HPTLC-denzitometrický skríning a hromadná identifikácia kontaminácie fluorescenčnými bieliacimi činidlami v obilnej múke

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com

Yisheng Chen1,2 & Caihong Huang1,2 & Xueming Xu

Abstraktné

V posledných rokoch narastali obavy súvisiace s otázkami bezpečnosti potravínfluorescenčné bieliace činidláz obalových materiálov. Tu sme informovali o vývoji jednoduchej a spoľahlivej metódy vhodnej na vysokovýkonnú kvantifikáciu a identifikáciu dvoch bežných fluorescenčných bieliacich činidiel (FWA 184 a FWA 367) v cereálnych produktoch (pšeničná a ryžová múka), na báze vysokovýkonných tenkých chromatografia na vrstve. Po prvé, príprava a čistenie vzorky sa rýchlo vykonali pomocou optimalizovanej extrakcie tuhá látka-kvapalina. Extrakty a referenčný štandard boli simultánne oddelené na silikagélových platniach s použitím zmesi toluénu a etylacetátu (1 0/0,3, obj./obj.) ako mobilnej fázy. Potom sa uskutočnila rýchla kvantifikácia s denzitometriou vo fluorescenčnom režime (365HPTLCako všestranná analytická platforma môže dosiahnuť ideálnu rovnováhu medzi priepustnosťou, jednoduchosťou a detekovateľnosťou, a preto je obzvlášť vhodná na analýzu potravín orientovanú na obrazovku.

Kľúčové slová HPTLC. Denzitometria.Fluorescenčné bieliace činidlá

Cistanche má bieliaci účinok na pokožku

Úvod

Posledné roky boli svedkom rozmachu materiálov na balenie potravín. Na druhej strane celosvetovú pozornosť pritiahli aj otázky bezpečnosti potravín spojené s obalovým materiálom. Medzi nebezpečné chemikálie, ktoré môžu pochádzať z týchto materiálov,fluorescenčné bieliace činidlá(FWAs) získali obzvlášť veľký záujem. Molekuly FWA boli schopné absorbovať žiarenie a súčasne vyžarovať viditeľné svetlo. Takáto premena môže kompenzovať žlté sfarbenie látok, čo má za následok zosilnený biely dojem. Materiály začlenené do FWA sa preto intenzívne zvažovali pre balenie potravín. Najmä pri cereálnych výrobkoch sa takéto balenie priaznivo využívalo na zvýšenie atraktivity a akceptácie spotrebiteľov. Napríklad abnormálne vysoké hladinyFWAsa našli v papierovej doske pukancov a instantných rezancov (Jiang et al. 2015). Výsledkom bolo, že FWA migrovali do cereálnych potravín a viedli ku kontaminácii, čo predstavuje veľkú výzvu pre verejné zdravie.

Pred niekoľkými desaťročiami bola pozoruhodne vysoká stabilitaFWAvyvolali intenzívne obavy z ich potenciálnej toxicity. Hoci skutočný vplyv FWA na ľudské zdravie ešte stále nebol jednoznačný, ich vývojová toxicita a alteračný efekt génovej expresie u modelových zvierat boli experimentálne dokázané (Belliveau et al. 1990; Jung et al. 2012). .S ohľadom na tieto potenciálne riziká orgány pre bezpečnosť potravín na celom svete stanovili obmedzenia a limity pre prenosné FWA v materiáloch prichádzajúcich do styku s potravinami.

