Tandemová hmotnostná spektrometria s vysokým rozlíšením identifikuje konkrétny gangliozidový vzor u pacientov s včasným diabetickým ochorením obličiek u pacientov s diabetes mellitus 2.
Dec 08, 2023
Abstrakt:
Vzhľadom na cenné informácie poskytované glykosfingolipidmi asmolekulárne markerya obmedzené údaje dostupné na ich detekciu a charakterizáciu u pacientov trpiacich touto chorobouDiabetické ochorenie obličiek typu 2(DKD) sme vyvinuli a implementovali špičkovú metódu založenú na hmotnostnej spektrometrii s vysokým rozlíšením (HR) a tandemovej MS (MS/MS) na stanovenie gangliozidov v močipacienti DKD. Táto štúdia bola zameraná na: (i) testovanie realizovateľnosti a výkonnosti HR MS a MS/MS pri mapovaní asekvenovanie renálnych gangliozidov u DM 2. typupacientov; (ii) určenie zmien vmočový gangliozid DKDpacientov vrôznych štádiách ochorenia-normo-, mikro- a makroalbuminúria-v porovnávacom teste so zdravými kontrolami. V dôsledku vysokého rozlíšenia a presnosti hmotnosti komparatívny skríning MS odhalil, že stav sialylácie gangliozidových zložiek; ich modifikácia O-acetyl, CH3COO-, O-fukozyl a O-GalNAc; ako aj zloženie ceramidu predstavujú možné markery pre včasnú detekciu DKD, posúdenie progresie ochorenia a následnú liečbu. Štrukturálne vyšetrovanie MS/MS navyše preukázalo, že GQ1d(d18:1/18:0), GT1 (d18:1/18:0) a GT1b(d18:1/18:{{ 23}}) izoméry sú spojené s makroalbuminúriou, čo si zasluhuje ďalšie skúmanie vo vzťahu k ich úlohe v DKD.
Kľúčové slová: nanoelektrosprej; tandemová hmotnostná spektrometria s vysokým rozlíšením; skríning; fragmentačná analýza; diabetické ochorenie obličiek; gangliozidové biomarkery
1. Úvod
Diabetes mellitus 2. typu (DM) zostáva terapeutickou výzvou s neustále rastúcou celosvetovou prevalenciou, a to aj napriek vedeckému pokroku v tejto oblasti. DM 2. typu, spojený s devastujúcim makrovaskulárnym a mikrovaskulárnym dlhodobým poškodením, vedie k zvýšenej mortalite. Diabetické ochorenie obličiek (DKD) je najčastejšou príčinou konečného štádia renálneho ochorenia (ESRD) v rozvinutých a rozvojových krajinách [1,2]. Včasná detekcia DKD a optimálna liečba DM 2. typu sú teda kľúčové pre zníženie komplikácií, morbidity a mortality. V súčasnosti sa diagnostika a progresia DKD spolieha na meranie albuminúrie a stabilné zníženie rýchlosti glomerulárnej filtrácie (eGFR), pričom oba parametre ukazujú miernu predikciu budúceho stavu obličiek. Prirodzená anamnéza DKD zahŕňa niekoľko klinických štádií, vrátane nasledujúcich: skorá glomerulárna hyperfiltrácia, výskyt mikroalbuminúrie alebo makroalbuminúrie, pokles rýchlosti glomerulárnej filtrácie a ESRD. Nedávny výskum však považuje albuminúriu za marker zhoršujúceho sa stavu [3].
V poslednom desaťročí sa prejavil osobitný záujem o subtelocentrický koncept, podľa ktorého by proximálny tubul a tubulointersticiálny kompartment mohli mať zásadnú úlohu pri iniciácii a progresii DKD [4–6]. V tejto súvislosti si vývoj prognostických a prediktívnych glykomických biomarkerov získava čoraz väčšiu pozornosť a v priebehu rokov sa stal stredobodom pozornosti mnohých výskumných skupín [7–11].
