Ako oddeliť akteozid od Cistanche Tubulosa

Helin Xu a, Xueqin Li a,⇑ , Yanyan Hao a, Xiaobin Zhao a, Yun Cheng a, Jinli Zhang a,b

škola chémie a chemického inžinierstva/kľúčové laboratórium pre ekologické spracovanie chemického inžinierstva v Xinjiang Bingtuan, Univerzita Shihezi, Shihezi 832003, Čína

b Kľúčové laboratórium pre zelenú chemickú technológiu Ministerstva školstva, Škola chemického inžinierstva a technológie, Univerzita Tianjin, Tianjin 300072, Čína

Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Abstraktné

Na dosiahnutie jednoduchého a efektívneho oddeleniaakteozid(ACT), extrakcia ACT zo surových extraktov zCistanchetubulosaprostredníctvom iónovej kvapaliny (IL) na báze vodného dvojfázového systému (ATPS). IL-ATPS obsahujúci [C4mim]BF4 a (NH4)2SO4 vykazuje vynikajúci extrakčný výkon, pričom extrahuje takmer všetok ACT(Acteozid)v bohatej fáze [C4mim]BF4-. Vysoká polarita [C4mim]BF4 s receptormi s viacerými vodíkovými väzbami vedie k extrakcii ACT(Acteozid)vo fáze bohatej na IL a (NH4)2SO4 poskytuje nielen slabo kyslé mikroprostredie na zvýšenie stability ACT vo fáze bohatej na IL, ale tiež znižuje rozpustnosť ACT(Acteozid)vo fáze bohatej na soľ prostredníctvom efektu vysolovania. Okrem toho výsledky molekulárnej simulácie ukazujú, že sa extrahuje vo fáze bohatej na [C4mim]BF4- prostredníctvom viacerých interakcií vrátane vodíkových väzieb, van der Waalsových síl a vrstvenia p–p. Očakáva sa, že táto štúdia poskytne cennú referenciu na oddelenie bioaktívnych zložiek od prírodných produktov.

Kľúčové slová:Iónové kvapaliny, Soľ, Vodný dvojfázový systém, Extrakcia,akteozid

akteozidvCistanche tubulosa

Úvod

Cistanchetubulosa(Orobanchaceae) je parazitická rastlina, ktorá rastie na koreňoch Tamarix a Salvadora a je rozšírená najmä v suchých krajinách a púšťach severozápadnej Číny [1–3]. Stonky Cistanche tubulosa, známe ako „ženšen púští“, sú oficiálne zaznamenané v Čínskom liekopise (vydanie z roku 2015) [4,5] a ich hlavnými zložkami sú fenyletanoidové glykozidy (PhG), polysacharidy a iridoidy.

PhG zlúčeniny, skupina vo vode rozpustných bioaktívnych zložiek vCistanchetubulosamajú spoločnú štruktúru zloženú z kyseliny škoricovej a hydroxyfenyletylových skupín, ktoré sú pripojené k b-glukopyranózovej skupine prostredníctvom esterových a glykozidických väzieb [6].akteozid(ACT) je hlavnou zložkou zlúčenín PhG a je indexovou zložkou na stanovenie obsahuCistanchetubulosa[7]. Moderné chemické a farmakologické štúdie preukázali, že ACT(Acteozid)vykazuje viaceré farmakologické aktivity, ako sú antioxidačné, protiúnavové, neuroprotektívne a hepatoprotektívne [8–10]. ACT má teda široké uplatnenie v oblasti medicíny, zdravotnej starostlivosti, potravinárstva atď. Avšak separácia a čistenie ACT(Acteozid)sú ťažké kvôli komplexnému zloženiu PhG zlúčenín, ktoré majú podobnú štruktúru, polaritu a rozpustnosť. V súčasnosti medzi hlavné metódy separácie a čistenia ACT patrí molekulárny imprinting, separácia makroporéznou adsorpčnou živicou, vysokorýchlostná protiprúdová chromatografia a membránová separácia. Napríklad Liu a kol. použili makroporézne živice na oddelenie PhG od Cistanche deserticola a Xu a kol. použili mezoporézne uhlíkové adsorbenty na adsorpciu PhG a adsorpčná kapacita dosiahla 358,09 mg/g. Tieto metódy však majú množstvo nevýhod, ako je časová náročnosť, zložitý postup a nízka selektivita. Preto je veľmi žiaduci vývoj jednoduchej a účinnej metódy na selektívnu separáciu bioaktívnych zložiek z prírodných produktov.

mikronizovaná purifikovaná flavonoidová frakcia

V posledných rokoch sa vodný dvojfázový systém (ATPS), ktorý možno vykonávať v miernom prostredí a je ľahko škálovateľný [11–15], objavil ako nová technika extrakcie kvapalina-kvapalina na separáciu bioaktívnych zložiek [16 –19]. Podľa zloženia možno ATPS rozdeliť na tri typy, tj dva alebo viac polymérov, polymér a soľ alebo dve povrchovo aktívne látky [20–23]. Avšak takmer všetky polyméry tvoriace fázu majú vysokú viskozitu a úzky rozsah polarity, ktoré nevedú k prenosu hmoty a obmedzujú selektivitu. V tomto kontexte sa iónové kvapaliny (IL) vyznačujú zanedbateľnou prchavosťou, chemickou stabilitou, komplexnou rozpustnosťou pre organické zlúčeniny a väčšina IL je šetrná k životnému prostrediu [24–28]. Tieto vlastnosti poskytujú IL-APTS lepší výkon ako iné ATPS pri separácii bioaktívnych zložiek. V porovnaní s tradičným ATPS IL-ATPS spája výhody IL aj ATPS, ako je rýchla separácia fáz, vysoký extrakčný výkon a biologická kompatibilita s prostredím [12,29,30]. V súčasnosti sa IL-ATPS neaplikuje na separáciu a čistenie ACT(Acteozid), ale zistilo sa, že IL-ATPS možno použiť pri extrakcii a separácii polysacharidov [31], vanilínu [32], polysacharidov z aloe [33], ženšenových saponínov [11] atď. Napríklad He et al. extrahované bioaktívne ženšenové saponíny pomocou IL-ATPS, čo sa preukázalo ako jednoduchá a účinná metóda na extrakciu ginsenosidov s vysokou účinnosťou extrakcie 99,5 percenta a rozdeľovacím koeficientom 651. Gao et al. extrahovaný astaxantín vo fáze bohatej na [P4448]Br s použitím IL ATPS obsahujúceho [P4448]Br a K3P04 s účinnosťou extrakcie až 93,08 percent [34]. Tieto výsledky ukazujú, že IL-ATPS má potenciálne aplikačné vyhliadky na oddelenie bioaktívnych zložiek od prírodných produktov a možno očakávať, že dosiahne vysoko selektívne oddelenie ACT odCistanchetubulosa.