S cieľom implementovať tieto legislatívne normy bolo na detekciu FWA navrhnutých veľké množstvo analytických metód, najmä UV fluorescenčnej kontroly alebo kolónovej chromatografie (HPLC a kapilárnej elektroforézy) (Jiang et al. 2015; Wu et al. 2018). . Z hľadiska praxe však všetky tieto existujúce metódy neboli prispôsobené princípu nákladovo efektívneho a spoľahlivého skríningu. Napríklad metóda UV-fluorescenčnej kontroly veľmi trpela zlou selektivitou. Medzitým analýza založená na stĺpcových chromatografických systémoch ukázala pozoruhodný nedostatok jednoduchosti a nákladovej efektívnosti. Naopak, vysokoúčinná tenkovrstvová chromatografia (HPTLC) otvárala nový horizont metodiky skríningu potravín. Množstvo metód zameraných na skríning založených naHPTLCbol vyvinutý a aplikovaný pri analýze rôznych zložiek potravín, pričom vykazuje jedinečnú flexibilitu a zároveň ideálne vypĺňa medzeru medzi aspektom jednoduchosti, špecifickosti a spoľahlivosti (Galarce-Bustos a kol. 2019; Li a kol. 2018; Mikropoulou a kol. 2019 ; Pedan a kol. 2018; Premarathneet a kol. 2018; Stanek a kol. 2019; Sun a kol. 2018). Týmto spôsobom je možné analyzovať veľa vzoriek (až 40) súčasne s takmer neobmedzenou toleranciou matrice, pretože každá z doštičiek bola na jedno použitie (Li et al. 2019). To znamenalo, že nároky na čistenie vzoriek a údržbu prístroja možno výrazne ušetriť. Ako presadzovanie vizuálnej kontroly umožnila denzitometria presné a presné meranie výsledkov separácie na HPTLC platni (Lebot et al. 2020). S rýchlym vývojom technológií delenia slov bolo najväčšou prednosťou HPTLC to, že ho možno použiť ako platformu, ktorá efektívne spája použiteľnosť výkonných analytických nástrojov, ako je Ramanova spektroskopia s vylepšeným povrchom (Kang a kol. 2019; Qu a kol. 2018; Wang a kol. 2018a, b), biosenzor (AgatonovicKustrin a kol. 2020; Chen a kol. 2020a, b; Choma a Grzelak2011; Galarce-Bustos a kol. 2019), obrazová/chemometrická analýza (Rejšek a kol.; Xu16 Liu 2021; Xu a kol. 2019) a hromadná detekcia (Wang a kol. 2018a, b). Ako taká bola HPTLC všestrannou súpravou nástrojov obzvlášť vhodnou na skríningové úlohy.

Na základe týchto skutočností bolo cieľom tejto práce vyvinúť jednoduchú a citlivú skríningovú metódu pre FWAs v rôznych vzorkách obilnej múky založenú na kombináciiHPTLCfluorescenčná denzitometria (FLD) a hmotnostná spektrometria (MS). Po vyvinutí metódy bola jej výkonnosť kvantitatívne aj kvalitatívne overená, čo podstatne dokazuje jej skutočnú nadradenosť ako jednoduchého nástroja na skríning.

Materiály a metódy

Materiály

Standards of FWA184 (2,5-bis(5′-tert-butyl-2-benzoxazolyl) thiophene, CAS 7128-64-5, > 99% purity) and FWA367 (1,4-bis(2-benzoxazolyl) napthalene, CAS 5089-22-5, >98 percent čistoty) boli zakúpené od Aladdin (Shanghai, Čína). Organické rozpúšťadlá a chemikálie analytickej kvality boli od Sigma Aldrich (Shanghai, Čína). Silikagélové platne60 F254 (analytická kvalita, hrúbka vrstvy 0,1 mm, veľkosť 10 x 20 cm, sériové č. 1.05729.0001) boli od spoločnosti Merck (Darmstadt, Nemecko). Šesť slepých vzoriek obilnín vrátane troch vzoriek pšeničnej múky a troch vzoriek ryžovej múky bolo zakúpených v miestnom supermarkete. Okrem toho vzorky pšeničnej a ryžovej múky s potvrdenou kontamináciou FWA poskytlo Colné potravinové centrum Shenzhen.

extrakt z cistanche tubulosa

Štandardné riešenia

Zásobné roztoky ({{0}},01 mg/ml) FWA 184 a FWA 367 sa pripravili v etylacetáte, oddelene alebo v zmesi, a skladovali sa v chladničke (4 stupne). Pracovné roztoky na zostavenie kalibračných kriviek boli pripravené ďalším riedením zásobných roztokov na 0,0001 mg/ml.