Gangliozidy predstavujú osobitnú triedu glykosfingolipidov s komplexnou štruktúrou identifikovanou vo všetkých tkanivách a telesných tekutinách a obzvlášť hojne sa vyskytujú v centrálnom nervovom systéme (CNS) [12]. Ako základné zložky dvojvrstvových membrán neurónových buniek hrajú gangliozidy životne dôležitú úlohu vo vývoji, dozrievaní a starnutí mozgu, sprostredkúvajú bunkovú adhéziu, aktiváciu, proliferáciu, motilitu a rast. Gangliozidy pozostávajú z ceramidu rôzneho zloženia vzhľadom na sfingoidnú bázu, zvyškov mastných kyselín zakorenených vo vonkajšej vrstve membrány a sialylovaného oligosacharidového reťazca pokrývajúceho membránu a podieľajúceho sa na špecifických a podstatných interakciách s inými molekulami v okolitom prostredí. Prostredníctvom normálneho bunkového povrchového obratu, známeho ako "odlupovanie bunkového povrchu", sa gangliozidy uvoľňujú do určitej miery do medzibunkového priestoru.
Pretože je známe, že expresia, distribúcia a štruktúra gangliozidov sú špecifické pre bunkový a tkanivový typ a menia sa počas vývoja tkaniva, dozrievania, starnutia a predovšetkým v patologických stavoch [12], gangliozidy sa považujú za jedny z najcennejších. diagnostické markery a perspektívne terapeutické činidlá.
Na identifikáciu renálnych gangliozidov u pacientov s DM 2. typu sa použilo niekoľko metód využívajúcich fragmenty biopsie séra alebo obličky, ako je imunofarbenie na tenkej vrstve [7,8], vysokoúčinná tenkovrstvová chromatografia (HPTLC) [9], spektrofotometria [10 ] a hmotnostná spektrometria (MS) [11].
Vzhľadom na cenné informácie, ktoré môžu poskytnúť gangliozidy ako molekulárne markery neurónového tkaniva [12], a na obmedzené údaje, ktoré sú doteraz dostupné pri detekcii a charakterizácii glykosfingolipidov v moči pacientov s DKD, sme vyvinuli a implementovali špičkovú metódu založenú na na nanoelektrosprej (nanoESI) MS s vysokým rozlíšením (HR) na stanovenie gangliozidov v moči pacientov s DM. Táto možnosť pre HR MS bola vedená výhodami, ktoré ponúka táto metóda pri analýze komplexných zmesí gangliozidov extrahovaných z ľudského moču. Zvýšená rozlišovacia schopnosť prístroja: (i) umožňuje detekciu iónov s blízkymi hodnotami m/z, ktoré by inak nebolo možné rozlíšiť v heterogénnej viaczložkovej vzorke obsahujúcej druhy rôznych dĺžok a architektúr glykánového reťazca a odlišné zloženie ceramid; (ii) v podstate eliminuje potrebu separácie zmesi buď kvapalinovou chromatografiou alebo elektroforetickými metódami pred MS analýzou; (iii) poskytuje vysokú presnosť hmotnosti, ktorá výrazne zvyšuje spoľahlivosť identifikácie štruktúry; a (iv) ponúka nielen lepší prehľad o zložitosti gangliozidómu spojeného s DM, ale aj údaje o druhoch s potenciálnou biomarkerovou úlohou na základe vysokej spoľahlivosti v určovaní hmotnosti pre molekulárne i fragmentové ióny.
Táto pilotná štúdia s cieľom charakterizovať gangliozidy v moči s úlohami biomarkerov vvčasná diagnostika DKDbola zameraná na: (a) testovanie uskutočniteľnosti a výkonnosti HR MS a tandemovej MS (MS/MS) pomocou vysokoenergetickej kolízie indukovanej disociácie (HCD) pri mapovaní renálnych gangliozidov u pacientov s DM 2. typu; (b) stanovenie zmien v expresii natívnych gangliozidových zmesí zo vzoriek moču pacientov s DM 2. typu v porovnávacom teste so zdravými kontrolami a charakterizácia objavených biomarkerov. Na tento účel sme optimalizovali modernú bioanalytickú platformu založenú na nanoESI HR MS na prístroji Orbitrap vyladenom na prevádzku v režime negatívnych iónov pri skríningu MS aj pri fragmentácii MS/MS na podrobnú štrukturálnu analýzu.
2. Výsledky a diskusie
2.1. Porovnávací skríning vzoriek pomocou nanoESI HR MS
Vzorky gangliozidov A1, A2, A3 a C sa infúzia nanoESI jedna po druhej do Orbitrap MS a skrínovali sa v režime negatívnych iónov za rovnakých inštrumentálnych podmienok. V každom prípade sa signál celkového iónového prúdu (TIC) získal počas 2 minút, čím sa generovali spektrá z akumulácie 100 skenov. Vďaka vysokej citlivosti metódy, dokonca aj za použitých časovo obmedzených podmienok, sa získané hmotnostné spektrá vyznačovali vysokým pomerom signálu k šumu a bohatým vzorom molekulárnych iónov.
Vyhodnotenie mapovacích údajov generovaných za rovnakých podmienok odhalilo významné rozdiely v počte a type gangliozidových zložiek vyjadrených vo vzorkách A1, A3 a C, zatiaľ čo medzi vzorkami A1 a A2 neboli pozorované žiadne rozdiely. Tieto výsledky sú zhrnuté v tabuľke 1, ktorá porovnateľne uvádza štruktúry identifikované v natívnych zmesiach Al, A3 a C, spolu s experimentálnymi hodnotami m/zexp detegovaných signálov a teoretickými hodnotami m/zteor zodpovedajúcimi navrhovaným štruktúram.
Vysoké rozlíšenie a presnosť hmotnosti použitej platformy MS zlepšili rozlišovanie a identifikáciu založenú na presných meraniach hmotnosti nie menej ako 37 rôznych gangliozidových a fukogangliozidových zložiek v moči v troch vzorkách. Objavené druhy patria do 15 rôznych tried vrátane modifikácií hlavného glykánového reťazca (tabuľka 2) a bola im pridelená vynikajúca priemerná presnosť hmotnosti 4 ppm.
Podrobné vyhodnotenie štruktúr v tabuľke 1 odhalilo, že zo všetkých vzoriek zmes A3, ktorá zodpovedá makroalbuminúrii (teda pokročilému štádiu DKD), obsahuje najvyšší počet odlišných gangliozidových zlúčenín, tj 19, nasledovaná vzorka C s 12 rôznymi druhmi a vzorka A1 s 10.
V porovnaní so vzorkami A1 a C, A3 tiež: (i) zahŕňa najvyšší počet druhov s najdlhším O-glykánovým reťazcom patriacim do triedy G1 a najvýraznejšiu diverzitu ceramidových kompozícií; (ii) predstavuje najvyšší počet gangliozidových tried vyjadrených-12 tried oproti iba 6 vo vzorke A1 a 6 vo vzorke C, v uvedenom poradí; (iii) obsahuje najvyšší počet gangliozidov, ktoré vykazujú sacharidové jadro zmenené nesacharidovým O-acetylom, ako aj sacharidové O-fukozyl a O-GalNAc biologicky relevantné modifikácie; (iv) je jediný močový extrakt obsahujúci gangliozidové štruktúry modifikované pripojením O-GalNAc, menovite GalNAc-GS1(t18:1/18:0), detekovaný ako štvorvrstvová deprotonovaná a sodovaná molekula pri m/z 1176,8266 a GalNAc-GQ1(d18:1/18:0), ako dvojnásobne deprotonovaná molekula pri m/z 1310.1271. Ako je vidieť na obrázku 1a–c, ktorý ukazuje podiel gangliozidových tried vyjadrených v troch vzorkách, a v porovnávacom histograme znázornenom na obrázku 2, extrakt A3 vykazuje konkrétny stav sialylácie, v ktorom dominujú polysialozlúčeniny. Okrem monosialylovanej gangliotetraózy GM1(d18:1/16:1) detegovanej ako [M-2H+]2- pri m/z 756,90}78 a monosialylovanej GM3(d18:0/24: 0) detegovaná ako dvojnásobne deprotonovaná molekula pri m/z 645,3956, všetkých 17 ďalších druhov obsahuje vo svojej glykánovej skupine viac ako jeden zvyšok Neu5Ac. Navyše, pretože bolo objavených nie menej ako sedem trisialo GT1, štyri pentasialo GQ1 a dokonca aj heptasialylovaný GS1, samozrejme, okrem rozšíreného počtu a rozmanitosti štruktúr, dĺžky glykánových jadier a ich periférnych modifikácií, vysoká celková sialylácia obsah predstavuje ďalší znak špecifický pre makroalbuminúriu.
Tabuľka 1. Gangliozidové druhy boli identifikované vo vzorkách A1, A3 a C pomocou skríningu (-) nanoESI Orbitrap MS. d: dihydroxylovaná sfingoidná báza; t: trihydroxylovaná sfingoidná báza.
Klinicky relevantné pozorovanie vyplýva aj z porovnávacieho testu A1 vs. C. Zatiaľ čo v kontrolnej vzorke C je najvyšší stupeň sialylácie detegovaných gangliozidov štyri, identifikované prostredníctvom dvoch tetrasialylovaných gangliotetraóz GQ1 líšiacich sa zložením svojho lipidického aglykónu, vo vzorke A1 je najvyšší stupeň sialylácie štyri. Okrem di-, tri- a tetrasialylovaných gangliozidov obsahuje zmes A1 pentasialo gangliotetraózu GP1 (d18:1/18:0), detegovanú ako ión [M-4H+]4- pri m/z 676,5569, ktorej bola priradená vynikajúca presnosť hmotnosti 2,95 ppm. Takéto údaje týkajúce sa stavu sialylácie skúmaných vzoriek ukazujú, že stupeň sialylácie renálnych gangliozidov sleduje znak C < A1 < A2=A3, čo je pozorovanie, ktoré zdôrazňuje predčasnosť týchto modifikácií, dokonca aj v štádiu normoalbuminúrie Pacienti s DM 2. typu. Stupeň sialylácie sa zvyšuje s progresiou ochorenia, čo z neho robí molekulárny parameter, ktorý treba zvážiť nielen pri včasnej detekcii DKD, ale aj pri hodnoteníProgresia DKDaúčinnosť liečby.
Tabuľka 2. Tabuľkový pohľad na identifikované triedy gangliozidov v moči spolu s ich rozdielnou expresiou vo vzorkách A1, A3 a C. Symboly: x=trieda bola zistená; -=trieda nebola zistená.
Podrobná kontrola konštitúcie aglykónu ukazuje, že okrem výrazných rozdielov v zložení glykánového reťazca, gangliozidy exprimované v troch vzorkách tiež vykazujú rozdiely v štruktúre ich ceramidov. Najzreteľnejšie zmeny lipidovej časti súvisia s menej bežným procesom trihydroxylácie sfingoidných báz, ktorý sa vyskytuje v gangliozidových zmesiach A1 a A3, a nezvyčajnou dĺžkou reťazcov mastných kyselín, ktoré sú prítomné iba v A3. Zistilo sa, že každá zo vzoriek A1 a A3 obsahuje dva druhy s trihydroxylovanými sfingoidnými bázami ceramidu. Vo vzorke A1 boli teda objavené GT1(t18:0/18:0) a GT1(t18:0/20:0), zatiaľ čo čím viac Vo vzorke A3 sa našli komplexné trihydroxylované štruktúry GT1(t18:1/24:3) a Fuc-GT3(t18:1/18:3).
