Výťažky z kvetov ako multifunkčné farbivá v kozmetickom priemysle 2. časť

Prosím kontaktujteoscar.xiao@wecistanche.comPre viac informácií

Mnoho prírodných produktov sa používa v tradičných medicínskych systémoch na liečbu úľavy od symptómov bolesti a zápalu, [61] preto sa skúmal účinok analyzovaných extraktov na inhibíciu aktivity lipoxygenázy a proteinázy. V rozsahu analyzovaných koncentrácií (100-500 ug/ml) vykazoval vodný extrakt CTE najsilnejšiu schopnosť inhibovať proteinázu (obrázok 4) (57 percent pre koncentráciu 500 ug/ml). Táto aktivita sa porovnávala s dobre známym inhibítorom proteinázy diklofenakom, ktorý sa použil ako kontrola (približne 89 percent inhibície pri najvyššej testovanej koncentrácii). Podobné výsledky sa však získali pre extrakt GGE a KTE (približne 56 percent a 53 percent, v uvedenom poradí, pre najvyššie koncentrácie). Nižšia inhibícia proteinázy bola pozorovaná pre extrakty PRE a PGE. V ďalšom teste, ktorý meral schopnosť inhibovať lipoxygenázu, vodné extrakty z KTE a CTE vykazovali najvyššie hodnoty (približne 67 percent a 64 percent inhibície pri koncentrácii 500 ug/ml）. Diklofenak bol tiež použitý ako kontrola Extrakty GGE, PGE a PRE tiež vykazujú výrazne vysoké hodnoty (60 percent, 57 percent a 54 percent, v tomto poradí) Bolo tiež zaznamenané, že schopnosť inhibovať enzýmy LOX a proteinázy závisí od koncentrácie extraktu (obrázok 5).

Predchádzajúce štúdie ukázali, že mnohé polyfenolové zlúčeniny významne prispeli k protizápalovým aktivitám mnohých rastlinných extraktov[62]. Štúdie preukázali zapojenie ROS do zápalového procesu a fenolové zlúčeniny, ako je kyselina galová a chinová, môžu blokovať metabolizmus kyseliny arachidónovej inhibíciou aktivity lipoxygenázovej aktivity, alebo môžu slúžiť ako zachytávanie reaktívnych voľných radikálov, ktoré vznikajú pri kyseline arachidónovej. [63]. Výsledky získané BenSaadom a kol. naznačujú, že kyselina ellagová, kyselina galová a punicalagin A&B izolované z P. granatum inhibovali produkciu oxidu dusnatého (NO), prostaglandínu E2 (PGE2) a interleukínu 6 (IL-6) v lipopolysacharidom (LPS) indukovanej RAW 267.4 makrofágy. Otázkou zostáva, či tieto zlúčeniny fungujú ako jediné činidlá alebo majú synergický účinok [64]. Pretože mnohé flavonoidy vykazujú protizápalové vlastnosti, v dôsledku ich prirodzeného antioxidačného správania sa podieľajú na rôznych zápalových ochoreniach.metóda extrakcie flavonoidov pdf,Najmä kvercetín je najzaujímavejšia molekula, pretože zasahuje do špecifických biologických dráh. Štúdie navyše naznačujú, že môže znížiť zápalový proces zahrnutý v niekoľkých modeloch prostredníctvom rôznych mechanizmov [65]. Najmä AMP-aktivovaná proteínkináza a dráha histón/proteín deacetyláza (AMPK/SIRT1) vedie k zaujímavejšiemu manažmentu zápalu. Aktivátory AMPK teda môžu znížiť zápal makrofágov. Kvercetín a iné flavonoidy, ako aktivátory AMPK a SIRT1, môžu znížiť zápal tým, že zasahujú do tejto dráhy [66]. Ukázalo sa tiež, že kvercetín a monoglukozidy kvercetínu vykazujú vyšší potenciál inhibície LOX [67] Nair et al. preukázali protizápalové vlastnosti extraktu KTE vyhodnotením prítomnosti flavonolov s kvercetínovou skupinou, ako je manghaslín Qu 3-[2G] ramnosylrutinozid, Qu 3-O-dirhamnozid a rutín. Tieto molekuly preukázali silnú inhibíciu aktivity COX{11}} a čiastočnú supresiu ROS. Vo všeobecnosti polyfenoly prítomné v CTE vykazovali protizápalové vlastnosti pri zápale indukovanom LPS v makrofágových bunkách RAW 264.7 [68].