Príprava vzorky

Na extrakciu analytov zo vzoriek obilnín, etylacetátu, acetónu a ich zmesí (pomer miešania, objem/objem, 10/0, 6/4, 4/6 a 0 /10) boli testované ako extrakčné rozpúšťadlo. Stručne, vzorka 5 g obilnej múky sa zmiešala s 20 ml extrakčného rozpúšťadla; v prípade potreby sa do extrakčnej zmesi slepých vzoriek pridalo 100 alebo 50 μl zásobných roztokov (0,01 mg/ml) štandardov FWA, výsledkom čoho bolo 200 alebo 100 ug/kg umelých kontaminácia. Po ošetrení 30 stupňovým ultrazvukovým kúpeľom počas 5 minút sa suspenzia oddelila centrifugáciou počas 5 minút pri 4 stupňoch. Potom bol 1 ml supernatantu opatrne napipetovaný do 5 ml injekčnej striekačky a prefiltrovaný cez 0,0{23}}μmnylonovú membránu, aby sa odstránili tuhé častice, aby sa zabránilo upchatiu ihly.

HPTLC kroky

Extrakty vzoriek a referenčné štandardy boli nastriekané ako 6-mm pásyHPTLCdoštičky pomocou poloautomatického vzorkovača Linomat 5 (CAMAG, Švajčiarsko) vybaveného 100-μL injekčnou striekačkou, pri rýchlosti podávania 100 nL/s a 0,2 μL Pole pásov bolo spočiatku 15 mm od ľavého okraja a 10 mm od spodku, s automaticky vypočítaným intervalom od seba. Aplikačné objemy boli 10 μl pre slepé a obohatené extrakty vzoriek; na zostavenie kalibračnej krivky sa použilo 1, 5, 10, 15 alebo 20 μl pracovného roztoku (0,0001 mg/ml), čo viedlo ku koncentráciám gradientu 100, 500, 1 000, 1 500 a 2 000 pg/pás. odber vzoriek sa injekčná striekačka medzi každou aplikáciou dvakrát ručne opláchla čistým etylacetátom, aby sa zabránilo krížovej kontaminácii. Po aplikácii sa platňa zahrievala pomocou TLC-heateru III (CAMAG, Švajčiarsko) na 60 stupňov počas 2 minút, aby sa odstránili zvyšky rozpúšťadla v aplikačných pásoch. Chromatografia sa automaticky uskutočnila s ADC-2 (CAMAG, Švajčiarsko), aby sa realizovať reprodukovateľnú separáciu. Najprv sa obe žľaby vyvíjacej komory naplnili stacionárnou fázou pozostávajúcou z 10 ml toluénu a 0,3 ml etylacetátu. Pred ponorením dna platne do mobilnej fázy sa uskutočňovala 5 minútová kontrola suchosti prebublávaním nasýteným vodným roztokom MgCl2 na konečnú relatívnu vlhkosť 33 percent, 10 minútová saturácia nádrže a 10 minútová predbežná úprava dosky. Migračná vzdialenosť prednej línie rozpúšťadla bola stanovená na 50 mm.

