCK bunkách infikovaných vírusom H1N1. Pri rovnakej koncentrácii (30 uM) ribavirín aj 3DSC vykazovali významnú inhibíciu expresie NP, hoci ribavirín mal silnejší účinok [68]. Štúdie preukázali, že biochanín A a baicaleín inhibovali aktiváciu kaspázy{42}}, enzýmu podieľajúceho sa na replikácii vírusu [53,69]. Tieto zlúčeniny by tiež mohli inhibovať jadrový export vírusových komplexov RNP, čo je rozhodujúce pri replikácii vírusu [53]. Biochanín A vykazoval inhibičný účinok proti mitogénom aktivovaným p38 a NF-kB, o ktorých sa ukázalo, že sa podieľajú na replikácii vírusu. NF kB a p38 sú aktivované v dôsledku oxidačného stresu a je známe, že ovplyvňujú replikáciu a patológiu vírusu chrípky A [53,70]. Výskumy na bunkových kultúrach buniek MDCK a buniek A549 infikovaných vírusom chrípky ukázali, že baicaleín môže inhibovať replikáciu vírusu v koncentráciách 20-80 ug/ml. Je zaujímavé, že baikalín vykazoval podobnú antivírusovú aktivitu ako ribavirín a oseltamivir v koncentráciách 40 ug/ml a 60 ug/ml, v danom poradí. Baikalín tiež inhiboval replikáciu vírusu v pľúcach myší in vivo [71]. Ukázalo sa, že CST znižuje NF-kB proteín a fosforyláciu NF-KB v jadre [59]. Je už známe, že NF-KB má dôležitú úlohu vzápal, oxidačný stresa potlačenie imunity hostiteľa [72]. Zníženie regulácie NF-kB tiež inhibuje replikáciu v rôznych typoch vírusov, vrátane vírusu chrípky [73].

V bunkách Vero E6 infikovaných SARS-CoV-2 mohol naringenín inhibovať CPE spôsobom závislým od času a koncentrácie. Tento účinok bol sprostredkovaný inhibíciou endo-lyzozomálnych dvojpórových kanálov (TPC), čo je dráha zapojená do infekčnosti SARS-CoV-2, Ebola a MERS prostredníctvom uľahčenia vstupu vírusu [74]. EGCG preukázal od dávky závislý inhibičný účinok （25,50 μM） na replikáciu HIV v T-bunkách; avšak inhibícia vírusovej replikácie nebola priamo ovplyvnená inhibíciou RT. Fassina a spol. analyzovali enzým p24, ktorý sa podieľa na balení vírusových častíc. Výsledky ukázali zníženie koncentrácie p24 a aktivity RT v T lymfoblastoch infikovaných HIV. Na základe nasledujúcich výsledkov sa zistilo, že EGCG inhiboval vírusovú replikáciu prostredníctvom downregulácie vírusovej infekcie. O presnom účinku vírusovej infekcie EGCGon zatiaľ nie je isté [75]. Signalizácia gp120 sa bežne spája so zvýšenou replikáciou HIV{19}} v predtým infikovaných bunkách[75]. Štúdie ukazujú inhibičný účinok genisteínu na gp120 a následne na replikáciu vírusu HV-1. Po administrácii nenastala žiadna zmena v replikácii vírusu

