Materiály a metódy

6. Testy bunkovej absorpcie

Internalizácia EV do buniek sa monitorovala najprv farbením LEV a SEV lipofilným DiI (MOP-D -3911) (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Po ošetrení buniek zafarbenými EV počas 1, 3, 6, 12, 24 a 48 hodín sa rastové médium odstránilo a bunky sa fixovali 4 percentami paraformaldehydu (Wako, Japonsko). Pridal sa Hoechst 33342 (Invitrogen) a bunky sa inkubovali 15 minút pri teplote miestnosti, aby sa zafarbili jadrá (modrá). Nakoniec sa bunky premyli PBS obsahujúcim 1 % hovädzieho sérového albumínu a fluorescencia (červená a modrá) sa pozorovala pod fluorescenčným mikroskopom (Leica Microsystems, Wetzlar, Nemecko). Najmenej tri polia boli vybrané a analyzované pomocou softvéru ImageJ.

7. Meranie obsahu melanínu

Na vyhodnotenie obsahu melanínu sa bunky melanómu B16BL6 najskôr naočkovali na 24-jamkové platne (5 x 104 buniek/jamku) v objeme 500 ul. Po 24 hodinách inkubácie sa bunkyboli ošetrené 100 nM -MSH (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) samotným alebo 50 ul LEV a SEV pri 1, 5 a 10 ug/ml počas 48 hodín. Po ošetrení boli bunky premyté PBS a potom inkubované s 2,5 percentným trypsínom (Gibco, Thermo Fisher Scientific) na izoláciu. Bunkové mikroguľôčky sa rozpustili v 1n roztoku hydroxidu sodného (Sigma-Aldrich) obsahujúcom 1 % DMSO (Sigma-Aldrich) počas 1 hodiny pri 80 °C. Bunkové lyzáty sa preniesli na 96-jamkovú doštičku a obsah melanínu sa stanovil meraním absorbancie pri 405 nm pomocou enzýmového markera (BioTek). Obsah melanínu bol stanovený pomocou melanínovej štandardnej krivky skonštruovanej z 0-100 ug/ml roztoku syntetického melanínu (Sigma-Aldrich) (extracelulárne vezikuly, obrázok nasledovne). Obsah melanínu sa vypočítal porovnaním s kontrolami.

8. Test tyrozinázovej aktivity

Aktivita TYR bola meraná pomocou aktivity L-DOPA oxidázy. Bunky B16BL6 sa naočkovali v médiu -MEM obsahujúcom 100 nM Sigma-Aldrich-MSH (500 ul) a kultivovali sa pri hustote 1 x 105 buniek/jamku v 24-jamkových kultivačných platniach. Po ošetrení buniek 50 ul LEV a SEV v koncentráciách 10, 50 a 100 ug/ml počas 24 hodín boli bunky premyté PBS a lyzované 1 percentom Triton X-100 (Sigma-Aldrich). Lýzované bunky sa inkubovali pri - 80 stupni počas 30 minút a potom sa lyofilizovali a skladovali pri teplote miestnosti počas 10 minút. Výsledné vzorky sa vyčerili centrifugáciou pri 12, 000 x g počas 15 minút, potom sa pridali 2 mg/ml L-DOPA (Sigma-Aldrich) a inkubovali sa pri 37 stupňoch počas 1 hodiny. Absorbancia sa potom merala pri 490 nm pomocou enzýmového markera (BioTek). Absorbancia sa potom merala pri 490 nm pomocou BioTek.