Ak chcete vedieť viac, kliknite sem

2.5. Hodnotenie cytotoxicity

Pri vytváraní nových kozmetických surovín je jednou z najdôležitejších vlastností ich bezpečnosť používania. Látky určené na použitie v kozmetike musia byť netoxické, najmä vo vzťahu k kožným bunkám, ako sú keratinocyty a fibroblasty. Na stanovenie toxicity analyzovaných extraktov na HaCaT a BJ bunkách sa použili dva typy testov.flavonoidyPrvá štúdia s použitím testu absorpcie neutrálnej červenej nám umožňuje posúdiť životaschopnosť buniek ošetrených analyzovanými extraktmi. Toto farbivo sa dostáva do lyzozómov živej bunky a uvoľňuje sa do cytoplazmy mŕtvych buniek. Bolo pozorované (obrázok 6), že extrakt CTE má najvyššiu schopnosť zvýšiť proliferáciu buniek HaCaT aj BJ. V porovnaní s kontrolou tento extrakt dosiahol asi o 20 percent a o 40 percent vyššie hodnoty ako testovaný parameter pri koncentrácii 250 μl/ml (HaCaT a B】) a 500 μl/ml (bunky BJ). Extrakt GGE v koncentráciách 100 a 250 μl/ml a extrakt KTE v koncentrácii 500 μl/ml sa vyznačovali malým toxickým účinkom na bunky BJ. Ostatné extrakty mali pozitívny vplyv na životaschopnosť týchto buniek. Extrakty PRE a PGE v koncentrácii 100 μl/ml sa významne nelíšili od kontroly a zvýšili proliferáciu BJ buniek asi o 10-15 percent v porovnaní s kontrolou pri koncentrácii 250 a 500 μl/ ml. V prípade keratinocytov sa nepozorovalo žiadne zníženie životaschopnosti buniek. V prípade extraktov PGE, PRE a CTE sa zaznamenal nárast proliferácie so zvyšujúcou sa koncentráciou, zatiaľ čo pokles životaschopnosti buniek sa preukázal so zvyšujúcou sa koncentráciou extraktov KTE a GGE.

Druhým testom na stanovenie cytotoxicity testovaných extraktov bol resazurínový test (Alamar Blue). Ukázalo sa (obrázok 7), že životaschopnosť buniek závisí od koncentrácie extraktu, s ktorým boli bunky inkubované. V prípade fibroblastov spôsobujú extrakty PRE, PGE a CTE vyššiu bunkovú proliferáciu so zvýšením ich koncentrácie. Pri najvyššej analyzovanej koncentrácii （500 μl/ml） bola pozorovaná asi o 20 percent vyššia proliferácia v porovnaní s kontrolou.užíva hesperidínV prípade extraktov KTE a GGE sa pozoroval pokles životaschopnosti buniek so zvýšením koncentrácie extraktov. Tieto extrakty vykazovali malý toxický účinok na BJ pri koncentráciách 250 a 500 μl/ml. V prípade keratinocytov bol pozorovaný podobný účinok analyzovaných extraktov na kožné bunky, ale ich schopnosť proliferovať nebola taká silná ako v prípade fibroblastov. Najvyššia schopnosť zvýšiť proliferáciu keratinocytov bola pozorovaná u extraktu CTE v celom rozsahu analyzovaných koncentrácií. Podobné hodnoty boli získané pre extrakt PRE v koncentrácii 250 μL/ml a pre extrakt PGE v koncentrácii 500 μL/ml. Extrakt KTE vykazoval výrazne vyšší toxický účinok na bunky HaCa ako extrakt GGE.

Analyzované extrakty neboli predtým extenzívne testované na ich toxicitu pre kožné bunky. Existuje len niekoľko štúdií cytotoxicity extraktov alebo ich hlavných účinných látok, najmä voči rakovinovým bunkám. Autori predchádzajúcich štúdií uviedli, že tieto extrakty vo všeobecnosti nemajú toxický účinok na kožné bunky a ich schopnosť zvýšiť proliferáciu buniek sa najčastejšie pripisuje vysokému obsahu polyfenolov, antokyanov a flavonoidov [45,69-73 ]. Niektorí autori tiež uviedli, že jednotlivé zložky obsiahnuté v extraktoch môžu vykazovať toxický účinok na kožné bunky, zatiaľ čo extrakt ako celok nie. Ali Hijazi a kol. [69] ukázali, že alkaloidy extrahované z Punica granatum sú toxické pre normálne a rakovinové bunkové línie, zatiaľ čo celý extrakt je menej toxický. Štúdia Nasiriho a kol. [70] naznačuje, že extrakt z kvetov Punica granatum môže byť užitočný pri urýchlení procesu hojenia rán vďaka svojej schopnosti zvýšiť proliferáciu kožných buniek. V našom predchádzajúcom výskume [45] sa ukázalo, že vodno-etanolové extrakty získané z analyzovaných rastlín sa vyznačovali vyššou schopnosťou zvýšiť proliferáciu BJ buniek a extrakty KTE a GGE vykazovali nižší toxický účinok na tieto bunky. .stratená ríša cistancheÚčinok vodno-etanolových extraktov na HaCaT bunky bol podobný ako u čistých vodných extraktov, ale v prípade extraktov získaných s etanolom boli pozorované o niečo priaznivejšie proliferačné vlastnosti ako v prípade vodných extraktov. Rozdiely medzi zložením oboch typov analyzovaných extraktov môžu spôsobiť rozdiely v ich toxicite. Ako je znázornené, vodné extrakty nie sú také bohaté na bioaktívne zložky ako extrakty voda-etanol. Najväčšie rozdiely sú pozorované v obsahu rutínu a izokvercitrínu.

Cistanche môže proti starnutiu

2.6. Stanovenie slnečného ochranného faktora

Nepriaznivé účinky UV žiarenia na pokožku sa môžu prejaviť tak krátko po expozícii, ako aj po rokoch. Slnečné žiarenie má imunosupresívny účinok, ktorý urýchľuje proces starnutia kože so všetkými dôsledkami, ktoré s tým súvisia, vrátane zvýšenej karcinogenézy[74]. V súčasnosti pozorované trendy poukazujú na rastúcu potrebu vyvíjať produkty, ktoré sa vyznačujú nielen veľmi vysokou úrovňou bezpečnosti pri používaní, ale aj multifunkčnosťou v tom zmysle, že produkty sa budú vyznačovať antiradiačnou ochranou pokožky so širším rozsahom pôsobenia ako doteraz. Neoceniteľnú úlohu v tomto aspekte zohrávajú niektoré rastlinné látky, ktoré sú schopné nielen poskytnúť ochranu pred slnkom, ale aj neutralizovať už existujúce negatívne účinky slnečného žiarenia na pokožku [75-77]. Vykonaný výskum ukázal, že analyzované rastlinné extrakty PRE, PGE, KTE, CTE a GGE sa vyznačujú vysokými koeficientmi SPF.