V tejto štúdii je jednoduchá, efektívna a zelená technika založená na extrakcii ATPS na vysoko selektívnu separáciu ACT(Acteozid)zo surových extraktov zCistanchetubulosaje preskúmaná. Rôzne IL ([C4mim][CF3SO3], [C4mim]Cl, [C4mim]BF4, [C2mim]Br, [C4mim]Br, [C6mim]Br a [C8mim]Br) a typy solí (NaCl, Na2SO4, Na3C6H5O7 , (NH4)2SO4 a NaH2PO4) boli skúmané na určenie optimálneho IL-ATPS na extrakciu ACT(Acteozid). Okrem toho boli extrakčné podmienky upravené tak, aby sa dosiahla vysoko selektívna separácia ACT vo fáze bohatej na IL. Podrobne je diskutovaný vplyv rôznych extrakčných podmienok (napr. extrakčnej teploty, koncentrácie IL, koncentrácie roztoku vzorky, koncentrácie soli, pH a doby extrakčnej rovnováhy) na výkon extrakcie ACT. Okrem toho sa uskutočnili molekulárne simulácie na ACT, [C4mim] BF4 a H2O, aby sa odhalil mechanizmus extrakcie.

cistanche tubulosa vs deserticola

2. Experimentálne

2.1. Materiály

Stonky zCistanchetubulosaboli dodané Cong Rongtang Biological Technology Co., Ltd. (Xinjiang, Čína). Normy ACT(Acteozid)(čistota - 98 percent, Obr. 1a) a echinakozid (čistota - 98 percent, Obr. 1b) dodal Sunny Biotech Co., Ltd. (Shanghai, Čína). 1-Butyl-3-metylimidazoliumtrifluórmetánsulfonát ([C4mim][CF3SO3]), 1-butyl-3-metylimidazoliumchlorid ([C4mim]Cl), 1-butyl{ {13}}metylimidazoliumtetrafluórborát ([C4mim]BF4), 1-etyl-3-metylimidazoliumbromid ([C2mim]Br), 1-butyl-3-metylimidazoliumbromid ([C4mim] Br), 1-hexyl-3-metylimidazoliumbromid ([C6mim]Br) a 1-oktyl-3-metylimidazoliumbromid ([C8mim]Br) dodal Chengjie Chemical Co. , Ltd. (Shanghai, Čína). Síran amónny analytickej čistoty ((NH4)2SO4), dihydrogenfosforečnan sodný (NaH2PO4), síran sodný (Na2SO4), hydrogenfosforečnan sodný (Na2HPO4), hydrogenfosforečnan draselný (K2HPO4), chlorid sodný (NaCl) a bezvodý citran trisodný (Na3C6H5O7 ) dodáva Shengao Chemical Reagent Co., Ltd. (Tianjin, Čína). Metanol, kyselina octová a acetonitril chromatografickej kvality dodal Aladdin Chemical Co., Ltd. (Shanghai, Čína). Etanol analytickej kvality dodal Fuyu Fine Chemical Co., Ltd. (Tianjin, Čína).

Obr. 1. Chemické štruktúry (a)akteozid(ACT) a (b) enchinakozid.

2.2. Príprava surových extraktov z Cistanche tubulosa

Vzorka v práškuCistanchetubulosa(20 mg) sa namočilo do 500 ml 50-percentného etanolového roztoku s ultrazvukom na 2 hodiny. Zvyšok v roztoku sa oddelil centrifugáciou pri rýchlosti 5000 otáčok za minútu počas 10 minút. Supernatant po centrifugácii sa postupne prefiltroval použitím 0,45 a 0,22 um filtrov. Potom sa filtrát skoncentroval a vysušil pri 323 K vo vákuovej sušiarni. Nakoniec sa vysušený produkt rozpustil vo vode a pridal sa červenohnedý extraktCistanchetubulosabola získaná.

2.3. Extrakcia ACT(Acteozid)pomocou IL-ATPS

Schéma efektívnej extrakcie ACT(Acteozid)pomocou IL-ATPS je znázornené na obr. 2. Podľa toho bolo 3,75 ml [C4mim]BF4, 3,5 ml destilovanej vody, 11,11 % hmotn. soli a 10 ml roztoku vzorky s rovnakou koncentráciou ACT a echinakozidu pridá sa do 50 ml centrifugačnej skúmavky. Ďalší IL-ATPS s rovnakými zložkami okrem roztoku vzorky bol pripravený ako kontrastný systém. Soľ IL-ATPS sa úplne rozpustila ultrazvukom a tvorba dvoch čírych fáz sa urýchlila centrifugáciou pri 8000 ot./min. počas 8 minút. Spodná fáza IL-ATPS bola fáza bohatá na IL a horná fáza bola fáza bohatá na soľ. Zložky oboch fáz boli kvantitatívne analyzované pomocou vysokoúčinnej kvapalinovej chromatografie (HPLC).

Koncentrácia ACT(Acteozid)a echinakozid v dvoch fázach sa určil pomocou HPLC a extrakčný výkon sa vyhodnotil podľa účinnosti extrakcie (E, percent), rozdeľovacieho koeficientu (K) a selektivity (S). Nasledujúce Eq. (1) rovnica sa použila na výpočet K

K=Cb/Ct (1)

kde Cb a Ct (mg/ml) je ACT(Acteozid)koncentrácie v spodnej a hornej fáze. Eqs. (2) a (3) sa použili na výpočet E a S.

