Graham-2023-Učenie vyvoláva jedinečný prepis

Abstrakt:
Učenie môže vyvolať neurofyziologickú plasticitu v sluchovej kôre vo viacerých časových mierkach. Trvalé zmeny sluchovej kortikálnej funkcie, ktoré pretrvávajú dni, týždne alebo dokonca celý život, vyžadujú génovú expresiu vyvolanú učením. De novo transkripcia je skutočne molekulárnym determinantom toho, či sa prechodné skúsenosti transformujú na dlhodobé spomienky s trvalým vplyvom na správanie.

S neustálym rozvojom vedy a techniky sa v priebehu ľudského života objavili mnohé magické životné javy, z ktorých najcennejšou pre výskum je pamäť. Pamäť je dôležitou súčasťou pokročilej ľudskej nervovej činnosti a je tiež záznamom a akumuláciou rôznych udalostí, ktoré sa udiali od evolúcie človeka. Existuje teda vzťah medzi génovou expresiou a pamäťou? Odpoveď je áno.

Po prvé, vplyv génov na pamäť je zrejmý. Môže regulovať expresiu rôznych molekúl a proteínov súvisiacich s pamäťou prostredníctvom jednonukleotidových polymorfizmov (SNP) a iných metód. To môže ovplyvniť efektivitu komunikácie medzi neurónmi, a tým ovplyvniť kognitívne, koncepčné, emocionálne a iné charakteristiky človeka, čo naznačuje kvalitu pamäti.

Po druhé, pamäť môže mať tiež určitý vplyv na génovú expresiu. V procese nášho učenia, pamäti a myslenia nejde len o zmeny v nervovej aktivite mozgu, ale aj o reguláciu a zásahy mnohých génov a molekúl. Regulácia týchto génov a molekúl zaznamená stopy zodpovedajúce pocitom a zážitkom, ktoré existujú v našej dlhodobej pamäti, a nakoniec sa uložia do génov.

Napokon existuje vzájomná závislosť medzi pozitívnym prístupom a schopnosťou dlhodobej pamäti. Šťastná nálada nám môže pomôcť sústrediť sa viac a sústrediť sa počas procesu učenia a myslenia, čím nám pomáha zlepšiť pamäť. Dlhodobá zámerná pamäť môže tiež podporovať vytváranie nových nervových spojení a štruktúr v mozgu, čo je tiež veľmi užitočné pre budúce učenie a pamäť.

Preto môžeme konštatovať, že existuje korelácia medzi génovou expresiou a pamäťou. Svoju pamäťovú schopnosť môžeme podporovať a zlepšovať prostredníctvom zámernej pamäte, optimizmu a pozitívneho myslenia, čo nám tiež môže pomôcť dosiahnuť lepšie fyzické a duševné zdravie. Len tak môžeme lepšie slúžiť spoločnosti a ľudskému rozvoju. Je vidieť, že potrebujeme zlepšiť pamäť a Cistanche deserticola môže výrazne zlepšiť pamäť, pretože Cistanche deserticola je tradičný čínsky liečivý materiál, ktorý má mnoho jedinečných účinkov, jedným z nich je zlepšenie pamäte. Účinnosť mletého mäsa spočíva v rôznych aktívnych zložkách, ktoré obsahuje, vrátane kyselín, polysacharidov, flavonoidov atď. Tieto zložky môžu podporovať zdravie mozgu rôznymi spôsobmi.

Kliknite na vedieť doplnky na zlepšenie pamäte

Sluchové kortikálne gény, ktoré podporujú sluchové učenie, pamäť a získané zvukovo špecifické správanie, sú však veľkou neznámou. Táto správa je prvou, ktorá identifikuje zmeny v génovej expresii indukovanej učením v rámci sluchovej kôry, o ktorej sa predpokladá, že je základom tvorby sluchovej pamäte v celom genóme. Bioinformatické analýzy profilov genetického obohatenia zo sekvenovania RNA identifikovali biologické dráhy, ktoré zahŕňajú cholínergické synapsie a interakcie neuroaktívnych receptorov.

Zistenia charakterizujú kľúčové kandidátne efektory, ktoré sú základom zmien v kortikálnej funkcii, ktoré podporujú tvorbu dlhodobej sluchovej pamäte v mozgu dospelých. Identifikované molekuly a mechanizmy sú potenciálnymi terapeutickými cieľmi na uľahčenie dlhodobých a zvukovo špecifických zmien sluchovej funkcie v dospelosti a sú teraz prvoradé pre budúce výskumy zamerané na gény.

Rukopis:

Dobre akceptovaná koncepcia v oblasti učenia a pamäte je, že spomienky sa ukladajú tam, kde sa spracúvajú (Nadel & Hardt, 2011). Biologické udalosti známe ako konsolidácia pamäte môžu stabilizovať prechodné neurálne reprezentácie vyvolané zmyslovým zážitkom (Lechner, Squire & Byrne, 1999; McGaugh, 2000; Dudai, 2012). Základnými a evolučne zachovanými mechanizmami, ktoré iniciujú konsolidáciu pamäte, sú transkripcia a translácia, definované ako aktívna expresia génov a ich následných proteínových produktov (Alberini & Kandel, 2014; Costa-Mattioli et al., 2009).

Predpokladali sme, že učenie zvukovej diskriminácie indukuje de novo génovú expresiu v sluchovej kôre. Vysoko špecifické znázornenia zvukových podnetov môžu prežiť pominuteľnosť skúseností (sekundy a minúty) konsolidáciou do dlhodobej pamäte (hodiny až dni), ktorá neskôr riadi správanie na základe zvuku. Zatiaľ čo sa predpokladá, že výrazné regionálne transkriptomické profily sú zodpovedné za konsolidáciu pamäte (Katzman, et al., 2021), transkripčné udalosti vyvolané učením, ktoré podporujú tvorbu pamäte v centrálnom sluchovom systéme, sú veľmi nedostatočne opísané.