Analýza koeficientov (SPF) bola vykonaná pre získané vodné extrakty z vyššie uvedených rastlín v koncentráciách 10 a 50 mg/ml. Pre každú skúmanú rastlinu vyššia koncentrácia extraktu viedla k výrazne vyššej hodnote SPF.mikronizovaná purifikovaná flavonoidná frakcia 1000 mg používaPorovnanie medzi extraktmi ukazuje, že najvyššie hodnoty SPF boli pozorované pre extrakt KTE, čo platí pre obe skúmané koncentrácie. Ďalším zaujímavým pozorovaním je, že aj v nižších zo skúmaných koncentrácií extrakt KTE stále vykazoval vysoký SPF, zatiaľ čo hodnoty pre ostatné extrakty sa výrazne znížili. To je jasné, keď analyzujeme, o koľko bol výsledok pre KTE vyšší ako pri iných extraktoch. Pri koncentrácii 50 mg/ml bol SPF vyšší o faktor 1,2 (v porovnaní s PGE, CTE) až o faktor takmer 1,9 (v porovnaní s PRE, GE). Rovnaký výpočet pre koncentráciu 10 mg/ml poskytne faktory od 1,4 (v porovnaní s PGE) po faktory v rozsahu 2-3 (v porovnaní s CTE, GGE), dokonca až po faktory ako 10 v porovnaní s PRE. Keď sa zameriame na extrakt KTE, možno si všimnúť, že zníženie koncentrácie extraktu faktorom 5 (z hodnoty 50 mg/ml na hodnotu 10 ml/ml) má za následok zníženie hodnoty SPF faktorom 3,4. , čo znamená, že SPF klesá pomalšie ako koncentrácia. Vyššie uvedené ukazuje, že extrakt KTE môže byť účinný, aj keď sa aplikuje v nízkych koncentráciách (obrázok 8).

2.7. Merania transepidermálnej straty vody (TEWL) a hydratácie pokožky

Vďaka širokému spektru biologickej a farmakologickej aktivity rastlinných surovín majú rastlinné látky obsiahnuté v extraktoch významný vplyv na stav pokožky. Hovoríme tu najmä o vplyve sekundárnych metabolitov na stav našej pokožky [78,79].

V ďalšej etape výskumu boli vykonané analýzy hydratácie a TEWL. Hodnotil sa účinok testovaných extraktov na pokožku. Merania sa uskutočňovali v dvoch časových intervaloch 60 a 360 minút pre koncentráciu extraktu 10 mg/ml. Pri meraní TEWL sa najväčší percentuálny pokles ukázal pri extrakte PGE, kde kontrolná hodnota 13,9 klesla na 8,71, čo malo za následok percentuálny pokles o 37 percent. Z tohto hľadiska stojí za to analyzovať aj extrakt KTE, pretože tento vykazoval najvyššie hodnoty SPF. Pre extrakt KTE sa kontrolná hodnota TEWL znížila na hodnotu 10,22, čo znamená pokles o 26 percent (obrázok 9A).

V prípade druhého prístrojového merania sa však ukázalo, že analyzované extrakty spôsobujú zvýšenie hydratácie v porovnaní s kontrolnou vzorkou, a to po 60, ako aj po 360 minútach.

Ako výsledok analýz sa zistilo, že analyzované extrakty PRE, PGE, KTE, CTE a GGE zvyšujú hydratáciu pokožky (obrázok 9B). Bolo pozorované zvýšenie hydratačných vlastností spolu so zvýšením koncentrácie extraktu v prípravkoch. Najsilnejšie hydratačné vlastnosti boli pozorované u extraktov PRE a PGE, ktoré sa rovnali 32 percentám a 29 percentám po 60 minútach a 21 percentám a 22 percentám po 360 minútach. Najnižšia úroveň hydratácie pokožky sa však zistila pri extrakte KTE, ktorý sa rovná 18 percentám po 60 minútach a takmer 3 percentám po 360 minútach.

2.8. Analýza aplikácie

2.8.1. Stanovenie farebných parametrov extraktov

Vďaka svojej prirodzenej farbe môžu byť aktívne zložky kvetov rastlín použité ako prírodné farbivá v mnohých komerčných produktoch, ako je kozmetika a potraviny. Pre získané extrakty sa uskutočnila farebná analýza (tabuľka 5).

Zistilo sa, že extrakty PRE, KTE a CTE majú najvyšší potenciál ako prírodné kozmetické pigmenty. Avšak najvyššie hodnoty sýtosti (C*) boli pozorované pre CTE. Na základe hodnoty parametra h stupeň sa zistilo, že práve žltá farba tohto extraktu je pozorovateľná a viditeľná voľným okom. V prípade extraktov KTE a PRE je napriek nízkej hodnote C* (2,8) farba týchto extraktov jasne viditeľná voľným okom a bola špecifikovaná ako červenofialová pre extrakt PRE a modrofialová pre extrakt KTE. Vodné extrakty PGE a GGE mali červenkastú a mierne oranžovú farbu a získané hodnoty sýtosti boli na úrovni 1,3. Pre túto farbu neboli tieto hodnoty voľným okom výrazne rozoznateľné.