E=Cb*Vb/Mv*100 percent (2)

S=K/Kt=Cb*Cet / Ct*Ceb (3)

kde mv (mg) je hmotnosť ACT(Acteozid)v roztoku vzorky je Vb (ml) objem v spodnej fáze a koncentrácie Cet a Ceb echinakozidu v hornej a spodnej fáze (mg/ml).

Obr. 2. Schéma účinnej extrakcie ACT pomocou IL-ATPS

2.4. Selektívne experimenty

ACT(Acteozid)a echinakozid sa považujú za konkurentov pri hodnotení selektivity IL-ATPS voči ACT(Acteozid)v dôsledku podobnej molekulárnej štruktúry a chemických vlastností ACT(Acteozid)a echinakozid. 3,75 ml[C4mim]BF4, 3,5 ml destilovanej vody, 11,11 % hmotn. soli a 10 ml roztoku vzorky s rovnakou koncentráciou ACT a echinakozidu sa pridalo do 50 ml centrifugačnej skúmavky. Soľ IL-ATPS sa úplne rozpustila ultrazvukom a tvorba dvoch čírych fáz sa urýchlila centrifugáciou pri 8000 ot./min. počas 8 minút. Spodná fáza IL-ATPS bola fáza bohatá na IL a horná fáza bola fáza bohatá na soľ. Zložky oboch fáz sa kvantitatívne analyzovali pomocou HPLC.

2.5. HPLC analýza

Koncentrácia roztoku vzorky v dvoch fázach sa analyzovala pomocou HPLC (2695, Waters Co., USA) s C18 kolónou pri 330 nm s použitím ultrafialového detektora. Na separáciu a detekciu vzoriek pri teplote kolóny 303 K bola použitá metóda gradientovej elúcie. Mobilnými fázami boli (a) acetonitril a (b) kyselina octová/voda (1:44, obj./obj.) a prietok bol nastavená na 1 ml/min. Mobilná fáza a vzorky sa pred injekciou prefiltrovali cez 0,22 lm filter. Všetky experimenty sa uskutočnili trikrát a na všetkých obrázkoch je uvedený chybový stĺpec.

2.6. Charakterizácia

ACT, [C4mim]BF4 a [C4mim]BF4- bohatá fáza sa analyzovali infračervenou spektroskopiou s Fourierovou transformáciou (FTIR) s použitím Bruker Vertex 70 (Bruker Optics, Ltd., Nemecko). FTIR spektrá ACT, [C4mim]BF4 a fázy bohatej na [C4mim]BF4- sa získali od 4000 do 500 cm1 s rozlíšením 2 cm1 s použitím bromidu draselného ako referencie.

2.7. Molekulárna simulácia

Aby sa získal prehľad o mechanizme extrakcie IL-ATPS, ako aj o režimoch interakcie medzi ACT a [C4mim]BF4 v IL ATPS, uskutočnili sa výpočty prvého princípu založené na teórii funkčnej hustoty (DFT). Optimalizácie a jednobodové energetické výpočty boli vykonané pomocou funkcionálu M06–2X [35,36] a základná sada 6–31 plus G (d) bola použitá na opis atómov C, H, F, B, N a O [37]. Na presnú simuláciu slabých interakcií bola na adekvátny popis disperzných interakcií použitá metóda DFT– D3 [38]. Podľa predchádzajúcich správ [39] sa uskutočnili molekulárne simulácie na ACT, [C4mim]BF4 a H2O. Najprv sa optimalizovali individuálne konformácie modelov ACT a [C4mim]BF4 a potom sa optimalizovala väzbová konformácia [C4mim]BF4 a ACT na základe ich optimálnej individuálnej konfigurácie.

Väzbové energie (DE) ACT(Acteozid)a [C4mim]BF4 a väzbové energie (DE) ACT a H20 boli hodnotené pomocou Eqs. (4) a (5).

△E = Ecom- (EACTplus EIL)
△E = Ecom - (EH2O plus EACT)

kde EH2O, EACT, EIL a Ecom sú potenciálne energie ACT(Acteozid)[C4mim]BF4, H20, respektíve ich komplexy. Všetky výpočty boli uskutočnené pomocou programu Gaussian16 [40] a všetky molekuly boli nakreslené pomocou softvéru VMD v.1.9.3. Medzitým bol vytvorený nezávislý gradientový model (IGM) na identifikáciu a kvantifikáciu čistého zoslabenia gradientu elektrónovej hustoty v softvéri Multiwfn v.3.5.

akteozidvCistanche tubulosa

3. Výsledky a diskusia

3.1. Optimalizácia IL-ATPS

3.1.1. Skríning IL

Na vyhodnotenie účinku typu IL na extrakčný výkon v IL-ATPS sa vybralo sedem druhov IL s rôznymi katiónmi a aniónmi ako zložky tvoriace fázu na extrakciu ACT.(Acteozid). Ako je znázornené na obr. 3 (a), interakcia medzi aniónmi ACT a IL bola skúmaná skúmaním kombinácie [C4mim] plus ako katión s rôznymi aniónmi vrátane Br-, Cl-, [CF3SO3] - a BF{{7 }}. Výsledky ukázali, že anióny IL zvýšili ACT(Acteozid)extrakčný výkon v poradí BF4- > [CF3SO3] - > Br- > Cl- . Optimálny IL anión bol BF4, čo možno pripísať skutočnosti, že zodpovedajúci IL môže poskytnúť viac receptorov vodíkových väzieb pre hydroxylové skupiny ACT(Acteozid)ako iné IL anióny [21]. To naznačuje, že vodíková väzba je hlavnou interakciou medzi IL aniónmi a ACT.

