GTP energetická závislosť endocytózy a autofágie v starnúcom mozgu a Alzheimerovej chorobe

Abstraktné

Zvýšený záujem o starnutie aAlzheimerova chorobaPoruchy autofágie v mozgu súvisiace s (AD) vyvolávajú dôležité otázky o regulácii a liečbe. Pretože mnohé kroky v endocytóze a autofágii závisia od GTPáz, sú potrebné nové merania hladín GTP v bunke.hodnotiť reguláciu energie pri starnutí a AD. Nedávny vývoj pomerových GTP senzorov (GEVALS) a zistenia, že hladiny GTP nie sú vo vnútri buniek homogénne, zvyšujúnové otázky regulácie GTPázpodľa miestnej dostupnosti GTP. V tejto recenzii upozorňujeme nametabolizmus GTPvo vzťahu k Rab GTPázam zapojeným do tvorby skorých endozómov, neskorých endozómov a lyzozomálneho transportu na vykonanie autofagickej degradácie poškodeného nákladu. Špecifické GTPázy riadia makroautofágiu (mitofágiu), mikroautofágiu a autofágiu sprostredkovanú chaperónom (CMA). Z toho vyplýva, že miestne hladiny GTP by kontrolovali autofágiu, ak nie nadmerne. Ďalšie úrovne kontroly sú dané redoxným stavom bunky, vrátane účasti tioredoxínu. V tejto recenzii kladieme dôraz nazmeny súvisiace s vekomto by mohloprispievajú k deficitom GTP a AD. Dospeli sme k záveru s vyhliadkami na zvýšenie hladín GTP a zvrátenie oxidačných redoxných posunov súvisiacich s vekom, aby sa obnovila autofágia. Hladiny GTP by preto mohli regulovať početné GTPázy zapojené do endocytózy, autofágie a vezikulárneho obchodovania. Pri starnutí by metabolická adaptácia na sedavý životný štýl mohla narušiť mitochondriálne funkcie, čím by sa generovalo menej GTP a redoxnej energie pre zdravé riadenie amyloidu atau proteostáza, synaptickú funkciu, azápal.

Kľúčové slová GTP · Energetika · Autofágia · Mitofágia ·Endocytóza· Lyzozómy ·Alzheimerova choroba · Starnutie

Kliknite sem a získajte bylinný liek Cistanhe na liečbu Alzheimerovej choroby

GTP, ďalšia energetická mena, pri starnutí a AD

Syntéza vysokoenergetických molekúl ATP a GTP sa spolieha na redoxný stav NAD plus /NADH a ich dostatočné koncentrácie. Syntéza ATP z glykolýzy je primárne poháňaná oxidačnou silou NAD a pôsobením na redukujúce cukry. Syntéza ATP oxidačnou fosforyláciou v mitochondriách je poháňaná generovaním NADH v cykle TCA na redukciu pyruvátu, glycerolu alebo mastných kyselín s kyslíkom ako terminálnym akceptorom elektrónov v elektrónovom transportnom reťazci. Naše štúdie bez označenia na živých hipokampálnych neurónoch potkanov alebo myší naznačujú depléciu NAD a NADH súvisiacu s vekom, čo by mohlo narušiť syntézu ATP a GTP [1–4]. Toto vyčerpanie sa ďalej zhoršilo v neurónoch z myší nesúcich transgény pre ľudský beta-amyloid a tau. Okrem toho postmortálna analýza enzýmov cyklu TCA ukázala až 40-percentné poškodenie enzýmov cyklu TCA z mozgov s AD v porovnaní s kontrolami zodpovedajúceho veku [5]. Energetická deplécia NAD plus a NADH súvisiaca s vekom okrem mitochondriálneho poškodenia aktivity enzýmov TCA súvisiaceho s AD by teda mohla lokálne ovplyvniť hladiny ATP a GTP, aj keď ich objemové koncentrácie boli ovplyvnené minimálne.