Doštičková dokumentácia a denzitometria

Po vyvolaní boli digitálne snímky vyvolanej platne zdokumentované zobrazovacím systémom DD70 (Biostep, Nemecko) integrovaným s digitálnym fotoaparátom Sony EOS700D osvetleným 366 nm UV lampami. Potom boli výsledky separácie denzitometricky vyhodnotené TLC skenerom 3 (CAMAG, Švajčiarsko). Na lokalizáciu pracovnej vlnovej dĺžky denzitometrie sa excitačné spektrá analytu uloženého na silikagélovej platni kontinuálne profilovali od 220 do 400 nm s použitím lampy D2 & W s optickým filtrom K400. Kvantitatívne skenovanie sa uskutočnilo so všeobecnými nastaveniami: fluorescenčný režim, ortuťová lampa, excitačná vlnová dĺžka 365 nm, optický filter K400, rozmer mikroštrbiny 3,00 × 0,30 mm, rýchlosť skenovania 100 μm/s a rozlíšenie dát 100 μm/krok. Inštrumentálna prevádzka a spracovanie dát boli riadené softvérom winCATS verzie 1.4.4.

prospech zextrakt z cistanche tubulosa

HPTLC-MS

Po meraniach FLD boli pozitívne pásy ďalej identifikované pomocou ich odtlačkov prstov, sprostredkovaných TLC-MS rozhraním (CAMAG). Poháňané kvartérnym čerpadlom sa cieľové pásy vizualizované pod osvetlením 366 nm eluovali prúdom acetonitrilu obsahujúceho 0,1 % kyseliny mravčej, rýchlosťou 0,2 ml/min počas 60 sekúnd. Priamo sa eluent vstrekol do elektrosprejového zdroja a súčasne sa analyzoval trojitým kvadrupólovým hmotnostným spektrometrom (Quattro Premier XE, Waters). Úplné skenovanie MS údajov sa uskutočnilo v režime ESI plus s nasledujúcimi nastaveniami: kapilárne napätia sú 3,5 kV, napätie kužeľa je 50 V, teplota zdroja iónov 100 stupňov, teplota desolvatácie 400 stupňov, prietok desolvatačného plynu 700 l/h a prietok plynu kužeľa 50 l/h. Spektrá boli zaznamenané v rozsahu 50–1000 m/z.

Výsledky a diskusia

Optimalizácia chromatografie

Vzhľadom na nízku polaritu cieľových zlúčenín bola zahájená optimalizácia mobilnej fázy skúšobnými testami s rôznymi hydrofóbnymi rozpúšťadlami (vrátane acetónu, toluénu, hexánu a petroléteru) a ich zmesami. Z počiatočného skríningu sa zistilo, že samotný toluén poskytuje dostatočné rozlíšenie cieľových zlúčenín z rušivých matríc vzoriek, ktoré väčšinou zostali v spodnej časti dráhy. Na ďalšie zvýšenie rozlíšenia analytov sa pridali rôzne množstvá (1 až 10 percent) etylacetátu. Z porovnania sa pripisuje krehkej rovnováhe medzi mobilnou fázou (kvapalina), atmosférou komory (plyn) a stacionárnou fázou (tuhá látka). Inými slovami, fázová rovnováha by bola porušená okamžite, keď by sa platňa pohybovala manuálne. To silne dokazuje dôležitosť prístrojového vybavenia pre opakovateľnosťHPTLCanalýza. Okrem toho, použiteľnosť optimalizovaných separačných podmienok bola ďalej hodnotená analýzou umelo kontaminovaných vzoriek obilnín. Z obr. 1a je možné usúdiť, že prítomnosť matrice vzoriek neviedla k významným zmenám chromatografických výsledkov. Preto bol v tejto práci fixovaný toluén/etylacetát (10/0,3, obj./obj.) ako mobilná fáza.