Ďalej sa skúmala kombinácia Br s rôznymi katiónmi vrátane [C2mim] plus, [C4mim] plus, [C6mim] plus a [C8mim] plus, aby sa preskúmala optimálna stérická konfigurácia medzi ACT(Acteozid)a ILscations. Výsledky ukázali, že ACT(Acteozid)extrakčný výkon sa zvýšil s klesajúcou dĺžkou alkylového reťazca z [C8mim] plus na [C2mim] plus. Pretože [C2mim] plus netvoril zodpovedajúci ATPS s BF4, bol [C4mim] plus vybraný ako optimálny IL katión

To možno pripísať vysokej polarite krátkeho alkylového reťazca [C4mim] plus, čo bolo prospešné pre rozpustenie ACT(Acteozid)a jeho extrakcia vo fáze bohatej na IL. Okrem toho má imidazolový katión [C4mim] plus aromatický p systém, ktorý môže vytvárať interakcie p – p s benzénovým kruhom ACT, aby sa dosiahla optimálna stereo konfigurácia. Preto bol [C4mim]BF4 vybraný ako optimálny pre nasledujúce experimenty.

3.1.2. Skríning solí

Na vyhodnotenie účinku typu soli na ACT(Acteozid)extrakčný výkon, bolo vybraných päť druhov solí (NaH2P04, (NH4)2SO4, Na2S04, NaCl a Na3C6H5O7) na vytvorenie IL-ATPS s [C4mim]BF4 a výsledky sú znázornené na obr. 3 (b). Soľ možno rozdeliť na kyslé (NaH2PO4 a (NH4)2SO4), neutrálne (Na2SO4 a NaCl) a zásadité (Na3C6H5O7) soli. Z obr. 3 (b) je zrejmé, že (NH4)2S04 poskytuje IL-ATPS s vynikajúcim výkonom extrakcie ACT. Výsledok naznačuje, že rozdiel v účinnosti extrakcie, rozdeľovacom koeficiente a selektivite súvisí so stabilitou ACT(Acteozid)v rôznych extrakčných mikroprostrediach.

Obr. 3. Skríning ATPS. (a) Typy IL a (b) typy solí

Glykozidy kyslých fenolov ACT sú stabilné v slabo kyslých systémoch. Keďže (NH4)2SO4 je kyslá soľ, môže poskytnúť slabo kyslé mikroprostredie pre IL-ATPS. To prispieva k zvýšeniu účinnosti extrakcie a udržaniu stability ACT(Acteozid)vo fáze bohatej na IL. Okrem toho, schopnosť vysolovania rôznych typov solí bola odlišná od schopnosti (NH4)2SO4, bola silnejšia ako schopnosť NaH2PO4 [24,41]. Soľ (NH4)2SO4 súťaží s ACT(Acteozid)pre molekuly H2O vo fáze bohatej na soľ, čím sa zníži rozpustnosť ACT vo fáze bohatej na soľ, a ACT sa môže účinne extrahovať vo fáze bohatej na IL. V nasledujúcich experimentoch sa teda ako optimálna soľ zvolila (NH4)2SO4.

3.2. Optimalizácia extrakčných podmienok v IL–ATPS

3.2.1. Vplyv extrakčnej teploty

Podľa predchádzajúcich štúdií [42] má extrakčná teplota významný vplyv na extrakčný výkon pre bioaktívne zložky v IL-ATPS, nízka teplota je prospešnejšia pre tvorbu IL-ATPS. Obr. 4 (a) predstavuje vplyv [C4mim] BF4-(NH4)2SO4 ako IL-ATPS s extrakčnou teplotou v rozsahu 278–318 K na extrakčný výkon ACT(Acteozid). Obr. 4 (a) ukazuje, že účinnosť extrakcie, rozdeľovací koeficient a selektivita klesali so zvyšujúcou sa teplotou extrakcie, čo naznačuje, že vysokoteplotné podmienky neboli vhodné na extrakciu ACT v IL-ATPS.

Dôvodom bolo najmä to, že účinok vysolovania bol oslabený a bol výsledkom toho, že voda vo fáze bohatej na IL sa preniesla do fázy bohatej na soľ v IL-ATPS pri vysokých extrakčných teplotách [42]. Okrem toho experimentálna štúdia ukázala, že vysoká extrakčná teplota neprispievala k stabilnej existencii ACT(Acteozid). Optimálna teplota extrakcie bola teda stanovená na 278 K

3.2.2. Účinok koncentrácie [C4mim]BF4

Obr. 4 (b) ukazuje vplyv koncentrácie [C4mim]BF4 od 20 do 60 % hmotn. na extrakčný výkon pre ACT(Acteozid)v IL-ATPS. Ako je znázornené na obr. 4 (b), výkon extrakcie ACT sa očividne zvýšil, keď sa koncentrácia [C4mim]BF4 zvýšila z 20 na 50 % hmotn. Výkon extrakcie sa však mierne znížil, keď sa koncentrácia [C4mim]BF4 zvýšila z 50 na 60 % hmotn. Vysoká koncentrácia [C4mim]BF4 teda viedla k extrakcii ACT vo fáze bohatej na [C4mim]BF4-, ale nadmerná koncentrácia [C4mim]BF4 nad 50 % hmotn. viedla k zníženiu výkonu extrakcie ACT.

Je to pravdepodobne spôsobené zvýšením rozpustnosti ACT vo fáze bohatej na [C4mim]BF4- pri vysokej koncentrácii [C4mim]BF4 v dôsledku vysokej afinity medzi ACT a [C4mim]BF4. ACT bol teda ľahko extrahovaný vo fáze bohatej na [C4mim]BF4- zvýšením koncentrácie [C4mim]BF4. Avšak nad koncentráciou [C4mim]BF4 50 % hmotn. sa viskozita IL-ATPS zvýšila, čo viedlo k slabému prenosu hmoty na extrakciu. Optimálna koncentrácia [C4mim]BF4 na extrakciu ACT bola teda 50 % hmotn.