Energia dostupná z hydrolýzy GTP je rovnaká ako hydrolýza ATP, ale GTP sa využíva na iné účely ako ATP kvôli selektivite špecifických enzýmov. Koncentrácie GTP v bunkách sú v priemere desaťkrát nižšie ako milimolárny ATP. GTP je hlavným regulátorom viacerých energeticky závislých bunkových procesov syntézy proteínov a vezikulárneho prenosu zahŕňajúcich endocytózu a autofágiu. Odhadovaná celková koncentrácia GTP v bunkách cicavcov je v rozmedzí 250–700 μM [6], ale voľný GTP vo výbežkoch rakovinových buniek je bližšie k 30 μM [7]. Medzi hlavné proteíny poháňané GTP patria dynamíny pre membránové štiepenie a fúziu, malé regulačné GTPázy a mikrotubuly, ako je podrobne uvedené nižšie. Okrem de novo syntézy z inozínu pomocou IDMPH2 a xantozínu pomocou GMPS sú bunkové zdroje GTP primárne lokalizované nukleoziddifosfátkinázy (NDPK) z nemetastatických génov (NME; niekedy nazývané NM23), ktoré konvertujú ATP na GTP [8]. Existuje najmenej desať členov rodiny génov NME, ale iba prví štyria majú aktivitu nukleoziddifosfátkinázy. Podľa Allen Brain Atlas sú NME1 až 4 silne a selektívne exprimované v myšom a ľudskom hipokampe, kde je pri AD narušená pamäť. NME1–3 sú cytoplazmatické, zatiaľ čo NME4 je mitochondriálne. Pretože pri starnutí a AD sú ovplyvnené oba odlišné procesy endocytózy a autofágie, predpokladáme, že zmeny proti prúdu ovplyvňujú oboje, možno vek a dôsledok AD súvisiaci s obmedzením hladín GTP na tieto kritické funkcie pre amyloid.

Meranie hladín GTP

Hoci GTP reguluje niekoľko kľúčových procesov pre prežitie buniek, meranie hladín GTP v živej bunke za fyziologických a patologických podmienok je ťažké kvôli vysokému obratu a existencii stavu viazaného na proteíny aj voľného stavu. Bianchi-Smira glia a kol. [9] opísali nový geneticky kódovaný GTP senzor (GEVAL) založený na žltom fluorescenčnom proteíne, ktorý deteguje pomerové zmeny v koncentrácii bez GTP a viazanej na GTP in vitro a in vivo. Nedávno tá istá skupina ohlásila mechanizmus regulácie GTPázy Rac1 pri bunkovej invázii bunkovej línie ľudského melanómu riadenej lokálnou produkciou GTP [7] a zhodnotila svoju metodológiu [10]. Ako uvidíme v tomto prehľade, GTP hrá kľúčovú úlohu počas endocytózy a autofágie súvisiacej so spracovaním amyloidu. V súčasnosti študujeme zmeny GTP súvisiace s vekom v spracovaní A v primárnych kultúrach hipokampálnych neurónov z trojitej transgénnej myši 3xTg-AD a jej vplyv na zmeny v autofágii. Obrázok 1 ukazuje predbežné výsledky transfekcie GEVAL530 do primárnych dospelých neurónov z tohto modelu AD myší v porovnaní s netransgénnymi myšacími neurónmi. Ako pozorovali Bianchi-Smiraglia et al. [7] vidíme nerovnomernú distribúciu GTP v procesoch a okrajoch soma pri meraní voľného GTP (obr. 1Aa), s nižšími hladinami voľného GTP v neurónoch 3xTg-AD (obr. 1Ac). Ako je podrobne uvedené v časti 10, predbežné ošetrenie týchto neurónov s NAD plus-prekurzorom, nikotínamidom, zvýšilo hladiny voľného GTP (obr. 1Ab, d). 530-uM Kd pre GEVAL530 použitý v týchto experimentoch naznačuje, že lokálna koncentrácia voľného GTP je niekoľkonásobne vyššia ako 530 uM. Na obr. 1B sme skúmali viazaný GTP, ktorý sa zdá byť lokalizovaný vo vezikulách a zvýšený nikotínamidom (obr. 1Bf, h), najmä v 3xTg AD neurónoch. Predbežné dôkazy naznačujú, že neuróny ošetrené NME1 siRNA znižujú svoje hladiny voľného GTP (Santana Martinez, nepublikované). Ďalšie štúdie s dospelými neurónmi naprieč vekovým spektrom určia vekovú závislosť deficitov GTP a schopnosť ich nápravy pomocou NAD plus -prekurzorov. Vzhľadom na zásadnú úlohu GTP v procesoch vezikulárneho prenosu endocytózy a autofágie a na tento predbežný dôkaz zmien v GTP s genetikou podobnou AD, nasledujúce časti poskytujú podrobnosti o týchto procesoch a účinkoch starnutia a Alzheimerovej choroby na ne. Výsledok tohto prehľadu zdôrazňuje potrebu nových metód, ako sú sondy GEVAL, na priame meranie zmien vo viazanom a voľnom GTP a celkových koncentráciách GTP.