Pre získanie kliknite semCistanche výhody bielenia pokožkyaaké sú účinky Cistanche tubulosa

9. Western blot analýza

Hladiny proteínov spojené s anti-melanogénnou dráhou boli stanovené intracelulárne analýzou Western blot extraktov celých buniek. Objem 500 μl B16BL6 myších melanómových buniek sa naočkoval do 24-jamkových doštičiek (1 x 105 buniek/jamku). Bunky boli lyzované inkubáciou v RIPA pufri (Thermo Fisher Scientific) počas 20 minút v prítomnosti zmesi inhibítorov proteázy (Roche, Nemecko) a ošetrené 50 μl 10, 50 a 100 μg/ml EV počas 24 hodín. Bunkové lyzáty sa centrifugovali pri 17 709 g počas 15 minút a koncentrácia proteínu vo výsledných lyzátoch sa stanovila pomocou testovacej súpravy BCA (Thermo Fisher Scientific). Rovnaké množstvá proteínu (10-20 ug/vzorku) sa naplnili do jamiek Bolt 4-12 percent gélov Bis-Tris Plus (Invitrogen) a elektrotransferovali na membrány PVDF (polyvinylidénfluorid) (GE Healthcare, Chicago, IL, USA). Membrány boli premyté Tris-pufrovaným fyziologickým roztokom obsahujúcim 0,2 percenta (v/v) desať -20 (TBST), uzavreté TBST obsahujúcim 5 percent (w/v) odstredeného mlieka (Gibco, Thermo Fisher Scientific) počas 1 hodiny pri teplote miestnosti a potom inkubované pri 4 stupňoch v roztoku primárnej protilátky zriedenej 1 % (w/v) odstredeného mlieka. Inkubácia sa uskutočnila cez noc. Použité primárne protilátky zahŕňali anti-TRP{27}} (1:1000), anti-TRP{31}} (1:1000) a anti-MITF (1:1000) protilátky od Abcam, Cambridge, UK; anti-TYR (1:500) protilátky od Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA). Na štandardizáciu na úrovni proteínov sa použila anti{40}}aktínová protilátka (1:500; Santa Cruz). Primárne protilátky boli detegované sekundárnou protilátkou značenou chrenovou peroxidázou (HRP) od Genetex (Irvine, CA, USA). Membrány sa premyli TBST a inkubovali sa 1 hodinu pri teplote miestnosti s 1:2000 zriedením sekundárnej protilátky v TBST. Signál generovaný po premytí membrány s TBST a inkubácii s činidlom zosilnenej chemiluminiscencie (ECL) (GE Healthcare) sa detegoval pomocou gélového zobrazovacieho systému ImageQuant 350 (GE Healthcare).

10. Detekcia intracelulárnej produkcie melanínu elektrónovou mikroskopiou

Bunky sa spracovali pomocou LEV alebo SEV a inkubovali sa 48 hodín. Po ošetrení boli bunky fixované inkubáciou s 200 mM kakodylátovým pufrom obsahujúcim 8 percent glutaraldehydu a 20 percent paraformaldehydu (Wako). Po dehydratácii etanolom sa pripravili ultratenké rezy pomocou mikrotómu Leica EM UC7 (Leica) a zozbierali sa na 200-medenej mriežke. Rezy boli zafarbené 1 percentom uranylacetátu a citrátu olovnatého a snímky boli získané transmisným elektrónovým mikroskopom JEOL JEM 1010 (JEOL) pri 80 kV.