istrácia genisteínu s koncentráciou {{0}},5 ug/ml, ale v rozsahu 5-10 ug/ml by genisteín mohol potlačiť replikáciu vírusu [76]. Herbacitrín je flavonoid získaný z Drosera peltata Thunb. a bol predtým známy ako antivírusová látka. Ukázalo sa, že herbacitrín inhibuje RT aj integrázu v bunkových kultúrach MT-4 a MT{6}} infikovaných HIV-1, čo vedie k blokáde vírusovej replikácie v rôznych štádiách. Pri koncentrácii 21,5 ug/M by herbacitrín mohol potlačiť aktivitu R, zatiaľ čo by mohol inhibovať integrázu pri nižšej koncentrácii, 2,15 uM [77]. Scutellarin purifikovaný z Erigeron breviscapus je flavonoid s anti-HIV{13}} aktivitou. Tento flavonoid inhiboval aktivitu RT HIV{14}} a bunkovú fúziu ako hlavných účastníkov vírusovej replikácie [Z8]. Hesperidín a linarín sú flavonoidy s rutinózou na kruhu A a metoxy (-OCH3) substitúciou na kruhu B. Ukázalo sa, že izokvercetín inhibuje replikáciu vírusov chrípky A a B v infikovaných bunkách MDCK. Kombinácia izokvercetínu s amantadínom tiež preukázala synergický účinok na replikáciu vírusu v bunkách MDCK infikovaných vírusom chrípky A len v nízkych dávkach (0,5 uM pre izokvercetín a 1 uM pre amantadín). Hodnoty vírusového titra po podaní izokvercetínu a amantadínu boli asi 7,5; zvýšenie koncentrácií izokvercetínu a amantadínu znížilo synergický účinok na titre vírusu na hodnotu 5 [79]. Q3R odvodený z Houttuynia cordata má účinky proti vírusu chrípky. Účinky Q3R na bunky MDCK infikované vírusom chrípky A sa porovnávali s oseltamivirom. Pľúcne lézie a edém boli inhibované Q3R viac ako oseltamivir. Q3R mal tiež vyššiu účinnosť v porovnaní s oseltamivirom. Inhibičný účinok Q3R na replikáciu vírusu chrípky bol nepriamy a prostredníctvom interakcie s vírusovými časticami. Oseltamivir preukázal miernu antivírusovú aktivitu, asi 58 percent proti vírusu chrípky A, a slabú antivírusovú aktivitu nižšiu ako 49 percent pri dávkach pod 10 ug/ml; zatiaľ čo Q3R vykazoval 86 percentnú inhibíciu vírusu pri 100 ug/ml a 66 percent inhibíciu pri koncentráciách 10 ug/ml [80]. Ukázalo sa, že kvercetín 3- -OD-glukozid (Q3G) zabraňuje replikácii vírusu Ebola in vitro. Profylaktické podanie Q3G 30 minút pred infekciou ukázalo významnú prevenciu vírusu Ebola. Q3G by tiež mohol inhibovať vstup vírusu v skorých štádiách. O3G by teda mohol byť účinným flavonoidom na profylaxiu vírusu Ebola [81].

2.2. Nepriame antivírusové účinky

2.2.1. Účinok na interferóny

Interferóny (IFN) zahŕňajú skupinu proteínov produkovaných niekoľkými imunitnými bunkami v reakcii na mnohé patogény, ako sú vírusy, parazity, baktérie a nádorové bunky. Existujú tri hlavné triedy IFN, vrátane typu I alebo interferónov stabilných voči kyselinám (IFN- podtypy, IFN-, IFN-K, IFN-e, IFN-w a IFN-t), typu II (IFN-y), a IFN typu III, ktoré sú známe ako IFN-λ 【82-84】. Vykazujú širokú škálu biologických aktivít, ako je aktivácia vrodenej imunitnej odpovede, zvýšenie expresie molekúl hlavného histokompatibilného komplexu (MHC), potláčanie angiogenézy. Ich najdôležitejšou úlohou je interferovať s vírusovými infekciami [84,85].