Obr. 1 Pomerné merania GTP v primárnych myších hipokampálnych neurónoch z myší stredného veku transfekovaných senzorom GEVAL530 Falošne sfarbené pomerové obrázky neurónov pixel po pixeli ukazujú nerovnomerné rozloženie GTP. (a) Nadbytok voľného GTP/viazaného GTP stredného veku (14 mesiacov) netransgénneho (NTg) na okrajoch a apikálneho dendritu v porovnaní s (c) neurónom 3xTg-AD v strednom veku (10 mesiacov). (b, d) Zvýšenie voľného GTP v neurónoch ošetrených 2 mM nikotínamidom do 24 hodín. (e, g) Neošetrené neuróny vykazujú vezikulárne viazaný GTP, ktorý je zvýšený v (f, h) neurónoch ošetrených 2 mM nikotínamidom do 24 hodín

Endocytóza: GTP závislosť pri starnutí a AD

V procese endocytózy bunka internalizuje makromolekuly a receptory viazané na ligand a povrchové proteíny vrátane amyloidového prekurzorového proteínu (APP) [11] (obr. 2A). Z dvoch hlavných endocytických dráh sa vychytávanie APP zaliateho do plazmatickej membrány vyskytuje väčšinou prostredníctvom vychytávania sprostredkovaného klatrínom (obr. 2B.1) a nie cez kaveolou sprostredkované z náplastí bohatých na cholesterol (obr. 2B.2). Avšak hydrofóbny A sa rozdelí do oblastí lipidových raftov bohatých na cholesterol v plazmatickej membráne s následným vychytávaním kaveolovou dráhou [12] (obr. 2B.2). V oboch prípadoch sa komplexy dynamín GTPázy zostavia pri invaginácii, aby katalyzovali zakrivenie membrány závislé od GTP na konečnú fúziu a uvoľnenie zrelých vezikúl z plazmatickej membrány [13–15]. Lokálne zásobovanie GTP je katalyzované NME1 a 2 nukleotidovými fosfátkinázami, ktoré sa viažu na dynamín [16]. Rozhodnutie skorého endozómu Rab5 GTPázy smerom k exocytóze a recyklácii alebo transformácii receptora na neskorú endozómovú Rab7 GTPázu na degradáciu.

Rab5 GTPáza sa považuje za marker skorého endozómu [17]. Proteín Rab5 je prítomný v plazmatickej membráne, vo vezikulách potiahnutých klatrínom a skorých endozómoch (obr. 2). V bunkových a fy modeloch Huntingtonovej choroby sa Rab5 podieľa na tvorbe autofagozómov na reguláciu autofágie a elimináciu toxického mutantného huntingtínu [18]. Inhibícia Rab5 znižuje konjugáciu proteáz Atg5-Atg12 regulujúcich autofágiu, čo vedie k zníženiu tvorby autofagozómov. Konjugát Atg{11}}Atg5 podporuje lipidáciu Atg8 a lipidovaný Atg8 uľahčuje tvorbu autofagozómov a selektívne rozpoznávanie nákladu počas autofágie [19].