Vizuálny skríning a kvantifikácia FLD

Získanie obrazu celej platne bolo jednou z hlavných výhodHPTLC, s ktorým možno ľahko získať vizuálnou kontrolou semikvantitatívny profil separácie. Intenzívna natívna fluorescencia analytov tu umožnila priame odčítanie chromatografických výsledkov pri ožiarení 366 nm, s citlivosťou až do 100 pg/pás. Potom by iba horizontálne porovnanie medzi stopami mohlo viesť k priamemu odhadu stupňa kontaminácie vzorky, čo bolo veľmi výhodné pri skríningových úlohách. Ďalej sa na skenovanie stôp použila denzitometria vo fluorescenčnom režime. Tento krok bol tiež veľmi efektívny, ktorý je možné dokončiť za 2–3 minúty. S cieľom identifikovať optimálnu vlnovú dĺžku excitácie pre denzitometriu bolo skúmané excitačné spektrum (220–400 nm) analytu uloženého na vrstve silikagélu. Ako je znázornené na Obr. 1b, spektrálne profily analytu v rôznych podmienkach vykazovali vysokú podobnosť, pričom vykazovali najintenzívnejšiu emisiu pri excitácii 365 nm. Preto sa použilo svetlo ortuťovej výbojky pri 365 nm v kombinácii s 400-nmedge filtrom (K400). Ako je znázornené na obr. 1d, použiteľnosť týchto optických parametrov je dokázaná jasnými signálnymi píkmi pásov analytu aj v prítomnosti koextrahovaných matríc vzoriek.

Optimalizácia a validácia kvantifikácie

Linearita a citlivosť

Kvantitatívna kapacita zavedenej denzitometrickej detekcie bola najprv overená z hľadiska linearity a citlivosti. Na tento účel bol vytvorený kalibračný graf založený na 5 úrovniach v rámci koncentrácií od 100 do 2000 pg/pásmo. Zhrnuté v tabuľke 1, výsledky získané zHPTLC-FLD ukázal dobrú linearitu s uspokojivými koeficientmi korelácie (R2=0,9999). Na základe kalibračnej krivky bola vypočítaná citlivosť metódy vrátane limitu detekcie (LOD) a kvantifikácie (LOQ) podľa metódy DIN 32645 s 95-percentnou štatistickou spoľahlivosťou (Deutsches Institut für Normung 2013). Z výpočtu bola LOD vyjadrená aspg/pás 45 a 52 pre FWA 184 a FWA 367, v tomto poradí. Stanovením aplikačného objemu na 10 μl bola takáto detegovateľnosť rovná 18 a 21 ug/kg, čo bolo približne 30-násobne pod legislatívnym tolerančným limitom (600 ug/kg) stanoveným EÚ (Európska únia 2002).

Obnova a presnosť

Pred posúdením presnosti vyvinutýHPTLC-FLD stanovením miery výťažnosti analytov pridaných do vzoriek obilnín by sa mala optimalizovať správna metóda extrakcie. Extrakcia ForFWA v obilnej múke, Wu a kol. navrhujú použiť zmes dichlórmetánu a acetónu (3/2, obj./obj.) (Wu et al. 2018). Pokiaľ ide o environmentálnu a ccarcinogénnu toxicitu dichlórmetánu, ako extrakčné rozpúšťadlo sa tu alternatívne testovali zmesi etylacetátu a acetónu. Ako je príkladne uvedené na obr. 2, bolo zrejmé, že čistý etylacetát bol najlepšou voľbou na extrahovanie cieľovej zlúčeniny z oboch vzoriek obilnín, porovnateľné s metódami podľa Wu et al. (2018). Aby sa zaručila jej použiteľnosť, bola optimalizovaná metóda extrakcie rozšírená na 6 vzoriek obilnín vrátane 3 pšeničnej múky a 3 ryžových múk, ktoré boli ďalej testované pre experiment s regeneráciou klasov. Ako je zhrnuté v tabuľke 2, vypočítaná miera obnovy bola v rozsahu 88,7 – 108,4 percenta. Medzitým sa zistilo, že reprodukovateľnosť kvantifikácie, pokiaľ ide o relatívnu štandardnú odchýlku (percento RSD) troch opakovaní, je menšia ako 10,5 percenta. Okrem toho bolo pozoruhodné, že získané údaje boli nevýznamne závislé od použitých vzoriek a úrovní prírastkov, čo dokazuje, že vyvinuté kvantitatívna analýza by mohla byť účinným skríningovým nástrojomFWAvo vzorkách obilnín s prijateľnou presnosťou a presnosťou.