Naproti tomu sluchová kôra bola výnimočne dobre opísaná v štúdiách sluchového učenia a pamäti na úrovni neurofyziologických zmien najmä v receptívnych poliach a tonotopických mapách (Schreiner &Polley, 2014; Weinberger NM, 2015; Pienkowski & Eggermont, 2011), kortiko- kortikálna a kortiko-fugálna konektivita (Souffi a kol., 2021; Lesicko & Geffen, 2022; Schreiner & Polley, 2014; Liu a kol., 2011; Xiong, Znamenskiy a Zador, 2015), a to aj vo viacerých časových mierkach (Froemke & Martins , 2011; Froemke & Schreiner, 2015; Fritz, Elhilali, David a Shamma, 2007; Tchernichovski & Margoliash, 2013). Okrem toho sú neurofyziologické zmeny spojené so správaním, napr. pre činnosť zameranú na podnety (Letzkus, Wolff, & Lüthi, 2015), pozornosť (Fritz a kol., 2007; Elhilali a kol., 2007) a pamäť na zvukové signály (Bieszczad & Weinberger 2010; Grosso a kol., 2015; Aschauer & Rumpel, 2016; Concina, Renna, Grosso a Sacchetti, 2019; Letzkus, Wolff, & Lüthi, 2015; Ghosh & Zador, 2021).

Desaťročia dôkazov o neurofyziologickej plasticite vyvolanej učením v sluchovej kôre ukázali spoločné behaviorálne charakteristiky sluchovej pamäte (Weinberger 2007a; 2007b), čo z nej robí top kandidátsku oblasť na konsolidáciu sluchovej pamäte. Bioinformatickým skúmaním sluchovej kôry využívame aj nestrannú príležitosť na odhalenie spoločných alebo odlišných biologických strážcov neuroplasticity v celom mozgu, ktoré sú základom adaptívnej sluchovej funkcie. Zo širšej perspektívy môže regionálne transkriptomické profilovanie viesť k úplnejšiemu pochopeniu toho, ako je zmyslový systém modifikovaný skúsenosťou v službe pamäti.

Učením indukované transkriptomické profily identifikované v sluchovej kôre môžu potvrdiť, rozšíriť alebo viesť k novým biologickým modelom procesov, ktoré podporujú alebo zhoršujú adaptívne sluchové spracovanie. Konsolidácia sluchovej pamäte je pravdepodobne výsledkom zmien v génovej expresii závislých od skúseností, ktoré ovplyvňujú bunkové funkcie v rámci sluchovej kôry, čo zase podporuje trvalé zmeny neurofyziologickej citlivosti vyvolanej zvukom, ktorá mení správanie vyvolané zvukom.

Na identifikáciu transkriptov vyvolaných učením sa na vzorkách anatomicky definovanej sluchovej kôry (Bregma -3.10 mm, Interaurálna 6,90 mm; Paxinos & Watson, 2007) uskutočnila analýza profilovania expresie pomocou RNAsekvenovania (RNAseq). ) od dospelých jedincov s obmedzeným prístupom k vode trénovaných na bar press až po čisté tóny za odmenu vo vode. Reakcie na cieľovú čistú tónovú frekvenciu (5,0 kHz; 65 dB SPL) viedli k odmene, zatiaľ čo reakcie na necieľové (11,5 kHz; 65 dB SPL) boli bez odmeny a spustili časový limit, ktorý predĺžil čas do ďalšej skúšky.

Táto úloha dvojtónovej diskriminácie (2TD) nie je z hľadiska vnímania náročná; akustické frekvencie sú od seba vzdialené viac ako oktávu a hlodavce ich ľahko rozlíšia (Talwar & Gerstein, 1998). Výzva v správaní bola skôr asociatívna: výkon 2TD si vyžaduje pamäť, pre ktorý tón je spojená odmena (vs. žiadna odmena). Cvičené potkany (N=8) boli usmrtené po troch po sebe nasledujúcich denných 45-minútových 2TD tréningoch a porovnané so skupinou zvukovo naivných potkanov (N=4). Toto je čas na začiatku tréningu, keď zvieratá stále získavajú úlohu 2TD. Skoré získavanie úloh bolo zamerané na zachytenie počiatočných transkripčných udalostí vyvolaných učením, ktoré pripravili pôdu pre neskoršie zvýšenie výkonu 2TD pozorovaného počas týždňov tréningu.

Napríklad priemerný výkon bol nad šancou, ale iba 66±7,81 % po 3 dňoch, v porovnaní s väčším alebo rovným 90 % po predĺženom tréningu (Shang, Bylipudi, &Bieszczad, 2019). Aby sme využili príležitosť identifikovať expresiu génov relevantných pre úspešnú zvukovo špecifickú asociatívnu pamäť, využili sme inhibítor HDAC, ktorý sa zameriava na sepigenetickú reguláciu génovej expresie závislej od aktivity pri učení a tvorbe pamäte (McQuown, et al., 2011; Kwapis, et al., 2017; Malvaez, et al., 2012). Dôležité je, že desaťročie práce ukázalo, že inhibícia HDAC môže uľahčiť neurofyziologickú plasticitu vyvolanú učením vo zvukovo vyvolaných kortikálnych reakciách (vo vzťahu k vehikulu) a zlepšiť sluchové diskriminačné správanie (Bieszczad a kol., 2015; Phan a kol., 2017; Shang, Bylipudi, & Bieszczad, 2019; Rotondo & Bieszczad, 2020; Rotondo & Bieszczad 2021a; 2021b) vrátane neľudských (Gervain, et al., 2013).