Ďalším faktorom, ktorý prispieva k autofágii sprostredkovanej Rab5-, je fosfatidylinozitol-3-kináza (PI3K). Komplex PI3-kinázy inhibuje autofágiu aktiváciou signálnej dráhy Akt/mTOR [20]. Podjednotka P110 komplexu PI3K reguluje katalytickú aktivitu komplexu Vps34 na podporu tvorby PI3P [21]. Tento krok je nevyhnutný pre tvorbu autofagozómov. P110 podporuje prechod z Rab{12}} GDP na Rab{13}}GTP. Nadmerná expresia P110 zmierňuje autofagický deficit po aktivácii makromolekulárneho komplexu zloženého z Rab5, Vps34 a Beclin1, čo následne vedie k tvorbe autofagozómov [22]. Zacielenie na tieto špecifické proteíny môže objasniť terapeutické cesty na zmiernenie patológie AD.

Obr. 2 Endocytóza amyloidného prekurzorového proteínu (APP). N-koncová časť proteínu APP so 770 zvyškami so zeleným tieňovaním A náchylného na agregáciu vyžaduje štiepenie pomocou BACE a gama peptidáz. B Endocytóza APP. (1) Tvorba vnútorného púčika z plazmatickej membrány riadená klatrínom s endoproteázami BACE a 훾-sekretázou. Endocytóza podporovaná dynamínom dostáva lokálny GTP pomocou NME1. (2) Mikrodomény obohatené o cholesterol (lipidové rafty) viažu APP spracovaný na A alebo A adsorbovaný z parenchýmu. (3) Skorý endozóm priťahuje GTPázu Rab5, ktorú rozpoznáva iná GTPáza, Rab11, aby sprostredkovala (4) endocytickú recykláciu receptorov späť do plazmatickej membrány. Alternatívne (5) Rab7 sprostredkuje skorú segregáciu do neskorých endozómov, čo umožňuje ďalšie spracovanie APP a akumuláciu A. (6) Neskorá endozómová fúzia s (7) lyzozómom na degradáciu obsahu. Niektoré agregované A môžu byť odolné voči tráveniu a pri narušení endozómu sa A môže hromadiť v cytosóle.

Membránovo viazaný Rab5 je kľúčovým faktorom pri priamej podpore Mon1-Ccz1-závislej aktivácie Rab7 a Rab7-závislej membránovej fúzie [23]. Mon1-Ccz1 je heterodimérny komplex guanínového nukleotidového výmenného faktora GEF, ktorý aktivuje Rab5. Po1-sprostredkované premiestnenie GEF Rab5 vedie k vytesneniu Rab5 pomocou Rab7. Komplex C-Vps pôsobí ako GEF pre Rab7 a podporuje prechod Rab7 zo stavu viazaného na HDP do stavu viazaného na GTP na aktiváciu Rab7. Gén spojený s rezistenciou na ultrafialové žiarenie (UVRAG) stimuluje aktiváciu Rab7 interakciou UVRAG‐ C‐Vps prostredníctvom výmeny GDP/GTP Rab7 [24]. Ďalším regulačným bodom v autofagickom procese je homotypická fúzia a komplex triedenia proteínov vakuol (HOPS), ktorý aktivuje kvasinkovú vakuolárnu Ypt‐Rab GTPázu počas membránovej fúzie [25]. Jednou zo 6 podjednotiek komplexu HOPS je komplex triedenia vakuolových proteínov triedy C (C‐Vps), ktorý obsahuje Vps11, Vps16, Vps18 a Vps33. Neskoré endocytické vezikuly Rab7 následne fúzujú s lyzozómami na degradáciu nákladu (obr. 2).

