Tu je stručnejšia verzia názvu: Súčasné stanovenie šiestich zložiek v Cistanche Tubulosa pomocou blízkej infračervenej spektroskopie

1. Úvod

Cistanche (Hoffmg. Et Link) je viacročný fanerogamný rod rastlín z čeľade Orobanchaceae. Väčšina druhov patriacich do rodu Cistanche sa v Číne používa ako liečivá rastlina po tisícročia; mať povesť vynikajúceho tonika; a sú známe ako "Ženšen púští". Cistanche tubulosa je obligátny parazit na koreňoch trvácej rastliny Tamarix chinensis. Bol zdokumentovaný v Čínskom liekopise ako autentický zdrojCistanches Herba(čínsky názov: Roucongrong) z vydania z roku 2005. Moderný farmakologický výskum na druhoch Cistanche sa začal v 80. rokoch 20. storočia. Farmakologické výskumy ukázali, že extrakty z rastlín Cistanche majú široké spektrum účinkov, ako je liečenie nedostatku obličiek a stareckej zápchy, zlepšenie schopnosti učiť sa a zapamätanie, proti Alzheimerovej chorobe, posilňovaní imunity, proti starnutiu, proti únave atď. V posledných troch desaťročiach sa komplexné a systematické farmakologické štúdie spojili s fytochemickými výskumami, aby sa objasnil materiálny základ priaznivých účinkov koreňov rastlín Cistanche. Tieto prieskumy naznačujú, že fenyletanoidové glykozidy (PhG) boli hlavnými účinnými zložkami v rastlinách Cistanche, ktoré zohrávali kľúčovú úlohu pri liečbe nedostatku obličiek, impotencie, proti starnutiu a proti Alzheimerovej chorobe. Obsah dvoch PhG (echinakozid a verbaskozid) bol požadovaný v Čínskom liekopise. Medzitým sacharidy, ako je manitol, sacharóza, glukóza a fruktóza v rastlinách Cistanche, majú laxatívnu funkciu a sacharidové zhlukyRastliny cistanchesa používali na liečbu zápchy.

PRÍRODNÁ CISTANCHE TUBULOSA NA ZVÝŠENIE TESTOSTERÓNU PHGS 75 % ECH 30 % ACT 12 %

Divoké zdroje C. tubulosa sú distribuované hlavne v oblasti obklopujúcej púšť Taklamakan v južnej autonómnej oblasti Xinjiang v Číne. Podobne ako mnohé iné druhy používané ako tradičná čínska medicína (TCM), C. tubulosa má veľkú ekonomickú hodnotu a vo svojom voľne žijúcom prostredí takmer vyhynula v dôsledku nadmerného zberu. Pestovanie C. tubulosa sa začalo v 90. rokoch 20. storočia v Číne, aby sa zabezpečili dodávky surovín pre Cistanches Herba, ako aj ochrana divokých rastlinných zdrojov. Od roku 2017 existuje v prefektúre Hotan v Sin-ťiangu takmer 13 tisíc ha pestovanej C. tubulosa. Na rozšírenie pestovania a zlepšenie kvality C. tubulosa je potrebný pokrok v technológii výsadby.

Primárnym účelom kultivácie C. tubulosa je produkcia Cistanches Herba, ktorá je bohatá na tieto účinné zložky. Avšak obsah účinných zložiek vCistanches Herba, ako sú PhGs a oligosacharidy, môžu byť počas výroby významne ovplyvnené mnohými faktormi. Mal by sa preskúmať systém detekcie kvality C. tubulosa v reálnom čase. Preto je potrebné vyvinúť vysoko výkonnú metódu, aby sa splnila požiadavka analýzy veľkého počtu vzoriek v krátkom čase. Tradične sa stanovenie týchto primárnych účinných zložiek, ako sú PhG a uhľohydráty, v C. tubulosa zvyčajne dosahovalo pomocou vysokoúčinnej kvapalinovej chromatografie (HPLC). Hoci je presný a spoľahlivý, je časovo náročný a pracný na zber a spracovanie údajov. Okrem toho je potrebné veľa času a úsilia na prípravu vzorky, ktorá zvyčajne zahŕňa pulverizáciu, extrakciu a filtráciu HPLC testov. Na získanie pomerne veľkého množstva dát je preto potrebný jasný princíp a ľahko ovládateľný nástroj. Našťastie sa blízka infračervená spektroskopia (NIRS) vo veľkej miere používa na hodnotenie poľnohospodárskych produktov, potravín, lekárskych vzoriek a farmaceutických produktov, pretože je rýchla a zároveň nedeštruktívna. Preto by NIRS mohol presne zodpovedať požiadavkám na efektívne merania TCM a nie je prekvapením, že NIRS sa použil na kvalitatívnu identifikáciu a kvantifikáciu zlúčenín v TCM.