Stanovenie FWA v balených vzorkách obilnín

Na ďalšie vyhodnotenie vhodnosti optimalizovaných podmienok extrakcie aHPTLC- detekcia FLD, metóda bola príkladne použitá na kvantifikáciu dvoch vzoriek obilnín, ktorých balenie obsahuje FWA. Jednoducho z vizuálnej kontroly na obrázku dosky znázornenom na obr. 3a bolo veľmi ľahké dospieť k záveru, že obe vzorky obilnín boli kontaminované zvyškami FWA. Potom sa uskutočnila kvantifikácia pomocou FLDscanning. Ako je znázornené na obr. 3b, v získanom dendrograme je možné pozorovať dobrú selektivitu detekcie. Ako je zhrnuté v tabuľke 3, rezíduá analytov v oboch cereálnych produktoch boli v rozmedzí ug/kg (maximálne 262,8 ug/kg), čo bolo výrazne pod ich špecifickými migračnými limitmi (600 ug/kg). Aj napriek tomu zostali alarmujúce aj potenciálne negatívne dopady takejto kontaminácie, keďže nepriaznivé účinky chronickej expozície ešte neboli dostatočné.

prospech zextrakt z cistanche tubulosa

Molekulárna identifikácia pomocou odtlačkov prstov MS

Na dosiahnutie chemickej identifikácie pásov vyplývajúcich zHPTLCPri vývoji bola detekcia MS in situ začlenená do skríningového prístupu ako konfirmačný nástroj, uľahčený rozhraním TLC-MS na báze elučnej hlavy. Zlúčeniny v pásikoch záujmu sa zmyli z vrstvy silikagélu a priamo sa merali pomocou elektrosprejovej MS. Tabuľka 4 sumarizuje diagnostický signál analytov zaznamenaný z vrstvy silikagélu. Bolo jasné, že 363,1 m/z bol najhojnejší iónový signál pre FWA 184, zatiaľ čo 431,2 m/z pre FWA 367. V súlade s teoretickými molekulárnymi iónmi v protónovanej forme boli tieto špecifické signály priamo zrejmé, a preto ich možno použiť ako dôkaz odtlačkov prstov na potvrdenie. Ďalej bola použiteľnosť tejto metódy príkladne overená pozitívnymi nálezmi v reálnych vzorkách. Ako je znázornené na obr. 4, získané signály vykazovali dobrú podobnosť s odtlačkom prsta analytu, čo dokazuje, že podozrivé pásy možno jednoznačne priradiť k cieľovým zlúčeninám.

prospech zextrakt z cistanche tubulosa

Závery

V tomto dieleHPTLCbola úspešne použitá ako flexibilná platforma, ktorá efektívne zostavuje separáciu a spektroskopickú analýzu, na jednoduchú kvantifikáciu a potvrdenie kontaminácie FWA vo vzorkách obilnín. S optimalizovanou extrakčnou metódou boli analyty vo vzorkách pšeničnej a ryžovej múky selektívne a presne kvantifikované pomocou HPTLC-FLD, s dobrou linearitou a LOD výrazne pod hranicou tolerancie. Okrem toho, oddelené výsledky, ktoré zostali na platňovej vrstve, boli ďalej spojené s in situ MS analýzou, čo umožnilo rýchlu molekulovú identifikáciu pozitívnych pásov v oddelených stopách, čím sa jednoznačne zabezpečila spoľahlivosť výsledkov skríningu. HPTLC bola čoraz viac uznávaná. Práca ukázala, že HPTLC ako všestranná platforma integrujúca kvantitatívnu a kvalitatívnu detekciu mimoriadne nákladovo efektívnym spôsobom môže byť silným nástrojom v analytickej chémii potravín.

prospech zdoplnky s extraktom z cistanche tubulosa