V skorých fázach vírusovej infekcie IFN aktivujú vrodenéimunitný systém. Nedávne štúdie zaznamenali pokles indukcie a signalizácie IFN typu I a typu I u pacientov s COVID-19 [86]. Tieto typy IFN preukázali antivírusové účinky znížením imigrácie neutrofilov do miesta zápalu, zvýšením prezentácie antigénu, potlačením prozápalu sprostredkovaného mononukleárnymi makrofágmi a aktiváciou získanej imunity na progresiu antigén-špecifických odpovedí B a T buniek. 86-90]. Používanie IFN v skorej fáze ochorenia by teda mohlo znížiť príznaky COVID-19 znížením replikácie vírusu. Výskumníci tiež uviedli, že hladiny IFN- sa môžu zvýšiť u pacientov s COVID-19 s ARDS. Rýchly nárast hladín IFN by mohol pozvať prozápalové cytokíny do alveolárneho tkaniva a viesť k zápalu pľúc a poškodeniu pľúc (90,91). Preto sa zdá, že buď upregulácia alebo dysregulácia IFN a iných prozápalových cytokínových odpovedí, alebo oboje, by mohli zohrávať významnú úlohu v progresii a patologických znakoch SARS-CoV-2.

Nech al. skúmať protichrípkové účinky baicalínu, glykozyloxyflavónu, ktorý je 7-O-glukuronid baicaleínu, na in vitro a in vivo modeli infekcie vírusom chrípky A. Faktor 6 (TRAF6) spojený s TNF receptorom je účinným mediátorom v signálnej dráhe produkcie IFN. Nadmerná expresia TRAF6 vedie k zvýšenej produkcii IFN typu I [54]. MikroRNA (miRNA) sú malé molekuly, ktoré post-transkripčne riadia reguláciu génov [92]. Ukázalo sa, že miR{11}}a má regulačnú úlohu pri zápale [93]. miR{13}}a by mohla zlepšiť replikáciu H1N1 a H3N2 prostredníctvom zníženia regulácie TRAF6. Baicalin (20 ug/ml) indikoval významné zníženie expresie miR{20}}a, vírusového NP, hladín Ml proteínu, vírusového titra a tiež zvýšil mieru prežitia myší [54]. V ďalšej štúdii Nayak a kolegovia reprezentovali aktivitu baicalínu proti vírusu chrípky (H1N1-pdm09) prostredníctvom regulácie vírusového proteínu NS1, čo viedlo k zvýšeniu regulácie interferónového regulačného faktora 3 (IRF-3）, IFN) - a IFN-. Táto upregulácia IFN znížila replikáciu vírusu, ktorá by mohla znížiť vírusové transkripty a expresiu prozápalových cytokínov, vrátane IL-8 a TNF-x [55].

Ding a spol. navrhol štúdiu na skúmanie účinkov hesperidínu, flavanónového glykozidu, na poškodenie pľúc u samcov potkanov vyvolané vírusom chrípky A (H1N1). Výsledky ukázali, že hesperidín zmiernil poškodenie pľúc prostredníctvom zníženia produkcie prozápalových cytokínov, vrátane IFN-, TNF-x a IL-6, potlačením signálnych dráh MAPK. Hesperidín tiež znížil IFN- v pľúcnych mikrovaskulárnych endoteliálnych bunkách infikovaných H1N1 [94]. V ďalšej štúdii Kim et al. izokvercetín účinne zmiernil poškodenie pľúc vyvolané vírusom H1N1 u myší prostredníctvom zníženia IFN-, iNOS, RANTES, titrov vírusu, vírusovej bronchitídy a bronchiolitídy [79].

Oroxylín A (OA) z Oroxylum Indicum(L.)Kurz zabránil poškodeniu pľúc vyvolanému vírusom chrípky A H1NI u myší prostredníctvom zvýšenej regulácie IFN- a IFN-【52】. Wogonín, ďalší flavonoid izolovaný zo Scutellaria baicalensis Georgi, vykazoval významnú protichrípkovú aktivitu reguláciou dráh AMPK. Wogonín tiež zvýšil reguláciu IFN-, IFN-λl a IFN downstream molekúl, vrátane génu A rezistencie na myxovírus (MxA) a 2-5' oligoadenylátsyntetázy (OAS), v bunkách infikovaných MDCK a A549 [95].