Polovica trénovaných zvierat bola liečená HDAC-inhibítorom, RGFP966 (N=4; 10 mg/kg, ApexBio, kat#A8803; sub. cu. injekcia) , zatiaľ čo druhá polovica bola identicky trénovaná, ale bol im podaný roztok vehikula (N=4; zodpovedajúci objem, subcu. injekcia; obr. 1a). Neexistovali žiadne rozdiely vo výkone 2TD medzi skupinami v čase zberu mozgov (RGFP966: 61±5,0 % vs. Vehikulum: 71±7,0 %; t(5,9166)=-1,21, p=0,272 ; Welchov t-test). Mozgy boli okamžite odobraté a rýchlo zmrazené v časovom bode konzistentnom s vrcholovou koncentráciou inhibítora v sluchovej kôre, jednu hodinu po injekcii buď HDAC inhibítora alebo vehikula po relácii (Bieszczad et al., 2015).

Tu uvedené zistenia sú prvé, ktoré identifikujú transkriptomický profil asociatívneho učenia v rámci sluchovej kôry. Učenie sa v úlohe dvojtónovej diskriminácie vyvolané zmenami v úrovniach transkripcie stoviek génov (v porovnaní so zvukovo naivnými) (obr. 1b). Algoritmus hierarchického zhlukovania ukázal, že gény sú jedinečne upregulované alebo downregulované, čo odhaľuje komplexnú sieť kortikálnych génových expresných udalostí vyvolaných sluchovým učením (obr. 2a).

Analýzy obohatenia (iPathwayGuideTM; metóda Impact Analysis) identifikovali cholinergickú synapsiu (diferenciálne exprimované gény (DEG) / všetky gény (ALL): 22/101; p=0.004, Bonferronicorrection) ako najvyššiu biologickú dráhu (tabuľka 1) . Tento výsledok je v súlade s výskumom od 90. rokov 20. storočia, ktorý zdôrazňuje dostatočnosť cholinergnej signalizácie v sluchovej kôre pre neurofyziologickú plasticitu a súvisiace sluchové správanie (Froemke & Martins, 2011; Weinberger, 2003; Bakin & Weinberger, 1996; Kilgard & Merzenich, 1998). Úrovne transkriptov indukované učením pri HDAC-inhibícii boli buď zosilnené rovnakým smerom (ďalším zvýšením alebo ďalším znížením jedinečných hladín génového transkriptu) (obr. 2b) alebo otupené v porovnaní so samotným učením (obr. 2c). Jednou z najlepších biologických dráh za týchto podmienok bola interakcia neuroaktívny ligand-receptor (DEG/ALL: 30/194; p=0.016; tabuľka 1), ktorá zahŕňala efektory rozhodujúce pre nervovú aktiváciu.

Ďalšou hlavnou cestou bola interakcia receptora extracelulárnej matrice (ECM-receptor) (DEG/ALL: 14/69; p=0 0,04; tabuľka 1). Komponenty ECM sú rozhodujúce pre kortikálnu plasticitu a konsolidáciu pamäte (Happel a kol., 2014; Banerjee, a kol., 2017; El-Tabbal, a kol., 2021; Sonntag, a kol., 2015). Tieto dráhy ponúkajú potenciálne alternatívy, možno komplementárne, k cholinergnej signalizácii, ktorá môže uľahčiť trvalé zmeny v sluchovej funkcii závislé od skúseností (Ji, Gao, & Suga, 2001; Luo & Yan, 2013; Metherate, 2011). Iné gény, ktorých expresia sa zmenila sluchovým učením, ale nie ďalej s inhibíciou HDAC, pravdepodobne súviseli s procesnými podmienkami úlohy, a nie s asociatívnou pamäťou špecifickou pre zvuk. Napríklad bola identifikovaná signálna dráha apelínu (DEG/ALL: 20/116; p=0.0005), ktorá je dôležitá v mozgu pre homeostatickú reguláciu príjmu vody (Hu, et al., 2021). Priame porovnanie hladín transkriptov medzi dvoma skupinami trénovaných potkanov (učenie sa s inhibíciou HDAC alebo bez nej) ukázalo len veľmi málo jedinečne diferencovane exprimovaných génov (DEG).

Prahová hodnota, ktorá sa zreteľne používa na identifikáciu najpravdepodobnejších stupňov (p =0 0,05), zistila, že iba Adamts13, U6, Rexo4 a Cabin1 boli vyjadrené rozdielne (obr. 2d). Zdá sa teda, že hlavný účinok inhibície HDAC modulovať expresiu génov indukovanú sluchovým učením za normálnych podmienok, skôr než novo získavať jedinečné gény na zachovanie zvukovo špecifickej pamäte. Tieto zistenia spoločne ukazujú, že v sluchovej kôre na začiatku tréningu dochádza k rozsiahlym transkriptomickým zmenám, keď sa dospelé zvieratá učia rozlišovať asociatívne vzťahy medzi zvukovými podnetmi. Spolu so zavedenými neurofyziologickými a behaviorálnymi správami o inhibícii HDAC na podporu sluchovej funkcie tieto zistenia podporujú taktiku použitia inhibítora HDAC na rozlíšenie génov, ktorých expresia určuje úspešnosť tvorby sluchovej pamäte.