3.2.3. Vplyv koncentrácie roztoku vzorky

Koncentrácia roztoku vzorky bola dôležitou podmienkou pre ACT(Acteozid)extrakcia. Obr. 4 (c) ukazuje vplyv koncentrácie roztoku vzorky na účinnosť extrakcie, rozdeľovací koeficient a selektivitu, čo môže odrážať migračnú schopnosť ACT medzi hornou a spodnou fázou. Obr. 4 (c) ukazuje, že účinnosť extrakcie, rozdeľovací koeficient a selektivita ACT(Acteozid)zvyšovala so zvyšujúcou sa koncentráciou roztoku vzorky z {{0}},5 na 2,5 mg/ml. Výkon extrakcie ACT sa však mierne znížil s ďalším zvýšením koncentrácie roztoku vzorky z 2,5 na 3,0 mg/ml. Vysoká koncentrácia roztoku vzorky podporovala rozpustnosť ACT(Acteozid)vo fáze bohatej na [C4mim]BF4-v dôsledku silnej afinity medzi ACT a [C4mim]BF4.

Zníženie extrakčného výkonu možno pripísať nasledujúcim dôvodom: Na jednej strane nadmerné zvýšenie koncentrácie roztoku vzorky nezlepšilo extrakčný výkon IL-ATPS, keď už bola fáza bohatá na [C4mim]BF4- nasýtený v ACT. Na druhej strane zvýšenie koncentrácie roztoku vzorky spôsobilo zvýšenie intramolekulárnych vodíkových väzieb a agregáciu ACT(Acteozid)molekúl, čo neprispievalo k prenosu hmoty. Optimálna koncentrácia roztoku vzorky bola teda stanovená na 2,5 mg/ml.

3.2.4. Vplyv koncentrácie (NH4)2SO4

Vplyv rôznych koncentrácií (NH4)2SO4 na účinnosť extrakcie, rozdeľovací koeficient a selektivitu je znázornený na obr. 4 (d). Experimentálny výsledok ukázal, že tieto tri parametre rástli so zvyšujúcou sa koncentráciou (NH4)2SO4 z 2,22 na 11,11 % hmotn. Výkon extrakcie ACT sa však znížil s ďalším zvýšením koncentrácie roztoku vzorky z 11,11 na 16,66 % hmotn.

To možno pripísať efektu vysolovania, ktorý je kľúčovou vlastnosťou pre extrakciu ACT(Acteozid)in the [C4mim]BF4-rich phase. The increase in (NH4)2SO4 concentration can increase the salting-out effect, resulting in a decrease in the solubility of ACT in the(NH4)2SO4–rich phase, which favors ACT extraction in the [C4mim]BF4-rich phase. However, an excessive increase in the(NH4)2SO4 concentration (>11,11 % hmotn.) viedlo k zníženiu obsahu vody vo fáze bohatej na [C4mim]BF4-, čo by oslabilo jej afinitu k ACT. To spôsobilo zníženie účinnosti extrakcie, rozdeľovacieho koeficientu a selektivity. Preto optimálna koncentrácia (NH4)2SO4 bola 11,11 % hmotn.

3.2.5. Vplyv pH

Vplyv pH na ACT(Acteozid)účinnosť extrakcie, rozdeľovací koeficient a selektivita v IL-ATPS boli skúmané v rozsahu pH 2.0–7.0. Ako je vidieť na obr. 4 (e), tri extrakčné parametre sa zvýšili, keď sa pH zvýšilo z 2.0 na 6.0. Výkon extrakcie sa však znížil pri pH 7.{11}}

Na jednej strane glykozidy kyslých fenolov ACT(Acteozid)by bol stabilný v kyslom prostredí, zatiaľ čo v alkalických roztokoch by bol disociovaný [6]. Na druhej strane, ACT môže podliehať ionizácii podľa rovnováhy HA $ H plus plus A pri rôznych hodnotách pH [33], pričom ide o neionizovanú formu, ktorá má tendenciu vstúpiť do fázy bohatej na IL, uprednostňovanej v kyslých podmienkach. Extrakčný experiment by sa teda mal vykonávať v mierne kyslom prostredí pri optimálnom pH 6.

3.2.6. Vplyv doby extrakcie

Vplyv doby extrakcie na ACT(Acteozid) extraction efficiency, partition coefficient, and selectivity were explored in the range of 10–200 min. As can be seen from Fig. 4 (f), the ACT extraction performance increased with the extraction time, and the maximum extraction efficiency (>99%), partition coeffificient (>35), and selectivity (>225) sa získali po 130 minútach. Okrem toho ACT(Acteozid)sa zistilo, že je stabilný v slabo kyslom mikroprostredí po dlhú dobu. Preto bolo ako optimálny čas extrakcie zvolených 130 minút.

3.3. Mechanizmus extrakcie ACT pomocou [C4mim]BF4–(NH4)2SO4 ATPS

3.3.1. FTIR analýza

Obr. 5 ukazuje FTIR spektrá ACT(Acteozid), [C4mim]BF4 a [C4mim]BF4-bohatá fáza. Ako je ukázané v FTIR spektre [C4mim] BF4, píky pri 3162 a 3122 cm1 možno pripísať symetrickej naťahovacej vibrácii CAH a asymetrickej naťahovacej vibrácii CAH z imidazolu, v tomto poradí. Pás na 1012 cm 1 môže byť priradený k naťahovacej vibrácii BF4-.

V FTIR spektre bohatej fázy [C4mim]BF4- sa neobjavili žiadne nové píky v porovnaní s FTIR spektrami ACT(Acteozid)a [C4mim]BF4. Charakteristický vrchol BF4- pri 1012 cm- 1 sa však posunul na vyššiu frekvenciu v dôsledku vodíkovej väzby medzi ACT a atómami F. Okrem toho sa charakteristické vrcholy CAH pri 3162 a 3122 cm1 posunuli k nižším frekvenciám. To možno pripísať dvom dôvodom: (1) vytvoreniu vodíkovej väzby medzi ACT a atómom N v [C4mim] plus a (2) vytvoreniu p–p vrstvenia medzi benzénovým kruhom ACT a imidazolovým kruhom z [C4mim] plus . Tento výsledok bol v súlade s výsledkami molekulárnej simulácie.