Zmeny v endozomálnom obchodovaní Rab 5 a Rab 7 v myších modeloch a v AD

V myších modeloch AD s mutáciami v amyloidnom prekurzorovom proteíne (APP) alebo A-produkujúcom presenilíne sa dráha endozóm-autofagozóm-lyzozóm javí ako dysregulovaná čiastočne v dôsledku narušenej acidifikácie lyzozómov, ktorá nedokáže dostatočne aktivovať proteázu a lipázy [26]. V myších modeloch AD sú veľké perinukleárne telieska obsahujúce agregáty A označené autofagozómovým markerom LC3 kolokalizovaným s Rab7 a neskorými endozomálnymi a lyzozomálnymi komponentmi. Môže to byť spôsobené zlyhaním ochrannej upregulácie alebo patologickým poškodením. V neurónoch kultivovaných z myší 3xTg-AD vo vekovom rozpätí sme zistili, že agregovaný vezikulárny A sa s vekom zvyšuje 30 až 50-násobne, najvýraznejšie v raných endozómoch a mitochondriách označených Rab5-, ale aj v Rab{{9} }označené neskoré endozómy a autofagozómy [27]. Akumulácia A 42 a A 45 podobná snehovej guli naznačuje, že staré neuróny neboli schopné dokončiť autofagickú degradáciu týchto dlhších agregátov A. Predpokladáme, že narušená produkcia energie v starých neurónoch obmedzuje energetickú kapacitu na dokončenie autofágie. V porovnaní s hladinami v mladom hipokampe a mozgovej kôre v 7–12-mesačnom myšom hipokampe APP/PS1 sa hladiny Rab7 znížili spolu so znížením aktivátorov Beclin1 a Rubicon a zvýšením inhibítora Rubicon [28]. V mladšom hipokampe a všetkých vekových skupinách v kôre Beclin1 aktivuje Rab7, zatiaľ čo Rubicon inhibuje aktiváciu Rab7 prostredníctvom supresie interakcie génového proteínu spojeného s rezistenciou voči UV žiareniu (UVRAG) a génu na triedenie vakuolárneho proteínu (Vps). Nedostatok Rab7 u kvasiniek a ovocných mušiek vedie k masívnej akumulácii autofagozómov [29]. Rab7 knockdown tiež inaktivuje mTORC1/S6K1 a lokalizáciu mTOR v neskorých endozómoch [30]. Je zaujímavé, že inhibícia iných štádií endocytického obchodovania nemení aktivitu mTORC1, čo naznačuje, že neporušené neskoré endozómy sú rozhodujúce pre signalizáciu mTORC1 v autofágii. To je dôležitý dôvod, prečo zacielenie na mTOR nemusí spomaliť starnutie alebo AD.

Regionálne selektívna upregulácia proteínov Rab 5 a Rab7 a mRNA pri AD naznačuje selektívny príspevok k patológii ochorenia alebo nedostatočný ochranný mechanizmus [31]. A sa hromadí prevažne v Rab7-pozitívnych neskorých endozómoch a autofagických vakuolách neurónových buniek [32] spôsobom súvisiacim s vekom [27], čo spôsobuje internalizáciu A a následné zvýšenie Rab7 spúšťajúce degeneráciu neurónov [33]. Blokovanie neskorej endocytovej dráhy supresiou Rab7 indukuje tvorbu amyloidných fibríl závislých od A na bunkovom povrchu, čo spôsobuje zväčšenie endozómov [34], čo vedie k zrýchlenej recyklácii Rab7 a endocytickému prenosu A do lyzozómov na degradáciu [35]. Inhibícia Iysomal proteolýzy môže tiež ovplyvniť axonálny retrográdny transport autofagických organel spôsobujúcich axonálnu dystrofiu podobnú AD [36]. Praktické zásahy na podporu autofágie sprostredkovanej Rab{14}} však môžu oddialiť alebo zvrátiť progresiu AD. Príklady zahŕňajú posun od sedavého stavu k cvičeniu, stredomorskú stravu a zlúčeniny zvyšujúce energiu, ako sú prekurzory NAD, aby sa vytvoril redoxný posun [4] (časť 10). Ďalšou cestou je zvláštny objav, že hladiny guanozínmonofosfátreduktázy 1 (NADPH-dependentný GMPR1) sú zvýšené v AD mozgoch, čo by samo o sebe mohlo znížiť hladiny GTP a zvýšiť signalizáciu AMP [37]. Neurofibrilárne klbká tau boli znížené, keď bola táto aktivita inhibovaná u AD myší.