Niekoľko záujmových génov (GOI) sa vybralo z inbiologických ciest analýzy obohatenia, aby sa potvrdilo sekvenovanie celého genómu s prístupom cieleným na gény. Vzorky sa odobrali zo samostatných kohort, ktoré replikovali dve skupiny trénovaných a liečených zvierat v rovnakom ranom štádiu. tréningový časový bod (tj jednu hodinu po treťom 2TD tréningu) na použitie pri analýze génovej expresie pomocou kvantitatívnej polymerázovej reťazovej reakcie v reálnom čase (qRT-PCR). V replikovaných kohortách neboli žiadne rozdiely vo výkonnosti 2TD (RGFP9661: 61±5.0% vs. RGFP9662: 67±6.0%; t(8,441)=-0,834, p {{20}},4274; a Vozidlo1:71±6.0% vs. Vozidlo2: 74±3,0%; t(4,0809)=-0,444, p {{ 34}}.6796; Welchov t-test).

Prvým GOI bol Egr1, dobre preštudovaný, od aktivity závislý „okamžitý skorý gén“, o ktorom je známe, že vrcholí v prvých hodinách učenia a je kritický pre tvorbu pamäte (Duclot & Kabbaj, 2017). Bol to gén indukovaný toplearningom s potvrdenou zvýšenou expresiou, ktorý bol podobne zosilnený inhibíciou HDAC v samostatnej skupine zvierat v štúdii zameranej na gén (obr. 3). To isté platilo pre Per2, gén podieľajúci sa na regulácii cirkadiánnych rytmov a serotonínergných dráh v mozgu (Bae, a kol., 2001; Albrecht, a kol., 2001; Cuesta, a kol., 2009; Reh, a kol. ,2020). Per2 je súčasťou rodiny „hodinových génov“, ktorá je spojená s moduláciou HDAC v iných oblastiach mozgu (Kwapis, et al., 2018) a môže mať úlohu aj v sluchovej funkcii (Reh et al., 2020). Naopak, niektoré GOI identifikované v celom genóme boli potvrdené len čiastočne.

Chrna7 kóduje podjednotku dynamického nikotínového acetylcholínového receptora (nAChR), o ktorej sa zistilo, že je regulovaná nadol sluchovým učením v súlade s neurofyziologickými dôkazmi (Takesian, et al., 2018; Kuchibhotla, et al., 2017). Očakávali sme teda, že štúdia zacielená na gén potvrdí down-reguláciu Chrna7 u všetkých zvierat trénovaných 2TD, ale down-regulácia bola zjavná len u zvierat ošetrených vozidlom, ktoré sa naučili 2TD bez inhibície HDAC. Ďalšie vybrané GOI boli z rodiny sirotských nukleárnych receptorov Nr4a, Nr4a1 a Nr4a2, čo sú okamžite gény, o ktorých sa uvádza, že sú nevyhnutné na propagáciu následných účinkov selektívneho cieľa HDAC RGFP966 v iných oblastiach mozgu (McQuown a kol., 2011; Kwapis a kol. ., 2019).

V súlade s predchádzajúcimi správami o regionálnych rozdieloch v génovej expresii rodiny Nr4a závislých od úlohy (McNulty, et al., 2012), Nr4a1, ale nie Nr4a2, bol v sluchovej kôre po sluchovom učení up-regulovaný. Iné DEG, Htr1a alebo Adamts13, neboli potvrdené génovo zacielenou štúdiou pravdepodobne kvôli rozdielom v známych variantoch transkriptov, ktoré nezistili naše špeciálne navrhnuté sondy zacielené na gén, alebo kvôli chybe typu I, alebo jemným rozdielom v správaní medzi trénovanými kohortami zvierat, ktoré v 2TD výkonových meraniach zostala nezistená. Skúmali sme tiež Lynx1, gén s dlhou históriou funkcie na opätovné otvorenie plasticity podobnej „kritickému obdobiu“ v senzorickej kôre (Morishita et al., 2010), pravdepodobne jeho pôsobením na cholinergnú a serotonergnú moduláciu (Takesian, et al. , 2018). Avšak v súlade s predchádzajúcimi správami o celom genóme, ktoré zlyhali pri jeho detekcii (Kalish, et al., 2020), nebolo zistené ani v našom súbore údajov RNAseq, ani v štúdii zameranej na gén.

Aj keď zostáva výzvou určiť, či sa nezrovnalosti dajú vysvetliť skutočnou biologickou alebo individuálnou variabilitou medzi zvieratami alebo v dôsledku technickej variability s nízkym výskytom alebo transkriptov exprimujúcich špecifický typ bunky, uvádzame výnimočne konzistentné výsledky pre niektoré GOI. Keďže expresia Chrna7, Egr1 a Per2 vyvolaná učením je konzistentná medzi prístupmi zameranými na gény a celý genóm a medzi rôznymi kohortami trénovaných zvierat, je logické, že tieto gény môžu byť najzákladnejšími hráčmi pre trvalé zmeny. sluchovú funkciu a pamäť a sú teraz prvoradé pre budúce skúmanie.

Zistenia spoločne odhaľujú dynamickú transkripčnú krajinu v sluchovej kôre dospelých, ktorá by mohla podporovať vznikajúcu sluchovú funkciu v neurofyziológii a správaní. Vzhľadom na rastúce dôkazy o epigenetických kontrolách funkcie senzorického systému (porovnaj Shang & Bieszczad, 2022) je vzrušujúce zvážiť ako epigenetické mechanizmy zohrávajú úlohu pri vyrovnávaní stability so skúsenosťou závislou plasticitou sluchových kortikálnych okruhov. Napríklad súčasný súbor údajov pre celý genóm tiež identifikoval učením indukované zníženie expresie arepresívnej históndeacetylázy, Hdac9, ktoré chýbalo pri inhibícii HDAC.