2.2.2. Účinok na prozápalové cytokíny (TNF, IL a MCP)

CoV obsahujú niektoré otvorené čítacie rámce, ktoré kódujú niekoľko doplnkových proteínov. Ukázalo sa, že tieto pomocné proteíny modulujú zápalové dráhy, ako je signalizácia IFN a prozápalové cytokíny [96]. Objasnilo sa, že prognóza COVID{2}} by sa mohla zhoršiť sekréciou prozápalových cytokínov vrátane interleukínov, IFNy a TNF- [97]. Blanco-Mello et al. uviedli, že neprimeraná imunitná odpoveď môže pomôcť pri replikácii vírusu a komplikáciám spôsobených závažnými typmi COVID-19 [98]. Ruan et al. tiež ukázali, že zvýšenie zápalových cytokínov, ako je IL-6, je spojené s ARDS, respiračným zlyhaním a nepriaznivými klinickými výsledkami [99]. Respiračné zlyhanie spôsobené poškodením pľúc je výsledkom nadprodukcie prozápalových cytokínov po infiltrácii imunitných buniek do pľúc [100]. Cytokínová búrka je systémová zápalová reakcia spojená so širokým spektrom faktorov, ako sú infekcie a určité lieky. Niekoľko štúdií ukázalo významnú súvislosť medzi búrkou cytokínov, závažným zápalom a zlyhaním viacerých orgánov u pacientov s COVID-19 [101-103]. Rozpoznanie vírusu SARS-CoV{16}} vrodeným a adaptívnym imunitným systémom by mohlo viesť k aktivácii a produkcii zápalových cytokínov. Podľa nedávnych štúdií sú plazmatické hladiny prozápalových cytokínov u pacientov s COVID{18}} zvýšené. Tieto zápalové cytokíny ako TNF-, IL6, IL 2, IL-1, IL7, IL 10 a IL-18, ako aj monocytový chemoatraktant proteín-1(MCP-1 ), majú kľúčovú úlohu v patologickej progresii a závažnosti COVID-19 prostredníctvom zvýšenia vírusovej záťaže, zápalu pľúc, poškodenia pľúc, neurologických porúch a úmrtnosti [97,101].

Tieto udalosti by mohli viesť k zlyhaniu viacerých orgánov a poškodeniu pľúc ako hlavnej komplikácii SARS-CoV-2; preto možno moduláciu prozápalových cytokínov považovať za primeraný cieľ liečby COVID-19. Okrem toho boli v mnohých štúdiách preukázané výrazné protizápalové účinky flavonoidov; teda môžu byť sľubnými zlúčeninami v boji proti zápalovým komplikáciám COVID-19 [97].

Yang a kol. preukázali ochranný účinok 3-deoxysappanchalconu （30 μM） na zápal a apoptózu vyvolaný vírusom chrípky H1N1 in vitro znížením hladín IL-1 a IL{6}} [68]. Baicaleín, flavón, a biochanín A, O-metylovaný izoflavón, znížili expresiu prozápalových cytokínov v bunkách A549 a primárnych makrofágoch odvodených od ľudských monocytov (MDM) infikovaných kmeňmi vírusu chrípky H5N1, čo by mohlo zabrániť aktivácii zápalovej dráhy a poškodeniu tkaniva [53]. V bunkách A549 a MDCK infikovaných chrípkou A môže baikalín, glykozylovaná forma baicaleínu (baicaleín-7-glukuronid), zvýšiť hladiny IFN, čo vedie k zníženiu produkcie prozápalových cytokínov. IL-8 a TNF- boli teda významne nižšie v bunkách ošetrených baicalínom v porovnaní s neošetrenými kontrolnými bunkami [55].