Obr. 5. FTIR spektrá ACT, [C4mim]BF4 a [C4mim]BF4-bohatej fázy.

3.3.2. Molekulárna simulácia

Preskúmať mechanizmus extrakcie, možné režimy interakcie medzi ACT(Acteozid)a [C4min] plus, BF4- a H2O boli skúmané pomocou molekulárnych simulácií. Obr. 6 ukazuje optimálne režimy interakcie a väzbovú konformáciu ACT–[C4min] plus, ACT–BF4 a ACT–H2O. Ako je znázornené na obr. 6a–h, ACT a [C4mim] plus vykazovali dve optimálne väzbové konformácie, tj ACT–[C4mim] plus –1 a ACT–[C4mim] plus –2, ACT a BF4 mali jednu optimálnu väzbovú konformáciu , ACT–BF4- a ACT a H2O mali päť optimálnych väzbových konformácií ACT–H2O–1, ACT–H2O–2, ACT–H2O–3, ACT–H2O–4 a ACT–H2O–5.

Okrem toho je možné použiť väzbovú energiu na vysvetlenie interakcií medzi dvoma molekulami. Podľa výsledkov molekulárnej simulácie sú väzbové energie ACT–[C4mim] plus –1, ACT–[C4mim] plus –2, ACT–BF4, ACT–H2O–1, ACT–H2O–2, ACT–H2O–3 , ACT–H2O–4 a ACT–H2O–5 boli - 129,71, - 136,53,-130,82, - 60,78, - 53 .00, - 76,76, -66,55 a -53,49 kJ/mol, v tomto poradí. Tieto hodnoty naznačujú, že väzbová energia s [C4mim]BF4 bola silnejšia ako väzbová energia molekúl H2O. ACT mal teda vysokú afinitu k [C4mim] BF4 a ľahko vstúpil do fázy bohatej na [C4mim] BF4.

Na ďalšie skúmanie interakcií medzi rôznymi molekulami boli pomocou analýzy IGM ilustrované režimy interakcie ACT–[C4min] plus, ACT–BF4- a ACT–H2O. Ako je znázornené na obr. 6a a b, interakcia medzi ACT(Acteozid)a [C4mim] plus zahŕňali hlavne vodíkové väzby a van der Waalsove sily. Okrem toho ACT–[C4mim] plus –1 a ACT–[C4mim] plus –2 vykazovali podobné konformačné charakteristiky, pričom benzénový kruh ACT a imidazolový kruh [C4mim] plus boli navzájom paralelné a umiestnené vo vzdialenosti približne 4 Á. To naznačuje existenciu interakcie skladania aplikácií medzi ACT(Acteozid)a [C4mim] plus [43]. Obr. 6c ukazuje prítomnosť silných vodíkových väzieb a van der Waalsových interakcií medzi ACT a BF4-. Navyše, ako je znázornené na obr. 6d-h, keď bol ACT rozpustený v H2O, molekuly ACT a H2O boli viazané hlavne vodíkovými väzbami a van der Waalsom. Na základe konformačných charakteristík a hodnôt väzbovej energie možno teda dospieť k záveru, že ACT bol extrahovaný vo fáze bohatej na [C4mim]BF4- prostredníctvom vodíkových väzieb, van der Waalsových interakcií a p-p vrstvenia.

Obr. 6. IGM analýza interakcií ACT–[C4min] plus, ACT–BF4- a ACT–H2O: (a) ACT–[C4mim] plus –1, (b) ACT–[C4mim] plus –2, (c) ACT–BF4, (d) ACT–H2O–1, (e) ACT–H2O–2, (f)ACT–H2O–3, (g) ACT–H2O–4 a (h ) ACT–H2O–5.

3.4. Extrakcia surového extraktu

Za optimálnych extrakčných podmienok sa na skúmanie extrakcie surového extraktu použil IL-ATPS. Ako je uvedené v tabuľke 1, IL-ATPS môže účinne extrahovať ACT(Acteozid)zo surového extraktu zCistanchetubulosado fázy bohatej na IL a IL-ATPS nemá takmer žiadnu zmenu v extrakčnom výkone ACT(Acteozid)zo surového extraktu v porovnaní s extrakčným výkonom štandardného roztoku. Preto táto metóda dokáže efektívne extrahovať ACT(Acteozid)zo surového extraktu zCistanchetubulosa, ktorý môže poskytnúť referenciu pre extrakciu bioaktívnych zložiek v budúcnosti.

3.5. Oddelenie ACT od fázy bohatej na IL

Metódy extrakcie rozpúšťadlom a adsorpcie na získanie ACT(Acteozid)a opätovné použitie IL sa skúma v tejto časti. Najprv sa pre spätnú extrakciu zvažovali organické rozpúšťadlá, ako je n-butanol (NBA), etylacetát (EA), izopentenyl (IPA) a chloroform (CR). Avšak účinnosť regenerácie organických extraktantov bola nízka, ako je znázornené na obr. 7. Okrem toho sa na spätnú extrakciu použilo veľké množstvo prchavých organických extraktantov, čo ovplyvní „zelenú“ vlastnosť separačného procesu.

Na separáciu ACT bola zvolená adsorpčná metóda(Acteozid)z fázy bohatej na IL, ako je napríklad usporiadaný mezoporézny uhlík (CMK-3), grafén (GR) a uhlíkové nanorúrky s jednou stenou (SWCNT). Fáza bohatá na IL po extrakcii IL-ATPS sa zriedila 10-krát deionizovanou vodou. Účinnosť regenerácie vyššie uvedených troch adsorbentov sa porovnávala pre ACT za rovnakých adsorpčných podmienok nasledovne: pomer tuhá látka-kvapalina 1:1 (mg/ml), 303 K a 12 h.