Extrakt z cistanche

11. Meranie bieliaceho účinku pomocou modelu ľudskej kože

Na testovanie bieliaceho účinku LEV sa použil model ľudskej pokožky derm-me (Tego Science, Soul, Kórea). Ľudské kožné tkanivo bolo liečené 10 μg/ml lev počas 7 dní ako negatívna kontrola. Koncentrácia arbutínu bola 70 ug/ml. Ľudské kožné tkanivo sa rozpustilo v 1 N NaOH a merala sa absorbancia pri 405 nm pomocou enzýmového markera (BioTek) na stanovenie obsahu melanínu. Na 7. deň sa porovnala pigmentácia kože mikroskopickou analýzou vzoriek zafarbených Fontanou - mason. Na farbenie podľa Fontana-Massona sa vzorky kože fixovali cez noc pri teplote miestnosti v 4% paraformaldehyde (Waco), narezali a zaliali do parafínového vosku. Rezy zaliate parafínom sa potom zahrievali v sušiarni pri teplote 60 stupňov počas 1 hodiny, aby sa vysušili. Rezy sa potom trikrát namočili do xylénu, dvakrát do 95 % etanolu a dvakrát do 100 % etanolu a potom sa premyli destilovanou vodou. Farbenie Fontana-Masson sa uskutočnilo s použitím roztoku amoniakálneho striebra pri 56 stupňoch a premylo sa destilovanou vodou. Sklíčka sa potom fixovali v 0,2 % roztoku chloridu zlata a ponorili do 5 % roztoku tiosíranu sodného pri teplote miestnosti. Nakoniec boli sklíčka dehydratované v čerstvom alkohole.

12. Štatistická analýza

Údaje získané z experimentov sú vyjadrené ako priemer ± SEM. Vykonali sme experimenty so štyrmi šaržami aktivity, obsahu melanínu a aktivity TYR (doplnkový obrázok S3). Jednosmerná analýza rozptylu (ANOVA) a Dunnettov test sa uskutočnili s použitím GraphPad Prism (GraphPad Prism Software Inc., San Diego, CA, USA). p < rozdiely; 0.05, p < 0,01, p < 0,001 sa považovali za štatisticky významné.

Extrakt z Cistanche tubulosa

Diskusia

Na rozdiel od väčšiny eukaryotických buniek majú rastliny komplexnú bunkovú stenu, ktorá predstavuje dôležitú bariéru pre pohyb exozómov. Výsledkom je, že rastlinné bunky uvoľňujú exozómy prostredníctvom série multivezikulárnych teliesok fúzovaných s plazmatickou membránou. Sekrečné produkty uvoľňované rastlinnými sekrétmi sú uložené v periplazmatickej medzere susediacej s plazmatickou membránou; keď sa hromadia, vytvárajú tlak, ktorý umožňuje sekrétu prechádzať cez bariéru bunkovej steny. Výsledkom je, že vylučovaný materiál vrátane exozómov sa môže uvoľniť bez potreby energie. EV pochádzajúce z rastlín majú podobnú alebo väčšiu veľkosť ako prirodzene sa vyskytujúce exozómy živočíšnych buniek a sú podobné tým, ktoré sa pozorovali v exozomálnej tekutine slnečnice (50-200 nm) a EV Arabidopsis (50-300 nm). Účinnosť bunkovej absorpcie sa považuje za kľúčový determinant účinnosti, pretože ciele mnohých terapeutických činidiel sú lokalizované intracelulárne. Preto sme určili optimálne načasovanie a koncentráciu vychytávania melanómovými bunkami a pozorovali rýchly prenos LEV a SEV do melanómových buniek do 12 hodín.

TYR je glykoproteín, ktorý katalyzuje konverziu l-tyrozinázy na L-DOPA, čo je krok obmedzujúci rýchlosť syntézy melanínu. Obidve EV vykazujú antimelanogénny účinok, ale antimelanogénny účinok LEV je výrazne väčší ako účinok SEV.

Produkcia melanínu je regulovaná pomocou -MSH-MC1R a je známe, že inhibícia PKC znižuje pigmentáciu kože a vlasov. Mnohé genetické, biochemické a farmakologické štúdie však naznačujú, že signálna dráha -MSH-MC1R je hlavnou hnacou silou melanogenézy. Hoci naše experimenty nepreukázali priamu interakciu medzi MITF a TYR, preukázalo sa, že LEV inhibujú melanogenézu znížením expresie MITF prostredníctvom dráhy -MSHMC1R závislej od UV žiarenia, čo zase znižuje expresiu TYR, TRP-1, a TRP{10}}. Predpokladáme, že proteíny rodiny TRP sú navzájom nepriamo spojené, ale na preukázanie priamej interakcie medzi nimi môžu byť potrebné ďalšie experimenty. Okrem toho rekonštruované modely ľudskej kože ukazujú, že syntéza melanínu indukovaná UV žiarením a obsah melanínu sú účinne inhibované LEV.