Štúdia in vitro ukázala, že koncentrácie 2,5, 5 a 10 ug/ml CST, dimetoxyflavónu, majú významný vplyv na zoslabenie dráhy prenosu signálu NF-kB v bunkách THP-1 infikovaných chrípkou A vírus (H1N1). Po inhibícii NF-kB sa produkcia prozápalových cytokínov vrátane I-1, IL-8, IL-10 a TNF-, ako aj proteínu súvisiaceho so zápalom COX{{ 15}}, boli potlačené CST spôsobom závislým od dávky [59]. V in vitro štúdii Yonekawa et al. o antivírusových vlastnostiach hesperidínu a linarínu tieto flavonoidové glykozidy inhibovali replikáciu vírusu R5-HIV-1-NL(AD8) v CD4 plus NKT bunkách zvýšením produkcie protizápalových cytokínov vrátane IL-2, IL-5 a IL-13. Bolo pozorované, že stimulačný účinok týchto dvoch flavonoidov je kriticky závislý od cukrovej skupiny, pretože aglykóny (hesperetín a acacetín) takúto aktivitu nevykazujú. Okrem toho je metoxy(-OCH3) substitúcia na kruhu B nevyhnutná pre stimulačnú aktivitu hesperidínu a linarínu na bunky CD4 plus NKT. Mohli by tiež indukovať sekréciu RANTES, MIP-1 a MIP-1 z V61 plus exprimujúcich T bunkových receptorov, ktoré následne potlačili vírusovú replikáciu v CD4 plus NKT bunkách[104]. Kang a kol. opísali protichrípkové účinky purifikovaných flavonoidov z Pithecellobium clypearia Benth na in vitro modeli infekcie vírusom chrípky A. Tieto purifikované flavonoidy potláčali produkciu IL-6 a MCP-1 v ľudských pľúcnych bunkách A549 infikovaných H1N1-[105]. Mehrbod a kol. skúmali protizápalový účinok kvercetín-3-O- -L-ramnopyranozidu (Q3R), glykozylovaného flavónu, na bunky MDCK infikované vírusom chrípky H1N1. Q3R v koncentrácii 150 ug/ml významne znížil titer vírusu a zvýšil produkciu IL{51}}, čo by mohlo ďalej zvýšiť sekréciu IL-10 CD4 plus T bunkami a zvýšiť ich antivírusovú aktivitu. Na druhej strane, O3R potláčal produkciu TNF- ako jeden z dôležitých zápalových mediátorov spôsobujúcich horúčku a spúšťajúci prozápalovú dráhu NF-kB, čím ďalej zhoršoval stav pacientov [106]. Trimetoxyflavón Santin preukázal protichrípkovú aktivitu v bunkách THP-1 a MDCK v koncentrácii 60 μM. Vírus chrípky A（H3N2） indukuje produkciu prozápalových cytokínov v THP-1 bunkách, čo vedie k zápalu a poraneniu pľúc [61]. Protizápalové cytokíny môžu byť tiež zmenené počas infekcie vírusom chrípky. IL-10 je protizápalový cytokín, ktorý môže byť vyvolaný vírusom chrípky. IL-10 inhibuje invariantné prirodzené zabíjačské T bunky znížením produkcie IL-12 dendritickými bunkami odvodenými z pľúcnych monocytov[107]. Hladiny IL-6, IL-8, IL-10, IL-1 a TNF- boli významne znížené v skupine liečenej Santinom prostredníctvom downregulácie MAPK a NF- kB signálne dráhy [61].

Okrem vyššie uvedených sú galokatechín-7-galát, genisteín a theaflavíny ďalšími flavonoidmi s modulačnými účinkami na produkciu prozápalových cytokínov [58,76,108]; zdá sa teda, že tieto molekuly majú žiaduci protizápalový účinok, ktorý je užitočný pri kontrole zápalu súvisiaceho s vírusovou infekciou.

2.2.3. Účinok na subcelulárne zápalové dráhy (NF-kB, PI3K/Akt a MAPK/JNK)

Keď vírus vstúpi do hostiteľskej bunky, hostiteľská bunka rozpozná svoju replikáciu prostredníctvom receptorov na rozpoznávanie vzorov (Pattern recognition receptors, PRR)[109]. Štruktúra vírusovej RNA sa podieľa na oligomerizácii PRR a aktivácii následných transkripčných faktorov, najmä interferónových regulačných faktorov (IRF) a NF-kB. Aktivácia NF-kB a IRF vedie k zapojeniu bunkovej antivírusovej obrany indukciou interferónov typu I a I a sekrécie chemokínov [110].

