Sírovodík zoslabuje renálnu I/R indukovanú aktiváciu zápalovej odpovede a apoptózy prostredníctvom regulácie inhibície NLRP3 signálnej dráhy sprostredkovanej Nrf2
Mar 14, 2022
Abstraktné. Poškodenie ischémie/reperfúzie obličiek (I/R) môže viesť k akútzlyhanie obličiekoneskorená funkcia štepu a odmietnutie štepu. Oligomerizačná doména viažuca nukleotidy NOD-like receptor obsahujúci pyrínovú doménu 3 (NLRP3) sprostredkovaný zápal sa podieľa na vznikuobličkovézranenie. Nrf2 urýchľuje aktiváciu signálnej dráhy NLRP3 a ďalej reguluje zápalovú odpoveď. Okrem toho sírovodík plní ochrannú úlohu vpoškodenie obličiek; podrobný základný mechanizmus však zostáva nedostatočne pochopený. Táto štúdia skúmala, či sa dráhy Nrf2 a NLRP3 podieľajú na regulácii sírovodíkomobličkovéI/R-indukovaná aktivácia zápalovej odpovede a apoptózy. Myši divokého typu a Nrf2-knockout (KO) podstúpili operáciu na vyvolanieobličkovéI/R cez upnutie bilaterálnehoobličkovépedikúl. Celkom 20 mg/kg MCC950 (inhibítor NLRP3) sa podávalo intraperitoneálne denne počas 14 dní pred chirurgickým zákrokom.Renálnatkanivo a krv sa odobrali z I/R modelových myší, aby sa analyzovali hladiny expresie mRNA NLRP3 a Nrf2, hladiny expresie proteínu NLRP3, PYD a CARD, kaspázy-1, IL-1, Nrf2 a hemovej oxygenázy 1, apoptóza buniek, sekrécia tumor nekrotizujúceho faktora-, IL-1 a IL-6 cytokínov aobličkovéhistopatológia a funkcia.RenálnaI/R aktivoval signálne dráhy NLRP3 a Nrf2. Naopak, liečba MCC950 inhibovala aktiváciu signálnej dráhy NLRP3 a zabránila I/R indukovanejpoškodenie obličiek, uvoľňovanie cytokínov a apoptóza vobličkovéI/R model myši. Hydrosulfid sodný (NaHS) nielen zmiernil zvýšenú reguláciu hladín expresie proteínu NLRP3, ale tiež zmiernilpoškodenie obličiek,uvoľňovanie cytokínov a bunková apoptóza indukovaná renálnym I / R u myší divokého typu, ale nie u myší Nrf2-KO. NaHS zmiernil aktiváciu zápalu NLRP3,poškodenie obličiek,zápalová odpoveď a bunková apoptóza prostredníctvom signálnej dráhy Nrf2 u myší s modelom I/R obličiek.
CISTANCHE ZLEPŠÍ ZLYHAVOVANIE OBLIČIEK/RENÁL
Úvod
Renálna ischémia/reperfúzia (I/R) je hlavnou príčinou akútpoškodenie obličiek(AKI), ktorá sa zvyčajne vyskytuje počasobličkovéchirurgia a predisponuje jednotlivcov k závažnej dysfunkcii vo viacerých orgánových systémoch. Bunková smrť a zápal indukovaný I/Robličkovétkanivo je spojené s komplexnými patofyziologickými procesmi a podporuje pokles vfunkcia obličiek,čo vedie k hromadeniu odpadových produktov metabolizmu (1). Okrem ischémie vyvolanejobličkovéPo poškodení tkaniva sa tiež zistilo, že reperfúzia spúšťa komplexnú patofyziologickú kaskádu, ktorá zahŕňa nadmerné uvoľňovanie voľných radikálov a akumuláciu zápalových buniek, následne podporuje zápal a ďalej zhoršuje lokálnu ischémiu a poškodenie buniek (2).
Podrodiny domény viažucej nukleotidy a rodiny obsahujúcej opakovanie bohaté na leucín zohrávajú kľúčovú úlohu pri rozvoji zápalovej odpovede (3). Doména pyrínu rodiny NLR obsahuje 3 (NLRP3) zápal (predtým známy ako NACHT, LRR a domény PYD obsahujúci proteín 3 a kryopyrín) je doteraz najcharakteristickejším zápalom. Rastúci počet štúdií uvádza súvislosť medzi NLRP3 arenal I/R. V AKI je zapojený NLRP3obličkovéPoranenie I/R (4,5). Napríklad knockdown NLRP3 a jeho adaptéra PYD a domény obsahujúcej CARD (ASC) zmierňuje I/R indukovanéobličkovédysfunkciou a nadmerným prílevom neutrofilov doobličkové tkanivo(6). Okrem toho, knock-down NLRP3 a / alebo kaspázy-1 chráni myši pred AKI indukovanou sepsou alebo lipopolysacharidom (7, 8). Tieto zistenia naznačujú, že zápal NLPR3 môže zohrávať kľúčovú úlohu v patogenézepoškodenie obličiek.