Ako je znázornené na obr. 7, zotavenie SWCNT bolo lepšie ako u CMK-3 a GR. Okrem toho, účinnosť desorpcie ACT(Acteozid)môže dosiahnuť 95,3 percenta pri použití metanolu, kyseliny octovej a ultračistej vody s objemovým pomerom 1:1:8 pri 318 K. Preto možno SWCNT použiť na získanie ACT z fázy bohatej na IL.

Obr. 7. Vplyv typu s rôznymi extrakčnými činidlami a adsorbentmi na separáciu ACT(Acteozid)z fázy bohatej na IL.

4. Závery

V tejto štúdii je jednoduchá a účinná metóda založená na IL-ATPS na extrakciu ACT(Acteozid)zo surových extraktov zCistanche tubulosabol úspešne vyvinutý. Optimálny IL-ATPS bol stanovený ako [C4mim]BF4–(NH4)2SO4 a optimálne extrakčné podmienky boli extrakčná teplota 278 K, koncentrácia IL 50 % hmotn., koncentrácia roztoku vzorky 2,5 mg/ml, koncentrácia soli 11,11 % hmotn., pH 6,0 a doba extrakčnej rovnováhy 130 minút. Pri optimálnych podmienkach extrakcie je účinnosť extrakcie, rozdeľovací koeficient a selektivita ACT(Acteozid)sa zistilo, že sú 99,78 percent ± 0,84 percent, 33,82 ± 1,82 a 230,51 ± 8,26, v tomto poradí. Preto na záver, systém [C4mim]BF4-(NH4)2SO4 ponúka jednoduchú a účinnú metódu na vysoko selektívnu separáciu ACT od surových extraktovCistanchetubulosa. Kyslá soľ (NH4)2SO4 poskytuje slabo kyslé mikroprostredie na zabezpečenie stability ACT(Acteozid)v bohatej fáze [C4mim]BF4-. Okrem toho vysoká polarita [C4mim]BF4 s receptormi s viacerými vodíkovými väzbami vedie k extrakcii ACT vo fáze bohatej na [C4mim]BF4-. Nakoniec sa ukázalo, že interakcie ACT a [C4mim] BF4 zahŕňajú vodíkové väzby, van der Waalsove sily a p-p stohovanie. Táto štúdia poskytuje poznatky pre budúci výskum vysoko selektívnej separácie fenolových zlúčenín z prírodných rastlín.

vyhlásenie o autorskom príspevku CRediT

Helin Xu: Konceptualizácia, Metodológia, Vyšetrovanie, Spracovanie údajov, Písanie – pôvodný návrh, Písanie – kontrola a úprava. Xue qin Li: Konceptualizácia, Administrácia projektu, Písanie - kontrola a editácia, Supervízia. Yanyan Hao: Spracovanie údajov, písanie - kontrola a úprava. Xiaobin Zhao: Zdroje, formálna analýza. YunCheng: Zdroje, formálna analýza. Jinli Zhang: Administrácia projektu, písanie – kontrola a úprava.

Vyhlásenie konkurenčného záujmu

Autori vyhlasujú, že nemajú žiadne známe konkurenčné finančné záujmy alebo osobné vzťahy, ktoré by mohli ovplyvniť prácu uvádzanú v tomto článku.

Poďakovanie

Túto prácu podporila Regionálna vedecká organizácia Národnej nadácie pre prírodné vedy v Číne [číslo grantu22068032]; Národná nadácia prírodných vied pre mladých vedcov Číny [číslo grantu 21706166]; Program pre vedúcich vedeckých a technologických inovácií pre mladých ľudí a stredný vek v Bingtuane [číslo grantu 2019CB024]; program pre mladé inovatívne talenty univerzity Shihezi [číslo grantu CXRC201802] a hlavný projekt vedy a techniky v Xinjiang Bingtuan[číslo grantu 2017AA007/01]. Radi by sme poďakovali Analytickému a testovaciemu centru Univerzity Shihezi za mikroskopiu a mikroanalýzu našich vzoriek.

antokyanín

Referencie

[1] X. Wang, X. Wang, Y. Guo, Rýchle simultánne stanovenie šiestich účinných zložiek vCistanchetubulosapomocou blízkej infračervenej spektroskopie, Molecules 22 (2017) 843, https://doi.org/10.3390/molecules22050843.

[2] Y. Yan, Q. Song, X. Chen, J. Li, P. Li, Y. Wang, T. Liu, Y. Song, P. Tu, Simultánne stanovenie komponentov so širokými rozsahmi polarity a obsahu vCistanchetubulosapoužitím sériovo viazanej chromatografie s hydrofilnou interakciou s reverznou fázou a tandemovej hmotnostnej spektrometrie, J. Chromatogr. 1501 (2017) 39–50
[3] W. Zhang, J. Huang, W. Wang, Q. Li, Y. Chen, W. Feng, D. Zheng, T. Zhao, G. Mao, L. Yang, X. Wu, Extrakcia, čistenie , charakterizácia a antioxidačné aktivity polysacharidov zCistanchetubulosa, Int. J. Biol. Macromol. 93 (2016) 448 – 458,
[4] Y. Song, Q. Song, J. Li, N. Zhang, Y. Zhao, X. Liu, Y. Jiang, P. Tu, Integrovaná stratégia na kvantitatívne rozlíšenie chemomu medzi Cistanche deserticola a C. tubulosa pomocou vysokoúčinná kvapalinová chromatografia – hybridná trojitá kvadrupólová-lineárna iónová pasca hmotnostná spektrometria, J. Chromatogr. 1429 (2016) 238–247
[5] W. Pei, R. Guo, J. Zhang, X. Li, Extrakcia fenyletanoidových glykozidov zCistanche tubulosaextrakciou vysokorýchlostnou strihovou homogenizáciou, J. AOAC Int. 102 (2019) 63–68
[6] H. Xu, W. Pei, X. Li, J. Zhang, Vysoko účinná adsorpcia fenyletanoidných glykozidov na mezoporéznom uhlíku, Front. Chem. 7 (2019)
[7] PL Liao, CH Li, LS Tse, JJ Kang, YW Cheng, Hodnotenie bezpečnostiCistanchetubulosamemoregain produktov zdravej výživy: genotoxicita a 28-dňový test toxicity po opakovaných dávkach, Food Chem. Toxicol. 118 (2018) 581–588
[8] YJ Shiao, MH Su, HC Lin, CR Wu, Echinacoside zmierňuje poškodenie pamäti a cholinergný deficit vyvolaný amyloid-beta peptidmi prostredníctvom inhibície ukladania amyloidu a toxikológie, Food Funct. 8 (2017) 2283 – 2294