Chiou et al. skúmali účinky 8-prenylkaempferolu (8-PK) v bunkách A549 infikovaných vírusom chrípky A (H1N1). Výsledky ukázali, že interferencia s dráhou PI3K-Akt je hlavným mechanizmom 8-PK vedúcim k ochranným účinkom proti vírusu chrípky A.{8}}PK znížila NF-kB a IRF-3 jadrovú translokáciu prostredníctvom zoslabenia Akt fosforylácie a aktivity PI3K. Nakoniec, so zníženou produkciou regulovanej aktivácie, normálne T bunky exprimovali a vylučovali (RANTES) prostredníctvom buniek A549 infikovaných H1N1- [111]. Zhu a kol. predstavovali, že autofágia vyvolaná vírusom chrípky A (H3N2) v bunkách infikovaných A549 a Ana{20}} prostredníctvom potlačenia signálnej dráhy mTOR. Baicalin by mohol zvýšiť fosforyláciu mTOR a zachrániť účinky vírusu H3N2 spôsobom závislým od dávky [112]. V inej štúdii sa zistilo, že baikalín vykazuje aktivitu proti vírusu chrípky (H1N1-pdm09) znížením regulácie PI3k/Akt dráhy spôsobenej moduláciou expresie vírusového proteínu NS1 55]. Okrem toho biochanín A, O-metylovaný izoflavón, indikoval ochranné účinky na bunky infikované vírusom chrípky H5N1 prostredníctvom zníženia fosforylácie AKT, ERK1/2, JNK a p38. Mohol by tiež modulovať bunkové signálne dráhy, znížiť IL-6, IL-8, CXCL10(IP-10), TNF- a zlepšiť hladiny IkB [53].

CST predstavoval inhibičné účinky na in vitro model infekcie vírusom chrípky A prostredníctvom inhibície signálnej dráhy NF-kB/p65, čo viedlo k zníženiu prozápalových cytokínov. CST tiež znížila hladiny fosfo-p38 MAPK a fosfo-JNK [59]. V inej štúdii od Dinga a kol. podávanie hesperidínu v denných dávkach 200 a 500 mg/kg počas piatich dní mohlo inhibovať zápal pľúc pri poranení pľúc vyvolanom vírusom chrípky A (H1N1) u potkanov. Tento účinok bol sprostredkovaný prostredníctvom zoslabenia produkcie prozápalových cytokínov, vrátane IL-6 a TNF-. Hesperidín tiež znížil expresiu IL-6 a TNF v pľúcnych mikrovaskulárnych endoteliálnych bunkách infikovaných H1N1 prostredníctvom inhibície signálnych dráh MAPK [94]. Ďalej štúdie navrhli signálnu dráhu ERK ako hlavný modulátor signálnej dráhy MAPK. Isorham-netín （50 μM）, monometoxyflavón, znížil fosforyláciu ERK v bunkách MDCK po infekcii vírusom chrípky A(H1N1) [113]. Jeong a kolegovia skúmali cytotoxické účinky pyroxylínu A a tectorigenínu v bunkách CHME5 a primárnych ľudských makrofágoch infikovaných HIV-1-D3. Tieto flavonoidy uplatňujú svoje účinky znížením fosforylácie PI3K, Akt, mTOR, PDK1, GSK-3 a Bad v bunkách ošetrených lipopolysacharidom/cykloheximidom Santin potlačil replikáciu vírusu chrípky A v MDCK a THP-1 infikované bunky [114]. Pri koncentrácii 60 uM Santin zoslabil fosforyláciu p38 MAPK, ERK, JNK/SAPK a NF-kB[61].