V tejto štúdii sa obsah šiestich účinných zložiek vrátaneechinakozid, verbaskozid, manitol, sacharóza, glukóza a fruktózav 116 dávkach vzoriek C. tubulosa, ktoré boli odobraté z prefektúry Hotan v Sin-ťiangu v rokoch 2013–2015, boli prvýkrát stanovené pomocou HPLC. Potom sa pomocou metódy parciálnej regresie najmenších štvorcov (PLSR) vytvorili kalibračné modely týchto šiestich komponentov. Tieto modely sa potom validovali pomocou korelačných koeficientov a predikčných chýb v kalibračných súboroch. Výsledky ukázali, že vyvinutá metóda môže byť použitá ako spoľahlivá metóda na kvantitatívnu analýzu C. tubulosa.

2. Výsledky

2.1. HPLC analýza

Obsahechinakozid a verbaskozidboli stanovené dobre definovanou metódou HPLC-UV v literatúre a štyri sacharidy (manitol, sacharóza, glukóza a fruktóza) boli stanovené dobre definovanou metódou HPLC-ELSD v literatúre pre všetkých 116 vzoriek. Príprava vzorky a metódy stanovenia boli opísané v častiach 3.1 a 3.3. Obrázok 1 ukazuje charakteristické chromatogramy zmiešaných štandardov. Je možné vidieť, že všetkých šesť účinných zložiek bolo oddelených od základnej línie, a preto ich bolo možné kvantifikovať. Pred testovaním vzorky bola validovaná metóda HPLC. Hlavné výsledky metódy HPLC sú uvedené v tabuľke 1. Priaznivý lineárny vzťah (r=0.9998) a výťažnosť (98,5 %) metódy stanovenia echinakozidu sú uvedené vo výsledkoch, rovnaký výsledok ako u všetkých piatich komponentov. Preto je možné presne určiť obsah šiestich účinných zložiek. Všetky stanovené rozsahy obsahu sú zhrnuté v tabuľke 1.

2.2. Analýza NIRS

Obrázok 2 ukazuje NIR spektrá (4000–10,000 cm−1) vzoriek C. tubulosa. Významné absorpčné píky sa objavili od 4000 cm-1 do 7500 cm-1 vo všetkých vzorkách, zatiaľ čo jemné fluktuácie sa objavili od 7500 cm-1 do 10 000 cm-1. K posunu základnej línie NIR spektier došlo, pretože vzorka bola ľahko ovplyvnená faktormi, ako je veľkosť častíc a farba (obrázok 2A). Na zníženie vplyvu nepotrebných informácií do určitej miery sa použili matematické predbežné úpravy spektier. Matematické predbežné úpravy zahŕňali prvú deriváciu (1. derivácia), druhú deriváciu (2. deriváciu), štandardnú normálnu odrodu (SNV) a multiplikatívnu korekciu rozptylu (MSC). Obrázok 2B ukazuje 2. odvodenie NIR spektier C. tubulosa a sú pozorované významné variácie, ktoré sa vyskytli v troch oblastiach, 4000–4500 cm-1, 5000–5500 cm-1 a 7000–7500 cm-1.

2.3. Vytvorenie kvantitatívnych kalibračných modelov

Čiastočná regresia najmenších štvorcov (PLSR) je klasická modelovacia metóda a je široko používaná v kvantitatívnych modeloch kvôli vysokej kvalite výsledkov. Medzi výhody PLSR patrí dobrá prognostická schopnosť a relatívna jednoduchosť. PLSR sa tiež široko používa pri vytváraní kvantitatívnych kalibračných modelov TCM [25]. Na základe vopred upravených NIR spektier sa vytvoril model NIR kvantitatívnej analýzy pre šesť účinných zložiek v C. tubulosa pomocou metódy PLSR s údajmi HPLC analýzy ako skutočnými hodnotami. 116 vzoriek bolo náhodne rozdelených do kalibračných a validačných sád v pomere 3:1. Najvhodnejšie podmienky pre kalibráciu boli zvolené s nízkym RMSEC a vysokým korelačným koeficientom.