2.8.2. Stanovenie farebných parametrov kozmetiky na základe extraktov

V posledných rokoch vznikla silná potreba vyvinúť nové farbivá prírodného pôvodu, najmä v potravinárskom a kozmetickom priemysle. V porovnaní s farbivami získanými synteticky môžu mať nižší negatívny vplyv na ľudské zdravie a životné prostredie [80]. Získané extrakty sa použili pri formulácii modelovej micelárnej kvapaliny na odličovanie. V každej formulácii boli použité v koncentrácii 1 percento. Výsledky farebných parametrov modelovej kozmetiky sú uvedené v tabuľke 6.

Bolo pozorované, že pridanie 1% vodného extraktu z PRE, PGE, CTE a GGE výrazne ovplyvnilo farbu odličovača. Každá vzorka bola jasne viditeľná voľným okom vo farbe. Extrakt PRE zmenil farbu kozmetiky na oranžovú a extrakt PGE, CTE a GGE ju zmenil na žltú.

Možnosť použitia analyzovaných extraktov ako potenciálnych farbív potvrdzujú pomerne vysoké hodnoty △Odličovač s extraktom/základový odličovač, čo poukazuje na výraznú zmenu farby modelovej kozmetiky s pridaním extraktu oproti porovnaní k základnej vzorke (bez pridania extraktov). Literárne údaje [73] ukazujú, že ak sú hodnoty AE vyššie ako 5, farba je vnímaná nahou Evou a vnímaná ako farebný efekt. Pre odličovače obsahujúce extrakty PRE, KTE a CTE sa získali hodnoty AE 8,83, 9,17 a 8,14. V prípade produktov s extraktmi PGE a GGE nebol pozorovaný významný vplyv extraktu na farbu prípravku. Hodnoty AE sú v rozsahu 2.{12}}.82. To znamená, že rozdiel vo farbe je rozpoznateľný iba skúseným pozorovateľom [80,81].

3. Materiály a metódy

3.1. Rastlinný materiál a postup extrakcie

Rastlinným materiálom použitým pri výskume boli suché kvety P. rhoeas L., P. granatum L., C.ternatea L., C.tinctorius L. a G.globosa L., ktoré boli získané z miestneho bylinného obchodu. . Proces extrakcie sa uskutočnil v ultrazvukovom kúpeli (Digital Mgtrasonic Cleaner, Berlín, Nemecko), ktorý sa uskutočnil pomocou metódy opísanej Yangom et al.[82]. Na prípravu vodných extraktov testovaných rastlín bolo použitých 10 gramov suchých kvetov a 100 g vody. Proces sa uskutočňoval počas 20 minút pri teplote miestnosti. Získané extrakty sa potom zhromaždili a trikrát prefiltrovali cez filtračný papier Whatman č. 1. Po filtrácii sa extrakty odparili za zníženého tlaku pri 40 °C. Zo sušených extraktov sa pripravil zásobný roztok s koncentráciou 100 mg/ml a skladoval sa v tme pri 4 stupňoch až do ďalšej analýzy. Používajú sa tieto skratky: PRE – extrakt z Papaver rhoeas, PGE – extrakt z Punica granatum, GGE – extrakt z Gomphrena globosa, CTE – extrakt z Carthamus tinctorius, KTE – extrakt z Clitoria ternatea.