Cistanche dulcis

Záver

Naše zistenia naznačujú, že LEV sú kandidátmi na nové antimelanogénne lieky, ktoré znižujú melanogenézu inhibíciou expresie proteínov súvisiacich s melanínom. Výsledky potvrdili, že LEV znížili MITF a tým znížili TRP v bunkách melanómu B16BL6. levs a arbutín inhibovali TRY o 66 percent a 67 percent. Obsah melanínu v rekonštruovanej koži ošetrenej LEV sa znížil o 43 percent a 28 percent v porovnaní s neošetrenou negatívnou kontrolou a arbutínom ako pozitívnou kontrolou, v tomto poradí.

Na základe skorých zistení sa domnievame, že EV získané z rastlín by mohli byť užitočné ako antimelanogénne činidlo pri vývoji prírodnej kozmetiky. V budúcnosti je potrebný ďalší výskum na vývoj EV pochádzajúcich z rastlín ako účinnej zložky na zlepšenie pokožky a je potrebné preukázať bezpečnosť EV pochádzajúcich z rastlín na modeloch ľudskej pokožky. Naše výsledky naznačujú, že EV možno použiť na redukciu melanínu a tým aj na rozjasnenie pleti. EV však môže mať toxické účinky na kožu a mali by sa vykonať ďalšie experimenty, ako sú alergické testy alebo Amesove testy.

LITERATÚRA

[1] Nosanchuk JD, Nimrichter L, Casadevall A, et al. Úloha vezikulárneho transportu makromolekúl cez bunkové steny v patogenéze húb. Commun Integr Biol. 2008;1(1):37–39.

[2] Robinson DG, Ding Y, Jiang L. Nekonvenčná sekrécia proteínov v rastlinách: kritické hodnotenie. Protoplazma. 2016;253(1):31–43.

[3] Paiva EA. Ako prechádzajú sekrečné produkty cez bunkovú stenu rastliny, aby sa uvoľnili? Nová hypotéza zahŕňajúca cyklické mechanické pôsobenie protoplastu. Ann Bot. 2016;117(4):533–540.

[4] Hood JL, Scott MJ, Wickline SA. Maximalizácia exozómovej koloidnej stability po elektroporácii. Anal Biochem. 2014;448(1):41–49.

[5] Rutter BD, Innes RW. Extracelulárne vezikuly izolované z listového apoplastu nesú proteíny reakcie na stres. Plant Physiol. 2017;173(1):728–741.

[6] Luan X, Sansanaphongpricha K, Myers I, a kol. Vytvorenie exozómov ako rafinovaných biologických nanoplatforiem na dodávanie liekov. Acta Pharmacol Sin. 2017;38(6):754–763.

[7] Videira IF, Moura DF, Magina S. Mechanisms regulating melanogenesis. Dermatol z podprsenky. 2013;88(1):76–83.

[8] Park HY, Lee J, Kapasi S, a kol. Lokálna aplikácia inhibítora proteínkinázy C znižuje pigmentáciu kože a vlasov. J Invest Dermatol. 2004;122(1):159–166.

[9] Yamanishi DT, Graham M, Buckmeier JA, et al. Diferenciálna expresia génov proteínkinázy C v normálnych ľudských neonatálnych melanocytoch a metastatických melanómoch. Karcinogenéza. 1991;12(1):105–109.

[10] Borovský J, Riley PA. Melaníny a melanozómy: biosyntéza, biogenéza, fyziologické a patologické funkcie. Hoboken, NJ: Wiley-Blackwell; 2011

[11] D'Mello S, Finlay G, Baguley B a kol. Signálne dráhy v melanogenéze. Int J Mol Sci. 2016;17(7):1–18.