PRÍRODNÁ CISTANCHE TUBULOSA NA ZLEPŠENIE SEXUÁLNEJ FUNKCIE PHGS75% ECH 30% ACT 12%

2.3.1. Výber vlnového pásma pre kalibračné modely

Výber vhodného vlnového pásma bol dôležitým krokom pri zostavovaní kalibračného modelu. V tejto štúdii sa porovnávali intervalové spektrá NIR 4000–7500 cm−1 (odporúčané softvérom TQ analytik) a 4000–10 000 cm−1. Zistilo sa, že tento rozsah nie je vhodný na kalibráciu v intervale medzi 4000 cm-1 a 7500 cm-1 z tabuľky 2. Preto v súčasnej štúdii boli všetky spektrálne intervaly pre šesť chemických zložiek vybrané z intervalu od 4000 až 10 000 cm-1 porovnaním výkonnosti RMSEC a korelačného koeficientu.

2.3.2. Výber optimálneho počtu faktorov pre kalibračné modely

PLSR vysvetľuje maximálnu mieru variability v údajoch znížením rozmerov spektrálnych údajov výpočtom faktorov. Problém „nedostatočnej vybavenosti“ sa objavil v dôsledku nedostatočných informácií, ktoré vyplynuli z obmedzeného počtu faktorov; avšak výber faktorov väčších ako optimálne hodnoty zavedené v modeli spôsobí problém „nadmernosti“. Buď „nedostatok“ alebo „nadmernosť“ zníži predikčnú schopnosť zavedených modelov [22]. Obrázok 3 ukazuje vzťah medzi RMSECV a faktormi pre všetkých šesť zlúčenín. Preto sme vybrali tie faktory, ktoré zodpovedajú najnižším hodnotám RMSECV. Optimálny výber faktorov pre kalibračné modely je uvedený v tabuľke 3.

2.3.3. Výber spektrálnej predúpravy pre kalibračné modely

Ďalším rozhodujúcim faktorom ovplyvňujúcim kalibračné modely je spektrálna predúprava, ktorá je zameraná na zníženie vplyvu rozptylu a posunu základnej čiary, zvýšenie pomeru signálu k šumu a odstránenie nepravidelných variácií. Na elimináciu vplyvu rozptylu žiarenia boli použité metódy multiplikatívnej korekcie rozptylu (MSC) a štandardnej normálnej variácie (SNV). Na vyriešenie vplyvov driftu základnej línie sa porovnali spektrá 1. a 2. derivácie a vybrala sa 2. derivácia. Pre požadovaný efekt sme pred odvodením vyhladili spektrá pomocou algoritmu filtra Savitzky-Golay (SG), aby sa zabránilo zväčšeniu šumu. V tabuľke 3 sú uvedené informácie o spektrálnej predúprave a jej výsledky pre kalibračné modely.

2.4. Hodnotenie zavedených modelov

Dobrý kalibračný model NIRS by mal mať nízke hodnoty RMSEC a RMSEP, ako aj vysoký korelačný koeficient (r) a malé rozdiely medzi RMSEC a RMSEP. Kalibračné modely šiestich vybraných zlúčenín boli vytvorené podľa postupov uvedených vyššie (tabuľka 3). Hodnoty RMSEC a r pre kalibračnú sadu echinakozidu boli 27,6 a 0,9808, v tomto poradí. Výkonnostné parametre iných modelov chemických zlúčenín sú uvedené v tabuľke 3, z ktorej môžeme vyvodiť záver, že zavedené modely poskytujú uspokojivé výsledky predikcie a možno ich použiť na rýchlu kvantitatívnu analýzu C. tubulosa. Rozptylové grafy šiestich chemických zlúčenín sú znázornené na obrázku 4, aby boli kalibračné modely popisnejšie a vizuálne pozorované. Ako je znázornené na obrázku 4, medzi prediktívnymi a nameranými hodnotami sa vyskytli menšie rozdiely, pretože väčšina bodov bola rozložená okolo regresívnej krivky s rovnicou ako y=x. Preto boli na obrázku 4 pozorované vynikajúce prediktívne výkony.

3. Materiály a metódy

3.1. Príprava vzorky

V rokoch 2013 až 2015 sa z prefektúry Hotan v autonómnej oblasti Sin-ťiang odobralo 116 vzoriek C. tubulosa. Všetky vzorky boli kultivované, ale boli odobraté v rôznych štádiách rastu. Čerstvá hmotnosť vzoriek sa pohybovala od 20 g do 1000 g. Po vysušení na slnku boli vysušené vzorky rozdrvené a preosiate cez 60-sito.