3.2. Stanovenie bioaktívnych zlúčenín pomocou HPLC-UV-ESI-MS

Získané extrakty boli analyzované s cieľom určiť ich hlavné bioaktívne zlúčeniny pomocou HPLC (DionexUltiMate 300{{20}} RS Thermo Fisher Scientific, Sunnyvale, CA, USA), spojenej s hmotnostným spektrometrom (4000 QTRAP, AB Sciex, Concord, ON, Kanada), vybaveným elektrosprejovým ionizačným zdrojom (ESI) a trojitým kvadrupólovým lapačom iónov analyzátor. Chromatografická separácia bola dosiahnutá gradientovým systémom s reverznou fázou. Okrem toho, 100 x 4,6 mm chromatografická kolóna Kinetex 3,5 μm XB-C18 100 A s izobutylovými bočnými reťazcami a s TMS koncovou stacionárnou fázou používanou s podobným zložením ochrannej kolóny bola zakúpená od Phenomenex a udržiavaná pri 30 stupňoch . Binárny rozpúšťadlový systém obsahujúci 0,1 % (o/v) vodnú kyselinu mravčiu ako rozpúšťadlo A a metanol ako rozpúšťadlo B sa použil v gradientovom režime počas 19,1 min. Použité elučné podmienky boli nasledovné: 0.{19}},0 min 25-100 percent B,15.0-17,0 min 100 percent B,17.0-17,1 min. 100-25 percent B,17.1-19,1 min 25 percent B. Prietok mobilnej fázy bol 0,6 ml/min a objem vstreku bol 10 μl. Eluent sa monitoroval elektrosprejovým iónovým hmotnostným spektrometrom (ESI-MS) v režime negatívnych iónov a skenoval sa od m/z 20 do 1000 Da. Pre kvantifikačnú analýzu pracoval trojitý štvorpólový MS detektor v režime skenovania viacerých reakcií (MRM). Experimentálne boli stanovené optimálne podmienky hmotnostného analyzátora a výber iónov produktu pre jednotlivé zlúčeniny. Na tento účel sa zaviedli štandardné roztoky skúmaných zlúčenín (1 ng/ml) v zložení mobilnej fázy pomocou infúznej pumpy pracujúcej pri konštantnom dodávaní vzorky. Po uistení sa, že bol vybratý správny prekurzorový ión, sa pre každý prechod MRM optimalizovali deklastrovací potenciál (DP), vstupný potenciál (EP), výstupný potenciál zrážkovej bunky (CXP) a kolízna energia (CE) (tabuľka S1). Monitorovali sa dva prechody MRM, jeden na kvantifikáciu a jeden na potvrdenie. MS parametre boli nastavené nasledovne: kapilárna teplota 600 °C, clonový plyn pri 35 psi, nebulizačný plyn pri 60 psi a sušiaci plyn pri 50 psi. Na stanovenie bioaktívnych zlúčenín bolo použité napätie zdroja v zápornom ionizačnom režime -4500 V. Dusík bol použitý ako clonový a kolízny plyn. Analýza údajov bola spracovaná pomocou softvéru Analyst 1.5.1. Identifikácia vybraných zlúčenín sa uskutočnila pomocou molekulovej hmotnosti a fragmentov vstupov aniónov každej jednotlivej zlúčeniny a potvrdila sa fragmentáciou MS2. Identita deviatich zlúčenín bola určená spolu s ich chemickým vzorcom, deprotonovanými molekulárnymi iónmi a charakteristickými fragmentovými iónmi pre každý jednotlivý vrchol. Šesť zlúčenín sa kvantifikovalo na základe kalibračnej krivky vytvorenej s použitím plôch píkov najintenzívnejších MRM prechodov analytických štandardov. Linearita odozvy detektora pre kvantifikované zlúčeniny bola demonštrovaná injekciou kalibračných štandardov v ôsmich koncentračných hladinách v rozsahu od 0,01 ug/ml do 2 ug/ml. Kalibračné krivky boli lineárne s koeficientmi korelácie (R) väčšími ako 0,99. V prípade, že vzorky nespadali do lineárneho rozsahu CMS detektora, vzorky sa zriedili.

Analytické štandardy kyseliny chinovej, kyseliny galovej, kyseliny kávovej, kyseliny kafeoylchínovej (CQA, dva izoméry:3- a 5-CQA) a kvercetínu boli zakúpené od spoločnosti Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA ). Všetky použité štandardy boli analytickej kvality (2 Čistota väčšia alebo rovná 99 %).

Štandardné zásobné roztoky sa pripravili presným odvážením a rozpustením 20 mg každého štandardu v 10 ml metanolu kvality LC-MS, čím sa získala koncentrácia 2 mg/ml. Sériové riedenia po 2.{{10}} ug/ml, 1,5 ug/ml, 1.0 ug/ml, 0,5ug/ml,0 0,1 ug/ml, 0,05 ug/ml, 0,02 ug/ml a 0,01 ug/ml sa potom pripravilo s použitím metanolového roztoku stupňa LC-MS. Limit kvantifikácie (LOQ) bol definovaný ako 0,01 ug/ml.

LC-MS/MS test sa uskutočnil trojmo. Získané údaje boli prezentované ako priemer ± štandardné odchýlky.

3.3. Stanovenie antioxidačných vlastností

3.3.1.ABTS· plus Scavenging Assay

Najprv sa pripravil roztok ABTS zmiešaním 19,5 mg ABTS a 3,3 mg persíranu draselného so 7 ml fosfátového pufra (pH =7 0,4) a rozpustil sa 16 hodín v tme. Potom sa roztok zriedil na absorbanciu na úroveň približne 1.0. Absorbancie boli merané pri vlnovej dĺžke 入=734 nm. Ďalej sa 20 ml extraktov KTE, PGE, PRE, CTE a GGE (10 100 250 500 ug/ml) zmiešalo s 980 ml zriedeného roztoku ABTSe ​​plus a potom sa inkubovalo 10 minút v tme. V ďalšom kroku sa merala absorbancia pripravených vzoriek pri 入=734 nm pomocou UV/VIS spektrofotometra Aquamate Helion (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Ako slepý pokus bola použitá destilovaná voda. ABTS plus čistenie sa vypočítalo z rovnice (1):

kde: As—absorbancia vzorky; Ac—absorbancia kontrolnej vzorky. Merania sa uskutočňovali trojmo pre každú extrahovanú vzorku. Postup opísal Gawel-Beben et al. [83].

3.3.2. DPPH Radical Scavenging Assay

Schopnosť extraktov zachytávať voľné radikály bola stanovená metódou opísanou Brand-Williamsom a kol. [84]. Je založený na použití 1,1-difenyl-2-pikrylhydrazylového （DPPH） radikálu. Najprv sa 33 μl vodných roztokov extraktov v koncentráciách 100 ug/ml zmiešalo so 167 μl metanolového roztoku DPPH（4 mM） a prenieslo sa do 96-jamkovej platne, potom sa premiešalo trepaním. Potom sa merala absorbancia vzoriek pri vlnovej dĺžke 517 nm. Merania sa robili každých 5 minút počas 30 minút na spektrofotometri UV-VIS Filter Max入=5 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Pre každý extrakt sa uskutočnili tri nezávislé replikácie. Ako kontrola bola použitá voda s roztokom DPPH. Antioxidačná kapacita bola vyjadrená ako percento inhibície DPPH pomocou rovnice (2):

kde: As—absorbancia vzorky; Ac—absorbancia kontrolnej vzorky. Merania sa uskutočňovali trojmo pre každú extrahovanú vzorku.