Je lákavé okrem účinku zníženej expresie HDAC9 aj účinku farmakologickej inhibície HDAC na podporu transkripcie indukovanej učením. Ďalšia dôležitá trieda epigenetických regulátorov mení skôr DNA ako históny. Príkladmi sú Tet1 a Gadd45b, ktoré ovplyvňujú metyláciu DNA (Bayraktar & Kreutz, 2018) a zistilo sa, že sú regulované nadol a nahor s učením pod inhibíciou HDAC. Ďalej sa trieda mikroRNA javila ako najvyššia biologická dráha indukovaná učením s HDAC-inhibíciou (pozri tabuľku 1), ktoré získali trakciu v teréne ako kľúčové epigenetické regulátory nervovej transkripčnej kontroly (Saab & Mansuy, 2014). Pravdepodobné sú aj molekulárne interakcie vyššieho rádu medzi epigenetickými hráčmi a proteínovými produktmi exprimovaných génov. Napríklad identifikovaný up-regulovaný Egr1 môže rekrutovať Tet1 na odstránenie represívnych metylačných značiek na aktiváciu downstream génov (Sun, et al., 2019). Na zistenie významu interakcií medzi epigenetickými regulátormi v sluchovom systéme počas učenia budú potrebné ďalšie molekulárne štúdie. Okrem toho táto správa predstavuje okamžitú príležitosť nadviazať spojenie medzi vybranými sluchovými kortikálnymi génmi a ich následnými efektormi.

Preklenutie priepasti medzi týmito génmi a molekulami na ich vplyv na neurofyziologické udalosti vyvolané zvukom je nevyhnutné na pochopenie toho, ako sa dospelý sluchový systém prispôsobuje skúsenostiam na zmenu správania. Translácia de novo transkriptov je skutočne potrebná pre dlhodobé zmeny behaviorálnej funkcie, pretože spôsobujú trvalé zmeny bunkovej funkcie. Napríklad kľúčové cieľové efektory transkripčných procesov indukovaných učením môžu zmeniť dostupnosť kanálov alebo receptorov (Metherate, Intskirveli, & Kawai, 2012; Brown & Kaczmarek, 2011; Henton, Zhao, & Tzounopoulos, 2023) v obvodoch, ktoré určujú zvuk evokovaný prah, responzivita a architektúra receptívneho poľa v sluchovom systéme. Je rozumné predpokladať, že rôzne sluchové úlohy by získavali jedinečné génové siete pre biologické dráhy relevantné pre konkrétne bunkové funkcie, ktoré by podporovali učenie pre zvukovú vlastnosť alebo štruktúru úlohy relevantnú pre úlohu.

Celkovo táto správa slúži ako východiskový bod na sprístupnenie súborov údajov RNAseq z oblasti učenia, dospelých a sluchovej kôry (pozri Úložisko údajov). Snaha o zúženie vedomostnej medzery umocnenej vážnym nedostatkom štúdií, ktoré sa zameriavajú na molekulárne genetické procesy v sluchovej kôre dospelých, je teraz vítaná. Podporujeme štúdium mimo časopriestorových obmedzení hromadného sekvenovania RNA, ktorého citlivosť je technicky obmedzená aj hĺbkou čítania (Li& Wang, 2021), najmä preto, že moderné technológie Omics sa rýchlo vyvíjajú a zlepšujú.

Zatiaľ čo výskum v oblasti sluchovej kôry urobil niekoľko počiatočných krokov v molekulárnej genetike, ktorá identifikovala základné molekulárne kaskády (Schicknick a kol., 2008), permisívne profily IEG (Mello, Velho a Pinaud, 2006; de Hoz a kol., 2018 Peter, a kol., 2011) a dokonca aj chromatindynamika (Peter, a kol., 2021), existuje precedens v sluchovej periférii, kde sa transkripčná dynamika krásne študuje (Kwan, 2016; Barta, a kol., 2018; Li, a kol. al., 2020; Ebeid, et al., 2017). Existujúce molekulárne nástroje, ako je jednobunkové sekvenovanie RNA (RNA-Seq) a fluorescenčná in situ hybridizácia s malými molekulami (smFISH), budú užitočné na poskytnutie prehľadu o variáciách medzi bunkami závislými od skúseností a molekulárnych interakciách v rámci sluchových kortikálnych buniek a okruhov. Na rozdiel od hromadného RNAseq tieto metódy rešpektujú hlbokú bunkovú diverzitu a organizáciu vyššieho rádu v sluchovej kôre, ako je jej mikroobvod špecifická pre vrstvu a lemniskálna topografia.
Chytré prístupy k prepisom značiek a sekvencií z len nedávno aktívnych sluchových kortikálnych buniek (Cho, Huang a Gray, 2016) môžu dostatočne zvýšiť citlivosť na to, aby sa robustne získali funkčne najrelevantnejšie súbory génov z funkčne najrelevantnejších typov a populácií buniek. Podobné prístupy by sa mohli použiť aj subkortikálne na zachytenie regionálnych transkriptomických profilov závislých od aktivity v kôre, ktoré rešpektujú neuveriteľnú integráciu kôry so subkortikálnou funkciou sluchového systému za rôznych podmienok počúvania alebo behaviorálnych požiadaviek. Úplná charakteristika bunkových a regionálnych rozdielov v genetických a molekulárnych mechanizmoch, ktoré sú základom sluchového učenia v mozgu dospelých, je rozhodujúca pre vývoj miestne selektívnych a na molekuly cielených presných terapeutík, ktoré umožňujú robustné a trvalé funkčné zmeny na podporu špecifických schopností sluchu a počúvania počas celého života.