[9] H. Shimada, Y. Urabe, Y. Okamoto, Z. Li, A. Kawase, T. Morikawa, P. Tu, O. Muraoka, M. Iwaki, hlavné zložkyCistanchetubulosa, echinakozid aakteozidinhibujú absorpciu glukózy sprostredkovanú kotransportérom glukózy závislým od sodíka 1- bunkami črevného epitelu, J. Funct. Potraviny 39 (2017) 91–95

[10] W. Li, R. Deng, X. Jing, J. Chen, D. Yang, J. Shen,akteozidzlepšuje experimentálnu autoimunitnú encefalomyelitídu prostredníctvom inhibície mitofágovej aktivácie sprostredkovanej peroxynitritom, Free Radicals Biol. Med. 146 (2020) 79 – 91,

[11] A. He, B. Dong, X. Feng, S. Yao, Extrakcia bioaktívnych saponínov ženšenu pomocou vodných dvojfázových systémov iónových kvapalín a solí, Sep. Purif. Technol. 196 (2018) 270–280
[12] E. Suarez Garcia, CA Suarez Ruiz, T. Tilaye, MHM Eppink, RH Wijffels, C. van den Berg, Frakcionácia proteínov a uhľohydrátov zo surových extraktov z mikrorias pomocou vodného dvojfázového systému na báze iónovej kvapaliny, september Purif. Technol. 204 (2018) 56 – 65,
[13] L. Wang, W. Li, Y. Liu, W. Zhi, J. Han, Y. Wang, L. Ni, Zelená separácia bromelaínu vo vzorke potravín s vysokou retenciou enzýmovej aktivity pomocou recyklovateľného vodného dvoj- fázový systém obsahujúci nový syntetizovaný termoresponzívny kopolymér a soľ, Food Chem. 282 (2019) 48–57
[14] A. Tighrine, Y. Amir, P. Alfaro, M. Mamou, C. Nerín, Simultánna extrakcia a analýza konzervačných látok a umelých sladidiel v šťavách metódou vysolovania kvapalina-kvapalina pred ultra vysokoúčinnou kvapalinovou chromatografiou. , Food Chem. 277 (2019) 586–594

[15] H. Shaker Shiran, M. Baghbanbashi, F. Ghazizadeh Ahsaie, G. Pazuki, Štúdia delenia kurkumínu vo vodných dvojfázových systémoch polymér-soľ, J. Mol. Liq. 303 (2020) 112629

[16] X. Wu, R. Li, Y. Zhao, Y. Liu, Separácia polysacharidov zo Spirulina platensis pomocou HSCCC s etanol-amónium sulfátom ATPS a ich antioxidačné aktivity, Carbohydr. Polym. 173 (2017) 465–472

[17] VP Priyanka, RL Gardas, vodné dvojfázové systémy na báze mono- a dikačných iónových kvapalín na extrakciu sodnej soli diklofenaku, september Purif. Technol. 234 (2020) 116048
[18] J. Flieger, A. Czajkowska-Zelazko, Vodný dvojfázový systém na báze iónovej kvapaliny na izoláciu chinínu zo vzorky ľudskej plazmy, Food Chem. 166 (2015) 150–157
[19] X. Zhang, G. Teng, J. Zhang, Etanol/soľný vodný dvojfázový systém založený na ultrazvukovo asistovanej extrakcii polysacharidov z Lilium David Ivar. unicolor Salisb: fyzikálno-chemická charakterizácia a antiglykačné vlastnosti, J. Mol. Liq. 256 (2018) 497 – 506,
[20] Q. Liu, X. Chen, Y. Guo, C. Han, J. Li, L. Jia, J. Liu, X. Wei, Termodynamická štúdia vodných dvojfázových systémov 1- butyl-3-metylimidazoliumtetrafluórborát a dodecylbenzénsulfonát sodný, J. Mol. Liq. 279 (2019) 18 – 22,
[21] DCV Belchior, MV Quental, MM Pereira, CMN Mendonça, IF Duarte, MG Freire, Výkon iónových kvapalín na báze tetraalkylamónia ako zložiek vodných dvojfázových systémov pri extrakcii ovalbumínu a lyzozýmu, Sep. Purif. Technol. 233 (2020)

[22] CA Suarez Ruiz, J. Kwaijtaal, OC Peinado, C. van den Berg, RH Wijffels, MHM Eppink, Viacstupňová frakcionácia biomolekúl mikrorias pomocou selektívnych vodných dvojfázových systémov, ACS Sustainable, Chem. Ing. 8 (2020) 2441 – 2452,

[23] AW Vieira, G. Molina, AB Mageste, GD Rodrigues, LR de Lemos, Delenie kyseliny salicylovej a acetylsalicylovej vodnými dvojfázovými systémami: aspekty mechanizmu a optimalizačná štúdia, J. Mol. Liq. 296 (2019) 111775
[24] L. Ran, C. Yang, M. Xu, Z. Yi, D. Ren, L. Yi, Vylepšená vodná dvojfázová extrakcia proantokyanidínov z hroznových semien pomocou iónových kvapalín ako adjuvans, Sep. Purif. Technol. 226 (2019) 154–161

[25] LA Mejía-Manzano, BA Barba-Dávila, P. Vázquez-Villegas, SO SernaSaldívar, J. González-Valdez, Zlepšená extrakcia prírodného protirakovinového pristimerínu z koreňovej kôry Mortonia greggii pomocou zelených rozpúšťadiel a vodných dvojfázových systémov, sept. Purif. Technol. 211 (2019) 667–672