3.3.3. Detekcia intracelulárnych hladín reaktívnych druhov kyslíka (ROS)

Na stanovenie schopnosti analyzovaných extraktov vytvárať intracelulárnu produkciu reaktívnych foriem kyslíka v bunkách HaCaT a BJ sa použilo fluorogénne farbivo H, DCFDA. Táto zlúčenina má schopnosť vstúpiť do buniek pasívnou difúziou, kde sa deacetyluje intracelulárnymi esterázami na nefluorescenčnú zlúčeninu. Ak sú v bunke prítomné reaktívne formy kyslíka, táto zlúčenina sa transformuje na vysoko fluorescenčný DCF. Na stanovenie intracelulárnej hladiny ROS v HaCaT a BJ sa bunky naočkovali na 96-jamkové platne. Potom sa bunky kultivovali v inkubátore počas 24 hodín. Médium DMEM bolo odstránené a nahradené 10 uM H2DCFDA（Sigma Aldrich, St.Louis, MO, USA） rozpusteným v médiu DMEM bez séra. Bunky HaCaT a BJ sa inkubovali v H, DCFDA počas 45 minút a potom sa inkubovali s extraktmi v koncentráciách∶ 100, 250 a 500 ug/ml. Bunky ošetrené 1 mM peroxidom vodíka (H202) sa použili ako pozitívne kontroly. Kontrolné vzorky boli bunky neošetrené testovanými extraktmi. Fluorescencia DCF sa merala každých 90 minút pomocou čítačky mikrodoštičiek FilterMax F5 (Thermo Fisher Scientific) pri maximálnej excitácii 485 nm a emisnom spektre 530 nm [85].

3.4. Hodnotenie inhibície matricových metalopeptidáz

3.4.1. Stanovenie antielastázovej aktivity

Na stanovenie možnosti inhibície matricovej metaloproteinázy, neutrofilnej elastázy (NE), sa použila fluorometrická súprava (Abcam, ab118971). Test sa uskutočnil v súlade s pokynmi pripojenými k súprave a postupom opísaným v Niziol-Lukaszewska et al. [86]. Analýzy sa uskutočňovali v štandardnej 96-jamkovej platni s čírym plochým dnom. Na analýzu boli použité rastlinné extrakty v koncentrácii 100 a 250 ug/ml. Spočiatku sa roztoky enzýmu NE, substrát NE a kontrola inhibítora (SPCK) pripravili podľa pokynov. Zriedený NE roztok sa pridal do všetkých jamiek a potom sa do nasledujúcich jamiek pridali testované vzorky, kontrola inhibítora a kontrola enzýmu (testovací pufer). Potom boli vzorky zmiešané a inkubované pri 37 stupňoch počas 5 minút. Medzitým sa pripravila reakčná zmes zmiešaním testovacieho pufra a NE substrátu. Zmes bola pridaná do každej jamky a dôkladne premiešaná. Fluorescencia sa merala okamžite pri excitačnej vlnovej dĺžke 入=400 nm a emisii 入=505 nm pomocou čítačky mikrodoštičiek (FilterMax F5, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) Schopnosť inhibovať NE aktivitu analyzovaného vzorky boli vypočítané z rovnice (3):

Konečným výsledkom bol aritmetický priemer troch nezávislých meraní.

3.4.2. Stanovenie anti-kolagenázovej aktivity

Na vyhodnotenie schopnosti získaných extraktov inhibovať aktivitu kolagenázy sa použila fluorometrická súprava (Abcam, Cambridge, UK, ab211108). Test sa uskutočnil v súlade s pokynmi pripojenými k súprave a postupom opísaným v Niziol-Lukaszewska et al. [86]. Analýzy sa uskutočňovali na štandardnej 96-jamkovej platni s čírym plochým dnom. Na analýzu boli použité rastlinné extrakty v koncentrácii 100 a 250 ug/ml. Najprv sa kolagenáza (COL) rozpustila v pufri na analýzu kolagenázy (CAB). Potom sa analyzované vzorky pridali do COL a CAB. Kontrolné vzorky inhibítora boli pripravené zmiešaním inhibítora kolagenázy (1,10-fenantrolínu (80 mM) s kolagenázou a CAB pufrom. Enzýmové kontrolné jamky boli pripravené zmiešaním zriedeného COL s CAB. CAB pufor sa použil ako kontrola pozadia Potom boli vzorky inkubované pri izbovej teplote 15 min.. Reakčná zmes bola pripravená zmiešaním kolagenázového substrátu s CAB. Takto pripravená reakčná zmes bola pridaná ku všetkým analyzovaným vzorkám a dôkladne premiešaná.Potom bola meraná fluorescencia pri excitačná vlnová dĺžka 490 nm a emisia 520 nm Meranie prebiehalo v kinetickom režime 60 min pri 37 C. Schopnosť inhibovať aktivitu COL získaných extraktov bola vypočítaná pomocou rovnice (4):