Metódy

Subjekty: V behaviorálnych a molekulárnych experimentoch sa použilo celkom 24 dospelých samcov potkanov Sprague-Dawley (250 – 300 g pri príchode; Charles RiverLaboratories, Wilmington, MA). Všetky zvieratá boli individuálne umiestnené v kolónii s kontrolovanou teplotou (24 °C) v 12-hodinovom cykle svetlo/tma. Subjekty mali ad libitum prístup k potrave a vode pred behaviorálnym tréningom. Všetky postupy boli schválené a vykonané v súlade s pokynmi Inštitucionálneho výboru pre starostlivosť o zvieratá a použitie (IACUC) v Rutgers, Štátna univerzita v New Jersey (protokol č.: 999900026 (KMB)).

Behaviorálny aparát a zvukové stimuly: Všetky behaviorálne sedenia sa uskutočňovali v dvoch identických inštrumentálnych klimatizačných komorách (H{{0}}}TC-NSF; Coulbourn Instruments, Holliston, MA) v boxe so zoslabením zvuku. Denné tréningy boli vyvážené, aby sa zabezpečila rovnaká expozícia pre obe komory. Každá komora (12" Š x 10" H x 12" V; podlaha z drôteného pletiva bola vybavená ovládacou pákou (H21-03R), domovým svetlom (H11-01R), reproduktorom (H{ {8}}R) a systém na dodávanie vody (H14-05R). Počas tréningových fáz mohli zvieratá stlačiť páku odozvy („barpress“), čo spustilo predstavenie pohára na vodu (~0,02 cm3) v odmeňovacom porte (1,25" Š x 1,625" V). Ručný spínač (V21-01) sa počas prvej relácie použil na tvarovanie odozvy stlačenia tyče zvieraťa na spustenie prezentácie pohára na vodu, ktorý umožňoval prístup k Behaviorálne reakcie sa zaznamenávali pomocou softvéru Graphic State 4 (CoulbournInstruments, Holliston MA) na offline analýzu.

Všetky sluchové podnety boli generované pomocou softvéru Tucker-Davis Technologies (TDT, Alachua, FL) a RPvdsEx a prezentované prostredníctvom nástenného reproduktora operatívnej komory. Whitenoise (počas procedurálneho tréningu; obr. 1a) bol prezentovaný po dobu 7 alebo 9 s (75 dB SPL). Čisté tóny (počas dvojtónového rozlišovacieho tréningu; obr. 1a) boli prezentované vždy po dobu 8 s (70 dB SPL). Hladiny zvuku boli denne kalibrované pomocou digitálneho zvukomera (Larson DavisSoundTrack LxT1).

Tréning správania a farmakologická inhibícia HDAC3: Po jednom dni aklimatizácie na vivárium sa s potkanmi zaobchádzalo denne minimálne 3 dni. Pred začiatkom behaviorálneho tréningu boli potkany umiestnené do režimu obmedzeného množstva vody, kým nedosiahli 85 % neobmedzenej hmotnosti kontrolných zvierat zodpovedajúceho veku. Potkany s obmedzeným prístupom k vode boli potom tvarované vo vnútri komôr s tlmením zvuku na barpress za odmenu za vodu (obr. 1a). Tvarovanie barpressu a následný zvukový tréning boli ako už bolo opísané (Shang, Bylipudi, & Bieszczad, 2019). Stručne povedané, všetky zvieratá boli tvarované na barpress počas 5 dní a potom trénované v procedurálnej úlohe, aby sa naučili stlačiť tak, aby zazneli, čo v tejto fáze bol širokopásmový gaussovský šumový stimul (1-12.5 kHz pásmovo filtrovaný biely šum; 75 dB SPL), na získanie vodnej odmeny. Všetky zvieratá sa úspešne naučili spájať tento zvuk s odmenou pred pokračovaním v ďalšej fáze tréningu. Procedurálny tréning ukázal individuálnu variabilitu toho, ako rýchlo sa zvieratá dokázali naučiť úlohu na vysokú úroveň výkonu. Napriek tomu boli všetky zvieratá schopné dosiahnuť úroveň výkonu vyššiu alebo rovnú 90 % počas dvoch po sebe nasledujúcich dní (priemer=92,85 %, sem =0,01 %) po priemerne 12,67 dňoch ( sd=2.85 dní). Výkon bol vypočítaný pomocou 100 %.

Ďalšou fázou tréningu bola úloha dvojtónovej diskriminácie (2TD) (obr. 1a), v ktorej boli potkany trénované na rozlíšenie medzi dvoma spektrálne odlišnými zvukovými frekvenciami. Stlačenie tyče do tónu S+ (5.{5}} kHz; 70 dB SPL) by viedlo k predstaveniu vodnej odmeny, zatiaľ čo stlačenie tyče na kameň (11,5 kHz; 70 dB SPL) viedlo k chybovému signálu (blikanie svetlo) a „time-out“ (ďalších 6 s čaká na začiatok ďalšej skúšky). S+ a S-S-skúšky boli randomizované a trvali 8 s. Intervaly medzi skúškami (ITI) boli v priemere 15 s (rozsah: 5-25 s, randomizované). Barpresse počas tichej ITI boli bezvýznamné (žiadny časový limit, žiadny chybový signál ani vodná odmena). Denné stretnutia trvali 45 minút. Všetky zvieratá vykonávali úlohu 2TD celkovo tri po sebe nasledujúce dni. Potkany spároval vyškolený pozorovateľ tak, že zvieratám s podobnou mierou získania procedurálnej úlohy boli vo fáze 2TD priradené rôzne liečebné podmienky. Páry so zodpovedajúcim výkonom dostali systémové injekcie buď farmakologického inhibítora HDAC3 triedy I RGFP966 (Abcam Inc., ab144819; 10 mg/kg; sc; N=12) alebo roztoku vehikula (N=9) bezprostredne po každom 2TD relácia. Výkon úlohy 2TD sa vypočítal tak, ako už bolo opísané: 100 % (Shang, Bylipudi a Bieszczad, 20).