S progresiou z mierneho kognitívneho poškodenia na AD boli endozomálne expresie Rab5 a Rab7 upregulované v hipokampálnych CA1 neurónoch, ako bolo merané pomocou transkripčného mikročipu [31]. Zväčšenie Rab5-pozitívnych endozómov bolo spojené s neurofibrilárnymi spleťami a ukladaním amyloidu. Neurotrofické faktory, ako je nervový rastový faktor (NGF), sa viažu na svoje Trk receptory a internalizujú sa do Rab5-pozitívnych endozómov, aby iniciovali downstream signalizáciu [38]. Je zaujímavé poznamenať, že signalizačný endozóm je zachovaný ako skoré endozómy Rab5 a neprechádza do neskorých endozómov Rab7 počas ich tranzitu v rámci dlhých axónov [39]. To odlišuje dodávanie signálu sprostredkované receptorom od endozómového spracovania smerom k autofágii [40]. Po aktivácii pomocou NGF TrkA regrutuje Rab5‐GAP na rýchlu konverziu GTP‐Rab5 na GDP‐Rab5, aby udržal hladinu GTP‐Rab5 pod kontrolou, čo zabraňuje konverzii Rab5 na Rab7, čo vedie k inhibícii signalizácie NGF/TrkA a predčasná degradácia.

Funkcia Rab5 je ohrozená v skorých fázach AD [41]. Pretrvávajúca hyperaktivácia Rab5 promotovala endocytickú dráhu smerom k neskorým endozómom, lyzozómovej fúzii a autofágii, čo malo za následok predčasnú degradáciu signalizácie neurotrofického faktora a neuronálnu atrofiu. Vps35 a Vps26, dva kľúčové retromérne proteíny, boli tiež znížené v AD mozgoch [42]. Vps26 sa viaže na SorLA, čo je triediaci receptor, ktorý riadi prenos APP z endozómov do Golgiho aparátu. Zníženie Vps retromérnych proteínov vedie k abnormálnemu komplexu Vps-SorLA, ktorý bráni akumulácii APP v puzdre prenosu APP v endozómoch, kde podlieha beta-sekretáze. Avšak napodobňovanie fosforylácie APP na S655 v rámci bazolaterálneho motívu APP 653YTSI656 môže zlepšiť vyhľadávanie APP v procese sprostredkovanom retromérmi, čo spôsobuje znížené lyzozomálne zacielenie APP a zníženú produkciu Abeta [43]. Zvýšenie APP a APP fragmentu ‐CTF s plnou dĺžkou môže zase zvýšiť aktivitu Rab5 GTPázy, čo indukuje zväčšenie skorých endozómov [44]. Je zaujímavé, že neuronálna atrofia indukovaná APP ‐CTF mohla byť zachránená dominantne negatívnym mutantom Rab5 in vitro [39] aj in vivo [45].

Čistým výsledkom starnutia je vyčerpanie neskorých endozómov, neskorá endocytická dysfunkcia a zhoršená lyzozomálna fúzia. Pri AD sa endocytóza A zvyšuje na zväčšené skoré endozómy Rab5. Úloha Rab7 v AD musí byť ešte jasne objasnená, pretože bola pozorovaná včasná upregulácia aj neskorá downregulácia Rab7 ovplyvňujúce zdravie neurónov v oboch smeroch. Ako zdôraznil Bianchi-Smiraglia et al. [7], celkový bunkový GTP, ktorý sa meria v homogenátoch, neumožňuje vyhodnotenie voľného GTP dostupného lokálne pre Rab GTPázy. Merania voľného GTP ešte neboli hlásené, takže ich možná úloha pri vekom a poruchách súvisiacich s AD pri endocytóze nie je preskúmaná. Preto bude dôležité merať voľný GTP v živých bunkách a účinky variácií voľného GTP na endocytózu ako funkciu veku a modelov AD.

Požiadajte o viac:

E-mail:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/Tel: plus 86 15292862950

OBCHOD:

https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop