Príčina chronického ochorenia obličiek (CKD) - Anémia

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com

ČASŤ Ⅰ:Proteinurické chronické ochorenie obličiek je spojené so zmenenou životnosťou červených krviniek, deformovateľnosťou a metabolizmom

Rosi Bissinger, Travis Nemkov a kol.

Vývojanémiaje typickou komplikáciou pokročilýchchronické ochorenie obličiek(CKD) a je spojená so zhoršenou kvalitou života¹a zvýšené riziko kardiovaskulárnych príhod²a hospitalizácia,³ako aj kognitívny pokles.⁴Závažnosťanémiabol považovaný za nezávislý prediktor úmrtnosti pri dialyzovanom aj dialyzovanom nezávislom CKD (chronické ochorenie obličiek) pacientov.⁵Patofyziológia spojená s ochorením obličiekanémiaje komplexný a zahŕňa nedostatok železa a erytropoetínu (EPO) v rámci zápalu nízkeho stupňa, ktorý zase ohrozuje normálnu erytropoézu pri CKD (chronické ochorenie obličiek) pacientov.⁶V pokročilom CKD (chronické ochorenie obličiek), je odozva EPO neadekvátne nízka vo vzťahu k stupňuanémia.^7,8 Vysoká prevalencia sprievodného nedostatku železa pri CKD (chronické ochorenie obličiek) je dôsledkom narušenej homeostázy železa.⁹ Zanedbávaný mechanizmus straty železa pri CKD (chronické ochorenie obličiek) je proteinúria, ktorá môže viesť k stratám železa viazaného na transferín močom (až do 0,3 mg/deň), keď proteinúria dosiahne nefrotický rozsah.¹⁰Ďalší faktor, o ktorom sa predpokladá, že k nemu prispievaanémiav CKD (chronické ochorenie obličiek) patients is the shortened lifespan of red blood cells (RBCs), first described >pred 60 rokmi.^6,11,12

Prínos lieku Cistanche: liečba ochorenia obličiek a zlepšenie funkcie obličiek

Nedávna štúdia využívajúca dychový test na oxid uhoľnatý preukázala, že životnosť červených krviniek sa postupne skracuje zo 120 dní u pacientov s CKD 1.chronické ochorenie obličiek) do 60 dní u pacientov s CKD v štádiu 5 (chronické ochorenie obličiek).¹³ Najmä transfúzia alogénnych červených krviniek od zdravých darcov na CKD (chronické ochorenie obličiek) po pacientoch nasledoval rýchly klírens erytrocytov podaných transfúziou bez dôkazu hemolýzy.¹²Pravdepodobným mechanizmom tohto pozorovania môže byť stimulácia bunkovej smrti podobnej apoptóze v bezjadrových červených krvinkách, čo označuje model poškodenia, pri ktorom nie je narušená integrita bunkovej membrány a obsah cytoplazmy zostáva nedotknutý.¹⁴Červené krvinky podliehajúce bunkovej smrti vykazujú rôzne morfologické zmeny vyplývajúce z poškodenia cytoskeletu, ako je tvorba povrchových bublín, strata elasticity membrány a/alebo bunková dehydratácia.¹⁵Na molekulárnej úrovni je smrť červených krviniek spojená s intracelulárnou akumuláciou Ca2+, zmeneným stavom bunkovej energie a rozpadom fosfolipidovej asymetrie, čo v konečnom dôsledku vedie k externalizácii fosfatidylserínu (PS) na vonkajšej plazmatickej membráne.^15,16V dôsledku toho makrofágy a špecializované dendritické bunky rýchlo rozpoznávajú PS-externalizované RBC, čo vedie k erytrózovej fagocytóze a ich katabolizmu v slezine a pečeni.¹⁷Kvôli mätúcej patofyziológiiochorenie obličiek-príslušnéhoanémiau ľudí sú potrebné štúdie na zvieratách, aby sa presne určili prispievajúce mechanizmy. Nefropatia vyvolaná doxorubicínom (DIN) u myší 129S1/SvImJ¹⁸a myši s indukovateľným nedostatkom podocínu (Nphs2Dipod)¹⁹sú 2 modely, ktoré sú charakterizované indukciou proteinúrie v nefrotickom rozsahu v priebehu dní, progresiou do zlyhania obličiek po 3 týždňoch a smrťou za 6 až 7 týždňov.^19–21Oba myšacie modely účinne rekapitulujú všetky štádiá ľudského CKD (chronické ochorenie obličiek). V tejto štúdii sme testovali, či progresívne zlyhanie obličiek u týchto myší s proteinuriouochorenie obličiekovplyvňuje životnosť červených krviniek a prispieva kanémia. Paralelne sme skúmali fenotyp červených krviniek v krvi odobratej z CKD (chronické ochorenie obličiek) pacientov s proteinúriou v nefrotickom rozsahu.

CKD (chronické ochorenie obličiek) aanémia: CISTANCHE

METÓDY

Podrobné informácie o materiáloch a metódach sú uvedené v Doplnkových materiáloch a metódach.

Štúdie na myšiach

Experimenty sa uskutočnili na 8-týždňových myšiach divokého typu 129S1/SvImJ oboch pohlaví (Charles River). DIN bola indukovaná jednou injekciou doxorubicínu (14, 5 mg / g telesnej hmotnosti), ako bolo opísané vyššie.^18,22Na kontrolu myelotoxického účinku doxorubicínu nesúvisiaceho s rozvojom nefropatie boli myši C57BL/6 rezistentné na doxorubicín tiež podrobené rovnakému liečebnému protokolu.²³ Okrem toho sa podobné experimenty uskutočnili na 8-týždenných myšiach s indukovateľnou deléciou podocínu (B6-Nphs2tm3.1Antc*Tg [Nphs1-rtTA*3G] 8Jhm*Tg[tetO -cre]1Jaw) alebo myši Nphs2Dipod, ktoré boli liečené doxycyklínom počas 14 dní.¹⁹Všetky pokusy na zvieratách sa uskutočňovali podľa príručky Národného inštitútu zdravia pre starostlivosť a používanie laboratórnych zvierat a nemeckého zákona o dobrých životných podmienkach zvierat so súhlasom miestnych úradov (Regierungspräsidium Tübingen, čísla schválenia M12/17 a M17/19G ). Experimentálny dizajn štúdií na myšiach je uvedený na doplnkovom obrázku S1.

pacientov

Pacientska štúdia bola vykonaná v súlade s Helsinskou deklaráciou a bola schválená miestnou etickou komisiou Univerzitnej nemocnice Tübingen (556/2018BO2). Lítium-heparínové vzorky krvi a moču boli získané od pacientov s proteinúriou v nefrotickom rozsahu a zachovanou rýchlosťou glomerulárnej filtrácie (GFR; štádiá 1–2; n ¼ 10) a pacientov so zníženou GFR (CKD (CKD)chronické ochorenie obličiek) štádium 3–5; n ¼ 15) v Univerzitnej nemocnici Tübingen. Ako kontrolná skupina bola krvnou bankou Univerzitnej nemocnice Tübingen poskytnutá krv od zdravých dobrovoľníkov zodpovedajúceho veku a pohlavia (n ¼ 25). Všetky ľudské vzorky boli odobraté po informovanom súhlase. Klinické charakteristiky pacientov sú uvedené vStôl 1.

Tabuľka 1|Charakteristika pacientov s CKD (chronické ochorenie obličiek) a zdravých darcov krvi

Analýza prietokovou cytometriou

Rôzne parametre smrti RBC buniek sa stanovili pomocou inej cytometrie.¹⁴ Na stanovenie životnosti červených krviniek in vivo sa 25 ml 5,6-karboxyfluoresceín diacetát sukcinimidylester [5(6)-CFDA, SE] farbivo vstreklo v koncentrácii 9,96 mM (rozpustené v dimetylsulfoxide) do retroorbitálu plexus myší s injekciou divokého typu 129S1/SvImJ a doxorubicínom, ako bolo opísané vyššie.24 V uvedených časových bodoch bola myšiam odobratá krv z retroorbitálneho plexu a percento 5(6)-CFDA, SEþ bunky sa detegovali ďalšou cytometrickou analýzou. Nakoniec sa údaje analyzovali pomocou softvéru FlowJo (FlowJo LLC).

Deformovateľnosť červených krviniek a osmotická gradientová ektocytometria

Deformovateľnosť červených krviniek sa merala pomocou laserom asistovaného optického rotačného analyzátora buniek (LORCA Max Sis; RR Mechatronics), ktorý bol podrobne opísaný inde.²⁵Analýzy osmotického gradientu ektacytometrie (cosmos can) sa tiež uskutočnili pomocou LORCA Max Sis a merali sa deformovateľnosť za rôznych osmotických podmienok.²⁶

Histologické vyšetrenie

Na farbenie hematoxylínom a eozínom boli sleziny a stehenné kosti zafarbené hematoxylínom a eozínom. Všetky sklíčka boli zafarbené primárnou protilátkou Ter119 (BD Pharmingen; riedenie 1:500). Na farbenie kyselinou jodistou – Schiff, 2.5-mm hrubé plátkyobličkyboli zafarbené kyselinou jodistou – Schiffovým činidlom (Carl Roth) a hematoxylínom (Abcam). Farbenie May-Grünwald-Giemsa (Pappenheimova metóda) sa uskutočnilo na určenie zmien tvaru RBC, ako bolo opísané vyššie.²⁷ Izolácia glomerulov sa uskutočnila použitím biotinylačného prístupu a triedenia buniek.¹⁹Na detekciu proteínu podocínu bola aplikovaná protilátka od Sigma (P0372).¹⁹Na farbenie jadier sa použil Roti-Mount Fluor Care 4,6-diamidino-2-fenylindol (DAPI; Carl Roth).

Ultra-výkonná kvapalinová chromatografia-hmotnostná spektrometria metabolomika z myších červených krviniek

Analýzy sa uskutočnili tak, ako bolo publikované.²⁸Stručne povedané, analytická platforma využíva systém Vanquish s ultravysokým výkonom kvapalinovej chromatografie (Thermo Fisher Scientific) pripojený online k hmotnostnému spektrometru Q Exactive (Thermo Fisher Scientific).

Cistanche lieči ochorenie obličiek spôsobené anémiou

Štatistické analýzy

Údaje sa poskytujú ako aritmetické priemery SEM alebo ako medián s medzikvartilovým rozsahom (25. – 75. percentil), kde n predstavuje počet použitých zvierat alebo zahrnutých pacientov. Údaje boli testované na normalitu pomocou Kolmogorov-Smirnovovho testu, D'Agostinovho testu a Shapiro-Wilkovho testu. Odchýlky sa analyzovali Bartlettovým testom na rovnaké odchýlky. Tukey alebo Dunn posttest s viacnásobným porovnaním, nepárový Studentov t-test alebo Mann-Whitney U test sa uskutočnil pomocou GraphPad Prism 8 (GraphPad Software). P < 0.05="" s="" 2-="" chvostovým="" testovaním="" sa="" považovalo="" za="" štatisticky="" významné.="" ďalšie="" grafy="" boli="" vynesené="" cez="" graphpad="" prism="">

VÝSLEDKY

Vyvoláva experimentálne proteinurické ochorenie obličiekanémiau myší Po indukcii sa u myší 129S1 / SvImJ s myšami DIN a Nphs2Dipod vyvinula proteinúria nefrotického rozsahu (obrázok 1a a doplnkový obrázok S2C) a progresívne zlyhanie obličiek charakterizované vysokými hladinami močoviny v plazme od 20. dňa (obrázok 1b a doplnkový obrázok S2D). Počas prvých 10 dní zaznamenali myši prírastok telesnej hmotnosti s ascitom (obrázok 1c a doplnkový obrázok S2E), čo odráža retenciu sodíka spôsobenú vylučovaním serínových proteáz alebo proteinúriou.¹⁸Po spontánnom zvrátení retencie sodíka tieto myši neustále strácali váhu. U myší s DIN a u myší Nphs2Dipod snímky svetelnej mikroskopie zachytené po 10 dňoch odhalili typické histomorfologické zmeny v súlade s fokálnou segmentálnou glomerulárnou sklerózou (obrázok 1d a doplnkový obrázok S2B). Tieto chýbali u myší C57BL/6 s injekciou doxorubicínu (obrázok 1d). Liečba doxorubicínom vyvolala silný pokles hemoglobínu, počtu červených krviniek a hematokritu (obrázok 1e–g) od 10. dňa u myší 129S1/SvImJ a C57BL/6, ktoré boli u myší normalizované na 20. a 30. deň. 20. a 30. deň sa u myší s injikovaným doxorubicínom 129S1/SvImJ a u myší s deficitom podocínu vyvinul progresívnyanémia, charakterizované zníženým stredným korpuskulárnym objemom (obrázok 1h) a zníženým hemoglobínom (doplnkový obrázok S2F), čo naznačuje, žeanémiaje spojená s progresívnym zlyhaním obličiek a nie s liečbou doxorubicínom per see.

Obrázok 1|Funkcia obličiek a zjavná anémia u myší 129S1/SvImJ s injekciou doxorubicínu.(a–d) U myší 129S1/SvImJ s injekciou doxorubicínu sa vyvinula (a) vysoká proteinúria, (b) progresívne zvýšenie koncentrácie močoviny v plazme, (c) prechodné zvýšenie telesnej hmotnosti a (d) typické histomorfologické zmeny svedčiace o fokálnej segmentálnej glomerulárnej skleróze na 10. deň (farbenie kyselinou jodistou – Schiff; stĺpec ¼ 10 mm). (e–h) Okrem toho sa tieto myši vyvinulianémiaodráža sa (e) zníženou hladinou hemoglobínu, (f) nižším počtom červených krviniek (RBC), (g) zníženými hladinami hematokritu a (h) zníženým stredným korpuskulárnym objemom. (a–d) Myši C57BL/6 s injekciou doxorubicínu nevykazovali žiadne známky poškodenia obličiek a (e–g)anémiav deň 10 bol normalizovaný v dňoch 20 a 30. Sú zobrazené aritmetické priemery SEM. *P < 0,05,="" **p="">< 0,01,="">< 0.001,and="" ****p="" <="" 0.0001="" indicate="" signifificant="" difference="" between="" healthy="" 129s1/svimj="" and="" doxorubicin-injected="" 129s1/svimj="" mice;="" #p=""><0.05, ##p="" <="" 0.01,="" ###p="" <="" 0.001,="" and="" ####p="" <="" 0.0001="" indicate="" signifificant="" difference="" to="" the="" baseline="" of="" doxorubicin-injected="" 129s1/svimj="" mice;="" and="" §p="" <="" 0.05,="" §§p="" <="" 0.01,="" §§§p="" <="" 0.001,="" and="" §§§§p="" <="" 0.0001="" indicate="" signifificant="" difference="" between="" doxorubicin-injected="" 129s1/svimj="" and="" doxorubicin-injected="" c57bl/6="" mice.="" crea,="">

Anémia pri experimentálnom proteinurickom ochorení obličiek nie je spôsobená narušenou erytropoézou

Oba modely anemických myší vykazovali významné zvýšenie percenta cirkulujúcich retikulocytov (obrázok 2a a doplnkový obrázok S3C). Koncentrácie EPO v plazme sa dramaticky zvýšili na 10. deň u 129S1/SvImJ u myší DIN a zdravých C57BL/6, ale opäť sa normalizovali na 20. a 30. deň (obrázok 2b). U myší s deficitom podocínu sa plazmatické koncentrácie EPO zvýšili na 10. deň a zostali zvýšené na 20. a 30. deň (doplnkový obrázok S2H). V histologických analýzach z kostnej drene a sleziny sa počet erytroidných prekurzorových buniek v porovnaní s myeloidnými prekurzormi zvýšil na 30. deň (obrázok 2d–g), čo poukazuje na stimulovanú erytropoézu u anemických myší 129S1 / SvImJ s DIN.

Obrázok 2|Erytropoéza je stimulovaná u myší 129S1/SvImJ s anémiou s injekciou doxorubicínu. (a) Anémiau myší 129S1/SvImJ s injekciou doxorubicínu sa vyskytli napriek zvýšenému počtu retikulocytov v dňoch 2{{3{32}}}} a 30. (b) Plazmatická koncentrácia erytropoetínu bola vysoko zvýšená v deň 10 u myší 129S1/SvImJ a C57BL/6 s injekciou doxorubicínu, ale opäť sa normalizovala v dňoch 20 a 30. (c–e) Kvantifikácia absolútnych počtov (c) myeloidných a (d) erytroidných buniek v kostnej dreni. (e) pomer myeloidných a erytroidných buniek u zdravých myší 129S1/SvImJ a myší s injekciou doxorubicínu v kostnej dreni ukázal vyšší počet erytroidných prekurzorových buniek u myší s injekciou 129S1/SvImJ s doxorubicínom na 3. deň{{5{{52} }}}}. (f,g) Histológia (f) sleziny a (g) kostnej drene ukázala zvýšenie počtu erytroidných prekurzorových buniek, pozorované aj pri nižších zväčšeniach, u myší 129S1/SvImJ s injekciou doxorubicínu (pravé panely) v porovnaní so zdravými myšami (ľavé panely ) na 30. deň. (f,g) Ter119 imunohistochémia (spodné panely) podporila nálezy hematoxylínu a eozínu (H&E). Ter119 je pozitívny v erytroidných prekurzoroch (bunky s jadrom) a v červených krvinkách (bunky bez jadra). Tyč ¼ 100 mm; vložky ¼ 25 mm. Sú zobrazené aritmetické priemery SEM. *P < 0,05,="" **p="">< 0,01="" a="" ***p="">< 0,001="" indikujú="" významný="" rozdiel="" medzi="" zdravými="" myšami="" 129s1/svimj="" a="" myšami="" 129s1/svimj="" s="" injekciou="" doxorubicínu;="" ##p="">< 0,01="" a="" ####p="">< 0,0001="" indikujú="" významný="" rozdiel="" oproti="" východiskovej="" hodnote="" myší="" 129s1/svimj="" s="" injekciou="" doxorubicínu;="" a="" §p="">< 0,05,="" §§p="">< 0,01="" a="" §§§§p="">< 0,0001="" naznačujú="" významný="" rozdiel="" medzi="" myšami="" c57bl/6="" s="" injekciou="" doxorubicínu="" a="" 129s1/svimj="" a="">

Prínos zCistanche: liečba ochorenia obličiek a zlepšenie funkcie obličiek

Skrátená dĺžka života červených krviniek je primárnou príčinou anémie pri experimentálnom proteinurickom ochorení obličiek

Externalizácia PS na vonkajšom letáku plazmatickej membrány RBC je indikátorom bunkovej smrti a promótorom erytro fagocytózy.¹⁴Smrť RBC buniek bola kvantifikovaná pomocou fluorescenčne aktivovaných analýz triedenia buniek fluorescenčného anexínu V-viazaného povrchového PS.¹⁴ In freshly drawn blood, the percentage of PS-exposing cells was >{{0}}násobne vyššia na 2. deň0 u myší s DIN (4,16 percent a 0.86 percent) v porovnaní so zdravými myšami (1).{7 }} percent & 0.11 percent ) (obrázok 3a). Podobne myši Nphs2Dipod vykazovali približné 2-násobné zvýšenie expozície PS (1,27 percenta a 0,20 percenta) v porovnaní so zdravými myšami (0,58 percenta a 0,05 percenta) v deň 30 (doplnkový obrázok S3A). Je známe, že erytrocyty sú eliminované z obehu makrofágmi nachádzajúcimi sa v slezine.17 Toto pozorovanie môže preto vysvetliť vyšší pomer sleziny/telesnej hmotnosti myší Nphs2Dipod (doplnkový obrázok S2G), kde je degradovaných dvakrát toľko červených krviniek v porovnaní so zdravými C57BL/6 myši. Keďže proteinúria nefrotického rozsahu vedie k dysproteinémii,29 sme ďalej skúmali, či zvýšená smrť buniek RBC môže byť stimulovaná zložkou v plazme myší s DIN. Ako je znázornené na obrázku 3b, expozícia PS v dňoch 10 a 20 bola dvakrát vyššia po inkubácii (30 minút pri 37^OC) zdravých červených krviniek v plazme myší 129S1 / SvImJ s injekciou doxorubicínu v porovnaní s inkubáciou v plazme zdravých myší. Prítok Ca2+ do červených krviniek, sprostredkovaný napäťovo riadenými a napäťovo nezávislými neselektívnymi katiónovými kanálmi,^30,31je jedným z kľúčových regulátorov smrti červených krviniek. V červených krvinkách odobratých na 20. a 30. deň od myší 129S1/SvImJ s DIN sa intracelulárne koncentrácie Ca2+ zvýšili (obrázok 3c); tento jav bol rekapitulovaný u myší Nphs2Dipod v deň 20 (doplnkový obrázok S3B). V oboch myšacích modeloch bola signifikantne negatívna korelácia percenta PS-pozitívnych červených krviniek so závažnosťouanémiaodrážané hladinami hemoglobínu (obrázok 3d a doplnkový obrázok S3D). Okrem toho existovala významná korelácia s poškodením obličiek, ktoré sa odrážalo v plazmatickej koncentrácii močoviny (obrázok 3e a doplnkový obrázok S3E) av menšej miere s proteinúriou (obrázok 3f a doplnkový obrázok S3F). Na kompenzáciu straty RBC vanémia, tvorba nových červených krviniek bola stimulovaná u oboch myší, ako je naznačené zvýšeným percentom cirkulujúcich retikulocytov, a významne korelovala s veľkosťou červených krviniek vystavujúcich PS (obrázok 3g a doplnkový obrázok S3G).

Obrázok 3|U myší s nefropatiou vyvolanou doxorubicínom sa vyvinie zvýšená smrť červených krviniek (RBC) sprostredkovaná zvýšenými hladinami intracelulárneho vápnika.(a) Externalizácia fosfatidylserínu (PS), odrážajúca smrť červených krviniek, bola zvýšená na 2. deň 0 a 3. deň 0 po indukcii nefropatie vyvolanej doxorubicínom. (b) Inkubácia zdravých červených krviniek v plazme odobratých v dňoch 10 a 20 od týchto myší viedla k externalizácii PS. (c) Externalizácia PS bola sprevádzaná zvýšenými hladinami intracelulárneho vápnika v červených krvinkách odobratých v dňoch 20 a 3{{30}} po indukcii. (d – g) Percento (d) erytrocytov vystavujúcich PS korelovalo s hladinami hemoglobínu, poškodením obličiek indikovaným (e) koncentráciou močoviny v plazme a (f) proteinúriou, ako aj s (g) tvorbou retikulocytov. (d–g) Údaje zahŕňajú každý časový bod (0, 10, 20 a 30 dní) každej zdravej myši 129S1/SvImJ a 129S1/SvImJ s nefropatiou vyvolanou doxorubicínom. Sú zobrazené aritmetické priemery SEM. **P < 0,01,="" ***p="">< 0,001="" a="" ****p="">< 0,0001="" indikujú="" významný="" rozdiel="" medzi="" zdravými="" myšami="" 129s1/svimj="" a="" myšami="" 129s1/svimj="" s="" injekciou="" doxorubicínu="" (in.);="" #p="">< 0,05,="" ##p="">< 0,01="" a="" ####p="">< 0,0001="" indikujú="" významný="" rozdiel="" oproti="" východiskovej="" hodnote="" myší="" 129s1/svimj="" s="" injekciou="" doxorubicínu;="" a="" §§§§p="">< 0,0001="" naznačujú="" významný="" rozdiel="" medzi="" myšami="" c57bl/6="" s="" injekciou="" doxorubicínu="" 129s1/svimj="" a="" myšami="" c57bl/6="" s="" injekciou="" doxorubicínu.="" crea,="" kreatinín;="" mfi,="" stredná="" intenzita="">

Prínos zCistanche: liečba ochorenia obličiek a zlepšenie funkcie obličiek

KLIKNITE SEM PRE PART Ⅱ