3.5. Stanovenie protizápalových vlastností

3.5.1. Inhibícia denaturácie bielkovín

Proteinázová inhibičná aktivita extraktov PRE, PGE, KTE, CTE a GGE bola uskutočnená podľa metódy Sakat et al.[87], ktorá bola modifikovaná Gunathilake et al.[88]. V stručnosti, reakčný roztok (2 ml) pozostával z 1 ml 1 percenta trypsínu v 2 {{1{12}}}} mM Tris-HCl pufri (pH 7,4) a 1 ml testovanej vzorky ({{17} },02 ml extraktu 0,980 ml vody). Roztok sa inkuboval (37 stupňov počas 5 minút) a potom sa pridal 1 ml 0,8 percentného (w/v) kazeínu a zmes sa ďalej inkubovala počas 20 minút. Na konci inkubácie sa na dokončenie reakcie pridali 2 ml 70 % kyseliny chloristej. Zmes sa odstredila a merala sa absorbancia supernatantu pri 210 nm proti pufru ako slepému pokusu. Ako kontrola sa použil roztok fosfátového pufra. Percento inhibície denaturácie proteínu sa vypočítalo pomocou nasledujúceho vzorca:

kde A1= absorpcia kontrolnej vzorky a A2= absorpcia testovanej vzorky.

3.5.2. Inhibícia aktivity lipoxygenázy

Schopnosť získaných extraktov inhibovať aktivitu lipoxygenázy bola stanovená pomocou metódy opísanej Sarvesvaranom a kol. 【89】. Najprv sa 10 μl rastlinných extraktov v rôznych koncentráciách (100, 250 a 500 ug/ml）) zmiešalo na 96-jamkovej platni so 160 μl 100 mM PBS a 20 μl roztoku sójovej lipoxygenázy (167 U/ ml). Vzorky sa inkubovali pri 25 stupňoch počas 10 minút a po tomto čase sa pridalo 10 ul sodnej soli kyseliny linolovej na spustenie reakcie. Potom sa merala absorbancia vzoriek pri 234 nm počas 3 minút každú minútu pomocou čítačky FilterMax F5microplate (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Ako pozitívna kontrola sa použil diklofenak. Percento inhibície aktivity lipoxygenázy sa vypočítalo z rovnice (6):

kde: Ako je absorbancia testovanej vzorky, Ac je absorbancia negatívnej kontroly.

Konečným výsledkom bol aritmetický priemer troch nezávislých meraní.

3.6. Analýza cytotoxicity

3.6.1. Bunková kultúra

V tejto štúdii sa použili dve kožné bunkové línie: normálne ľudské keratinocyty (HaCaT) a fibroblasty (BJ). HaCaT boli získané od CLSCell Lines Service (CLS Cell Lines Service GmbH, Eppelheim, Nemecko) a BJ z American Type Culture Collection ( Manassas, VA, USA). Bunky boli pestované v Dulbecco's Modification of Eagle's Medium (DMEM, Biological Industries, Cromwell, CO, USA) s pyruvátom sodným, L-glutamínom a vysokým obsahom glukózy (4,5 g/l). Médium bolo tiež obohatené o 10 percent fetálneho hovädzieho séra (Gibco, Waltham, MA, USA) a 1 percento o antibiotiká (100 U/ml penicilínu a 1000 ug/ml streptomycínu, Gibco), aby sa zabránilo mikrobiálnej kontaminácii. Bunky boli pestované v inkubátore pri 37 stupňoch vo zvlhčenej atmosfére 95 percent vzduchu a 5 percent oxidu uhličitého.

3.6.2. Alamar Blue Assay

Keď kultivované bunky (HaCaT a BJ) dosiahli požadovanú konfluenciu, médium DMEM sa odsalo do kultivačných fliaš. Bunky prichytené na dne sa dvakrát premyli sterilným fyziologickým roztokom pufrovaným fosfátom. Bunková vrstva sa oddelila trypsínom a potom sa bunky umiestnili do čerstvého média DMEM. Bunky boli nanesené na 96-jamkové platne s plochým dnom (VWR, Radnor, PE, USA) a po pripojení na dno platní boli bunky ošetrené extraktmi (100, 250 a 500 ug/ml). Bunky sa inkubovali 24 hodín.

Test cytotoxicity sa uskutočnil pomocou testu Alamar Blue (Sigma, R7017, Life Technologies, Bleiswijk, Holandsko). Po inkubácii sa do jamiek pridal roztok resazurínu s koncentráciou 60 uM, potom sa platne umiestnili do inkubátora pri 37 stupňoch na 2 hodiny. Po tomto čase sa zmerala fluorescencia (入=570nm). Každá koncentrácia extraktu sa uskutočnila v troch opakovaniach.

3.6.3. Test absorpcie neutrálnej červenej

Test neutrálnej červenej absorpcie je druhý test používaný na stanovenie cytotoxicity PRE, PGE, KTE, CTE a GGE. Najprv sa 96-pripravili platne s plochým dnom, ako je opísané v predchádzajúcej časti. Po 24 hodinách expozície buniek extraktom sa bunky odsali a nahradili neutrálnym červeným farbivom (40 ug/ml) a inkubovali sa 2 hodiny. Po tomto čase sa bunky premyli fyziologickým roztokom pufrovaným fosfátom. V ďalšom kroku sa do jamiek pridal odfarbovací pufor (150 μl). Potom sa stanovil príjem neutrálnej červenej dve meraním optickej hustoty (OD) pri 540 nm. Každá koncentrácia extraktu sa uskutočnila v troch opakovaniach.

3.7. Stanovenie ochranného slnečného faktora (in vitro)

Ochranný slnečný faktor (SPF) bol stanovený meraním absorbancie vodného roztoku extraktov v koncentráciách 10 ug/ml a 50 ug/ml v rozsahu vlnových dĺžok od 290 do 320 nm v 5-nm intervaloch. Zo získaných výsledkov sa SPF vypočítal z Mansurovej rovnice [90]: kde∶ EE（λ） – spektrum erytémového účinku, I（入） – spektrum slnečnej intenzity, ABS（入） – absorbancia opaľovacieho prípravku, CF – korekčný faktor（=10）, E（N）×I（λ） – použili sa hodnoty určené Sayre [91].