Odber tkaniva a izolácia RNA: Jednu hodinu po tom, čo zvieratá dostali svoju tretiu a poslednú injekciu RGFP966 po treťom sedení 2TD, boli mozgy rýchlo vypitvané a rýchlo zmrazené v kadičke s 2-metylbutánom umiestnenej na suchom ľade. Bleskovo zmrazené mozgy sa potom skladovali pri teplote -80˚C až do budúceho spracovania. Aby sa mozgy pripravili na kryosekciu, mozgy sa zabalili do zmesi s neoptimálnou teplotou rezania (OCT) a uskladnili sa pri -20˚C počas 12-24 hodín, aby sa zaistilo, že mozgové tkanivo dosiahne na rezanie -20˚C. Mozgy uzavreté v OCT by sa potom horizontálne rozrezali v kryostate (Leica CM 3050S) s hrúbkou 250 um. Pomocou 1 mm mikroprepichovača na okrúhle tkanivo sa odobrali vzorky 2 mm3 sluchového kortikálneho tkaniva z každej hemisféry (spojené do jednej vzorky s celkovým objemom 4 mm3 na oblasť mozgu) na extrakciu RNA. Sluchová kortexlokácia bola identifikovaná pomocou Paxinosa a Watsona The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates (6. vydanie) ako referencie (približne A/P=-3,6 až -5,8 mm, M/L {{20} } ±6,4 mm D/V=-4,2 až -5,8 mm; a použitie hipokampu ako orientačného bodu

Celková RNA z každej vzorky bola izolovaná pomocou PureLinkTM RNA Mini Kit (ThermoFisher) s použitím protokolu výrobcu. Vzorky RNA sa potom purifikovali pomocou súpravy RNA Clean and ConcentratorTM -25 Kit (Zymo Research).

Gene expression analysis, Gene Ontology (GO) biological process analysis, and gene set enrichment analysis (GSEA): RNA-seq analysis was conducted by the Iowa Institute of Human Genetics (IIHG; Iowa City, IA, USA). Briefly, using 500 ng total RNA (all RIN values >8), boli vytvorené sekvenčné knižnice pomocou súpravy Illumina TruSeq® Stranded mRNA Library Prepkit podľa protokolov odporúčaných výrobcom. Knižnice sa spojili a sekvenovanie sa uskutočnilo na Illumina NovaSeq 6000 so 100 bp párovým koncom SBSchemistry. Čítania boli spracované pomocou open-source informačného kanála 'bcbio-nextgen.py' vyvinutého primárne v Harvard Chan Bioinformatics (v.1.2.4), ktorý beží na Argon HPCresource na University of Iowa. Tento kanál obsahuje prístupy „najlepšej praxe“ na kontrolu kvality čítania, zarovnanie čítania a kvantifikáciu. Potrubie „bcbio-nextgen.py“ bolo spustené v režime „RNA-seq“ s kľúčom „rn6“ ako vybraným zostavením genómu (interne odkazujúce na zostavu Ensembl a génovú zostavu „Rnor_6.0“). Zarovnaný kanál načítava do genómu Rnor_6.0 pomocou zostrihu, ultrarýchleho zarovnávača hisat2 (2.2.1) a súčasne kvantifikuje načítavanie do transkriptómu pomocou vyrovnávača „losos“ (1.4.0). Qualimap (2.2.2), výpočtový nástroj, ktorý skúma súbory zarovnania hisat2 BAM, sa použil na preskúmanie načítaných údajov na kontrolu kvality. Skóre kvality sekvencie prešlo základnými kontrolami a miera duplikácie sekvencií bola v rámci prijateľných parametrov. Všetky vzorky prešli kontrolou kvality na zarovnanie čítania s exonickými oblasťami. Kvantifikácia transkriptov odvodených z lososa (TPM alebo "transkripty na milión") boli importované a zhrnuté do odhadovaných počtov na úrovni génov pomocou tximport (1.12.3) v Rstudio, ako je opísané v najlepšom praktikuje DESeq2 vinetu(https://bioconductor.org/packages/release/bioc/vignettes/DESeq2/inst/doc/DESeq2.html).

Gény s menej ako 5 odhadovanými počtom vo všetkých vzorkách boli predfiltrované z analýzy po prúde podľa odporúčaného postupu. Analýza diferenciálnej génovej expresie bola vykonaná s DESeq2 (v.1.24.0) na odhadovaných počtoch na úrovni génov. FDR 5 % a X< abs(logFC) < 10 was set as a cutoff for differential expression (DEGs). Heatmaps, line graphs, and volcano plots were generated using clusterProfiler packages in R/Bioconductor. Gene level, pathway, and DEG analyses were generated using iPathwayGuide (Advaita Bioinformatics, https://www.advaitabio.com/ipathwayguide; last accessed November 15, 2022). iPathwayGuide scores pathways using the Impact Analysis method (Draghici et al., 2007); Tarca et al., 2009, Khatri et al., 2007). The underlying pathway topologies, comprised of genes and their directional interactions, are obtained from the KEGG database (Kanehisa et al., 2000; Kanehisa et al., 2010; Kanehisa et al., 2012; Kanehisa et al., 2014).