3.2. NIR spektroskopický zber dát

NIR spektrá vzoriek sa zbierali v intervale 8 cm-1 v spektrálnej oblasti 4000-10 000 cm-1 pomocou systému Antaris MXFT-NIR (Thermo Scientific, Madison, WI, USA) vybaveného ručný adaptér na odrážanie optických vlákien. Každé spektrum sa získalo spriemerovaním 64 skenov. Všetky vzorky sa pred skenovaním NIR spektier nechali ekvilibrovať na izbovú teplotu (25 °C), aby sa zabezpečilo, že vzorky budú analyzované pri rovnakej teplote. Vlhkosť v laboratóriu bola udržiavaná na úrovni okolia.

PRÍRODNÁ CISTANCHE TUBULOSA NA ZLEPŠENIE FUNKCIE OBLIČIEK PHGS75% ECH 30% ACT 12%

3.3. Zber údajov HPLC

3.3.1. Príprava na extrakciu

Jeden gram prášku C. tubulosa sa extrahoval 50 ml 50 % metanolu v kónickej banke s ultrazvukom (500 W, 40 kHz) počas 30 minút. Extrakt sa skladoval pri 4 °C. Supernatant extraktu sa prefiltroval, čím sa získala vzorka na HPLC analýzu.

3.3.2. Simultánne stanovenie echinakozidu a verbascozidu s HPLC-UV

Kvapalinová chromatografická analýza sa uskutočnila na systéme Shimadzu UHPLC (Shimadzu, Kyoto, Japonsko) pozostávajúcom z dvoch jednotiek na dodávku rozpúšťadla LC-20ADXR, čerpadla LC-20AD, SIL-20ACXR auto vzorkovač, CTO-20stĺpcovú pec na striedavý prúd, detektor SPD-M20A DAD, odplyňovač DGU-20A3R a ovládač CBM-20A.

Kolóna Grace Prevail Carbohydrate ES (150 x 2,1 mm, 2,7 mm) použitá na chromatografické separácie sa udržiavala pri 35 °C. Mobilná fáza pozostávala z acetonitrilu (A) a 0,1 % vodnej kyseliny mravčej (B) a bola dodávaná podľa gradientového programu takto: 0–7 min, lineárny gradient 10–20 % A; 7-15 min, 20 % A; a 15–20 min, lineárny gradient 20–10 % A. Prietok mobilnej fázy bol 0,4 ml/min. UV monitorovanie sa uskutočňovalo pri 330 nm.

3.3.3. Súčasné stanovenie manitolu, sacharózy, glukózy a fruktózy pomocou HPLC-ELSD

HPLC sa uskutočňovala na LC systéme Agilent série 1100 (Palo Alto, CA, USA) pozostávajúcom z odplyňovača G1322A, kvartérneho čerpadla G1311A, autosamplera G1311A, regulátora teploty kolóny G1316A a detektora DAD G1315B.

Na chromatografické separácie sa použila kolóna Sigma Prevail Carbohydrate ES (4,6 x 25 0 mm, 5 um) a udržiavala sa pri teplote kolóny 25 °C. Mobilná fáza pozostávala z acetonitrilu a vody (77:23, obj./obj.) a izokraticky sa dodávala s prietokovou rýchlosťou 0,7 ml/min. Odtok sa monitoroval pomocou odparovacieho detektora rozptylu svetla (ELSD) s predvolenými parametrami.

3.4. Spracovanie údajov

TQ Analyst (verzia 8.0, Thermo Scientific, Madison, WI, USA) sa použil na rozdelenie kalibračných a validačných sád, matematické predbežné spracovanie spektier, vytvorenie kalibračných modelov a ďalšie výpočty . Na výrobu figúrok bol použitý Origin (verzia 9.1).

4. Závery

V tejto štúdii sme navrhli rýchlu a nedeštruktívnu metódu na simultánnu analýzuechinakozid, verbaskozid, manitol, sacharóza, glukóza a fruktózav C. tubulosa pomocou NIRS. Analýzy RMSEC, korelačného koeficientu, RMSEP a hodnôt Rp ukázali, že zavedené kvantitatívne modely NIR možno použiť na presné predpovedanie obsahu šiestich vybraných účinných zložiek v C. tubulosa. V porovnaní s HPLC môže metóda NIRS uvedená v tejto štúdii výrazne ušetriť prácu a čas pri zachovaní uspokojivej schopnosti kvantitatívnej analýzy. Preto tu uvedená metóda má potenciál na použitie pri kontrole kvality C. tubulosa, a teda na usmernenie vývoja kultivačnej a spracovateľskej technológie pre C. tubulosa.

PRÍRODNÁ CISTANCHE TUBULOSA NA ZLEPŠENIE SEXUÁLNEJ FUNKCIE PHGS75% ECH 30% ACT 12%