3.8. Transepidermálna strata vody (TEWL) a meranie hydratácie pokožky

Merania TEWL a hydratácie pokožky sa uskutočňovali pomocou sondy TEWAmeter TM 300 a sondy Corneometer CM 825 pripojenej k adaptéru MPA (Courage plus Khazaka Electronic, Köln, Nemecko）. Štúdie sa zúčastnilo päť dobrovoľníkov. Na predlaktí kože, bolo označených šesť oblastí (veľkosť 2 × 2 cm), na piatich miestach bolo aplikované množstvo 0,2 ml testovaných rastlinných extraktov, na šiestom mieste bola kontrola (neošetrená žiadnymi vzorkami) po 60 a 360 min. Konečným výsledkom bol aritmetický priemer (od každého dobrovoľníka) piatich nezávislých meraní (hydratácia pokožky) a 20 meraní (TEWL).

3.9. Príprava modelovej kozmetiky (odstraňovač make-upu) s obsahom extraktov

Bola pripravená modelová kozmetika (odličovač). Všetky použité komponenty boli v súlade s požiadavkami EcoCert a COSMOS. Formulácia je uvedená v tabuľke 7.

Produkt bol vyrobený zmiešaním zložiek (od položky 1 do položky 6) pri teplote miestnosti, kým sa nezískala homogénna kvapalina. V poslednom kroku sa upravilo pH formulácie. Odličovač bol rozdelený na porcie. Do každej dávky sa pridalo 1 percento zásobných roztokov extraktu a dôkladne sa premiešalo.

3.10. Stanovenie farebných parametrov výťažkov a kozmetických prípravkov (odstraňovačov make-upu) obsahujúcich výťažky

Vzorky extraktov a kozmetiky s extraktmi boli testované pri izbovej teplote, 48 hodín po ich príprave. Na vyhodnotenie parametrov farieb (súradnice CIELAB) sa použil CHROMA METER CR-400 (Konica Minolta, Sensing Inc., Tokio, Japonsko). Systém CIELAB bol definovaný Medzinárodnou komisiou pre osvetlenie v roku 1978. Je založený na troch farebných atribútoch: L*, a*,b, kde L* je premenná jasu úmerná hodnote v Munsellovom systéme a a* a b* sú chromatické súradnice. Súradnice a* a b* označujú polohy na osi červená/zelená a žltá/modrá (plus a=červená, -a=zelená; plus b=žltá, - b =modrá).

Na základe získaných údajov: L*, a* a b* sa vypočítali nasledujúce farebné parametre: sýtosť (C*) a odtieň (h). Boli použité nasledujúce rovnice:

4. Závery

Na základe získaných výsledkov možno usúdiť, že testované rastlinné extrakty vykazujú viacero pozitívnych vlastností, vďaka ktorým je možné ich použiť pri výrobe kozmetiky ako ich bezpečnú a bioaktívnu zložku. Ukázalo sa, že tieto rastliny sú bohatým zdrojom polyfenolov, čo im dodáva antioxidačné vlastnosti. Najlepšiu schopnosť vychytávať voľné radikály preukázala PRE, čo je zrejme tým, že obsahuje najviac polyfenolov v porovnaní s inými rastlinami. PGE a PRE preukázali najlepšiu schopnosť znižovať produkciu ROS v bunkách. Okrem toho rastliny nevykazujú žiadnu cytotoxickú aktivitu. Všetky testované extrakty vykazovali inhibičný účinok na enzýmy elastázu a kolagenázu, pričom najväčší inhibičný účinok mali P. granatum a GGE. To môže naznačovať, že tieto rastliny môžu byť použité v kozmetike ako látky, ktoré spomaľujú procesy starnutia. Okrem toho získané výsledky naznačujú, že tieto rastliny majú protizápalové vlastnosti. V tomto prípade sa ako najlepšie javili CTE a KTE. KTE a PGE preukázali ochranný účinok proti UV žiareniu aj pri nízkych koncentráciách. Pri vyšších koncentráciách mali všetky rastliny ochranný účinok proti UV žiareniu. Ďalej mali rastliny pozitívny vplyv na hydratáciu pokožky a redukovali transepidermálnu stratu vody. Extrakty PRE, KTE a CTE možno použiť ako účinné farbivá v kozmetických výrobkoch. Modelová kvapalina na odličovanie s obsahom vyššie uvedených extraktov sa vyznačovala intenzívnou a stabilnou farbou v priebehu času. Farbu kozmetiky s výťažkami PGE a GGE si všimnú len skúsení pozorovatelia a výrazne sa nelíšia od slepej vzorky kozmetiky, bez pridania extraktu. Vzhľadom na všetky získané výsledky možno konštatovať, že Papaver rhoeas, Clitoria ternatea a Carthamus tinctorius môžu byť úspešne použité ako zdroje žltých, oranžových, modrých a fialových farbív pri výrobe kozmetiky, ktorá bude bezpečná na použitie a čo viac, bude mať pozitívny vplyv na pokožku.

Tento článok je extrahovaný z Molecules 2022, 27, 922. https://doi.org/10.3390/molecules27030922 https://www.mdpi.com/journal/molecules