Validácia údajov RNA-seq pomocou qRT-PCR: Údaje RNA-seq boli overené pomocou qRT-PCR na mRNA extrahovanej z odlišných skupín potkanov. Päť transkriptov sa vybralo zo zoznamu nových DEG nájdených obohatených v každej oblasti na začiatku. Tri z génov boli založené na hypotéze na základe sluchovej kortikálnej fyziologickej a behaviorálnej literatúry, zatiaľ čo ďalšie tri gény boli nové gény identifikované z génovej úrovne a analýz DEG v porovnaní medzi skupinami liečiv a vehikul. Všetky sekvencie primérov boli vybrané buď z predchádzajúcej literatúry o mozgovom tkanive u potkanov (sekvencie uvedené v tabuľke nižšie) alebo navrhnuté s použitím NCBI Primer Blast a overená cieľová špecificita vyhodnotením kriviek topenia a sekvenovaním PCR amplikónového produktu. qRT-PCR analýzy sa uskutočnili v QuantStudio 3 (Applied Biosystems) s SsoAdvancedTMUniversal SYBR Green Supermix (Bio-Rad). Pre každú vzorku sa amplifikovalo 500 ng cDNA pomocou iScriptTM cDNA Synthesis Kit (Bio-Rad).

Poďakovanie

Autori by chceli poďakovať Dr. Andrea Shang, Sean Tsaur a Sooraz Bylipudi za ich pomoc pri behaviorálnych procedúrach a analýze; Dr. Mimi L. Phan za pomoc pri extrakcii RNA a protokoloch odberu vzoriek; Dr. Troy A. Roepke, Ali Yasrebi a ChristopherO'Brien za pomoc s analýzou purifikácie vzorky RNA; a Alisa Ray za technickú pomoc. Radi by sme sa poďakovali všetkým súčasným a bývalým zamestnancom CLEF Lab za pomoc a podporu.

Táto práca bola podporovaná Národným inštitútom zdravia, Národným inštitútom pre hluchotu a poruchy komunikácie [R01-DC014753 to KMB]; Škola umení a vied na Rutgers University; Aresty Foundation na Rutgers University s malým grantovým financovaním pre vysokoškolský výskum; a program Project SUPER na Rutgers University s malým grantovým financovaním pre vysokoškolský výskum.

Referencie:

Alberini, CM a Kandel, ER (2014). Regulácia transkripcie pri konsolidácii pamäte. ColdSpring Harbour Perspectives in Biology, 7(1), a021741.doi:https://doi.org/10.1101/cshperspect.a021741

Albrecht, U., Zheng, B., Larkin, D., Sun, Z., & Lee, C. (2001). MPer1 a mper2 sú nevyhnutné pre normálne nastavenie cirkadiánnych hodín. J Biol Rhythms, 16, 100-104. doi:10.1177/074873001129001791.

Aschauer, D., & Rumpel, S. (2016). Senzorický neokortex a asociatívna pamäť. BehavioralNeuroscience of Learning and Memory, 37, 177-211.doi:https://doi.org/10.1007/7854_2016_453

Bae, K., Jin, X., Maywood, ES, Hastings, MH, Reppert, SM, & Weaver, DR (2001). Diferenciálne funkcie mPer1, mPer2 a mPer3 v cirkadiánnych hodinách SCN. Neuron, 30, 525-536.doi:10.1016/S0896-6273(01)00302-6.

Bakin, JS a Weinberger, NM (1996). Vyvolanie fyziologickej pamäte v mozgovej kôre stimuláciou nucleus basalis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 93(20), 11219-11224. doi:https://doi.org/10.1073/pnas.93.20.11219

Banerjee, SB, Gutzeit, VA, Baman, J., Aoued, HS, Doshi, NK, Liu, RC, & Ressler, KJ (2017). Perineuronálne siete v senzorickej kôre dospelých sú nevyhnutné na učenie strachu. Neuron, 95(1), 169-179. doi:10.1016/j.neuron.2017.06.007

Barta, CL, Liu, H., Chen, L., Giffen, KP, Li, Y., Kramer, KL, . . . On, DZ (2018). RNA-seq transkriptomikanalýza vláskových buniek vnútorného ucha dospelých zebričiek. Vedecké údaje, 5, 180005.doi:https://doi.org/10.1038/sdata.2018.5

Bayraktar, G. a Kreutz, MR (2018). Úloha demetylácie DNA závislej od aktivity v dospelom mozgu a neurologických poruchách. Frontiers in Molecular Neuroscience, 11, 169.doi:10.3389/fnmol.2018.00169

Bieszczad, KM, Bechay, K., Rusche, JR, Jacques, V., Kudugunti, S., Miao, W., . . . Wood, MA (2015). Inhibícia histónovej deacetylázy prostredníctvom RGFP966 uvoľňuje brzdy senzorickej kortikálnej plasticity a špecifickosti tvorby pamäte. J Neurosci, 35(38), 13124-13132.doi:https://doi.org/10.1523/JNEUROSCI.{2}}.2015

Brown, MR, & Kaczmarek, LK (2011). Modulácia draslíkových kanálov a sluchové spracovanie. Hearing Research, 279(1-2), 32-42. doi:https://doi.org/10.1016/j.heares.2011.03.004

Byčkov, ML, Vasilyeva, NA, Shulepko, MA, Balaban, PM, Kirpichnikov, MP, & Lyukmanova, EN (2018). Lynx1 zabraňuje dlhodobej potenciačnej blokáde a redukcii neuromodulátorovej expresie spôsobenej A 1-42 a aktiváciou JNK. Acta Naturae, 10(3), 57-61.

Reference:1950477648n@gmail.com