Je pozoruhodné, že vzorka A3 tiež vykazuje dôkazy o druhoch obsahujúcich mastné kyseliny s veľmi dlhým reťazcom (VLCFA). VLCFA sa považuje za zriedkavo sa vyskytujúcu lipidovú štruktúru zahŕňajúcu 23 až 27 atómov uhlíka v reťazci mastnej kyseliny. Vo vzorke A3 boli zistené štyri takéto neobvyklé druhy VLCFA nesúce 24 atómov uhlíka v reťazci mastnej kyseliny: GM3(d18:0/24:{{10}}), GT1(t18:1 /24:3), O-Ac GT1(d18:0/24:0) a Fuc-GT1(d18:0/24:0), z toho jedna štruktúra má tiež nezvyčajnú trihydroxyláciu sfingoidnej bázy a tri dvojité väzby v reťazci mastnej kyseliny, zatiaľ čo dve štruktúry predstavujú pripojenie ku glykánovému jadru O-Ac a fukozylovej skupiny.
Tieto charakteristiky častí ceramidu vo vzorkách A1 a A3, ktoré sa nenašli v kontrolnej vzorke; podobnosti medzi A1 a A2; a výrazné rozdiely zistené v A3 naznačujú, že okrem zloženia uhľohydrátov a stavu sialylácie je ďalším možným markerom skorej DKD štruktúra lipidovej skupiny v renálnych gangliozidoch. Okrem toho sa zdá, že modifikácie v zložení ceramidu závisia od štádia albuminúrie; komplexné ceramidy, ktoré vykazujú trihydroxyláciu sfingoidnej bázy a VLCFA sa zdajú byť spojené s pokročilými štádiami albuminúrie. Vzhľadom na to, že nezvyčajný počet troch dvojitých väzieb v reťazci mastných kyselín sa vyskytol iba vo vzorke A3 prostredníctvom dvoch rôznych druhov, Fuc-GT3(t18:1/18:3) a GT1(t18:1/24:3), s progresiou DKD zrejme súvisí aj mechanizmus tvorby dvojitej väzby.
Negatívne účinky spôsobené akumuláciou lipidov v obličkách na glomerulárnej aj tubulárnej úrovni sú špecifické pre bunky. Okrem toho je lipotoxicita spojená s rôznymi typmi lipidov, medzi ktorými zohrávajú úlohu centrálneho štádia gangliozidy [13].
Obsah gangliozidov v obličkách, okrem iných tried lipidov, bol zvýšený v podocytoch, ako aj v bunkách proximálnych tubulov, na myšom modeli DN [14]. Proximálne tubuly môžu byť vystavené vysokým hladinám lipidov v moči, vrátane gangliozidov, v dôsledku zvýšeného obsahu mastných kyselín na molekulu albumínu na začiatku DKD [15]. Priame dôsledky akumulácie lipidov v segmentoch nefrónu súvisia so štrukturálnymi a funkčnými modifikáciami, ktoré vedú k zhoršenému spracovaniu albumínu na začiatku priebehu DM 2. typu.
Prevažná väčšina štúdií, ktoré sa zameriavajú na charakterizáciu renálneho gangliozidu, sa spolieha na experimentálne modely diabetickej nefropatie. Podľa našich najlepších vedomostí ide o prvú translačnú štúdiu na ľuďoch od základného výskumu až po klinickú použiteľnosť, ktorá informuje o konkrétnom modeli gangliozidov v moči u pacientov s DM 2. typu. Praktický význam našej štúdie je v preukázaní asociácie stupňa sialylácie urinárnych gangliozidov a štruktúry ich ceramidov s včasnou DKD, v štádiu albuminúrie.
Podporná služba Wecistanche - Najväčší vývozca cistanche v Číne:
E-mail:wallence.suen@wecistanche.com
Whatsapp/Tel:+86 15292862950
Nakupujte pre ďalšie špecifikácie Podrobnosti:
https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop
ZÍSKAJTE PRÍRODNÝ BIO EXTRAKT CISTANCHE S 25 % ECHINAKOZIDU A 9 % AKTEOZIDU NA INFEKCIU OBLIČIEK