Nrf2 je endogénny antioxidačný gén umiestnený v cytosóle, ktorý sa kombinuje s Kelchovým proteínom 1 spojeným s ECH (Keap). Po aktivácii sa Nrf2 uvoľní z Keep a premiestni sa do jadra, kde sa následne naviaže na prvky antioxidačnej odozvy, aby inicioval transkripciu svojich downstream antioxidačných a cytoprotektívnych cieľových génov, ako je superoxiddismutáza, kataláza, glutatiónperoxidáza, glutatión-S-transferáza. izozýmy, katalytické a modifikačné podjednotky ‑glutamylcysteín ligázy a NADP(H): chinónoxidoreduktáza (9). Už skôr bolo hlásené, že Nrf2 je spojený s AKI indukovaným environmentálnym poškodením, ischémiou alebo xenobiotikami (10). Okrem jeho hlásenej ochrannej úlohy pri poškodení tkaniva predchádzajúce štúdie tiež ukázali, že nadmerná expresia Nrf2 potláča aktivitu zápalu NLRP3 a zlepšuje poškodenie tkaniva (11-13). Avšak základný mechanizmus signálnej dráhy Nrf2 a jeho účinok na aktiváciu zápalu NLRP3 vobličkovéI/R zostáva neznámy.Sírovodík (H2S) získal uznanie pre svoju schopnosť regulovať homeostázu cicavcov a základné bunkové procesy, ako je autofágia (14). Niekoľko štúdií uvádza, že H2S má ochrannú úlohu proti apoptóze, oxidačnému stresu a zápalupoškodenie obličiek(15-20). Avšak základný ochranný mechanizmus H2S vpoškodenie obličiekindukovaný I/R zostáva neznámy. Preto táto štúdia skúmala hladiny expresie NLRP3 a jeho adaptéra, ASC, u myší s renálnym I/R modelom a následne určila účinok Nrf2 na expresiu NLRP3. Cieľom tejto štúdie bolo tiež zistiť, či H2S chrániobličkové tkanivoprotipoškodenie obličiek,zápalu a apoptózy prostredníctvom inhibície NLRP3 sprostredkovanej Nrf2.
Kľúčové slová:ischémia/reperfúzne poškodenie obličiek, Nrf2, sírovodík, apoptóza, poškodenie obličiek; zlyhanie obličiek
CISTANCHE ZLEPŠÍ OCHORENIE OBLIČIEK/OBLIVÍN
Materiály a metódy
Vytvorenie I/R modelu obličiek a liečebných skupín.Celkovo 24 samcov myší divokého typu (hmotnosť, 20-25 g; vek, 6-8 týždňov) bolo získaných z Laboratórneho centra pre zvieratá Akadémie vojenských lekárskych vied (Peking, Čína). Okrem toho bolo od Junke Biological Co., Ltd. získaných deväť myších samcov Nrf2-knockout (KO) (hmotnosť, 20-25 g; vek, 6-8 týždňov). Všetky protokoly pre zvieratá boli schválené Výborom pre starostlivosť a používanie zvierat Všeobecná nemocnica lekárskej univerzity Tianjin (číslo schválenia IRB2020‑DW‑04; Tianjin, Čína) a vynaložilo sa všetko úsilie na minimalizáciu utrpenia zvierat a počtu použitých zvierat. Myši boli aklimatizované na prostredie 3 dni pred experimentom pri 22 °C so 40-60 percentnou vlhkosťou, 12-hodinovým cyklom svetlo/tma a voľným prístupom k vode a krmivu pre hlodavce. Potom, čo boli myši anestetizované intraperitoneálnym (ip) 50 mg/kg pentobarbitalu sodného, bilaterálnyobličkovépedikly sa ligovali počas 30 minút pomocou svoriek mikroaneuryzmy. Následne boli odstránené svorky mikroaneuryzmy. V kontrolnej skupine bola operácia vykonaná rovnakým postupom; však,obličkovépedikly neboli podviazané. Po chirurgickom zákroku sa použil 0,9-percentný roztok chloridu sodného na zotavenie myší. Myši sa potom usmrtili po reperfúzii počas 24 hodín. Celkom 24 myší divokého typu bolo náhodne rozdelených do nasledujúcich šiestich skupín: i) kontrolná (Con) skupina (n=9); ii) I/R skupina (n=9); iii) I/R plus skupina MCC950 (n=3); a iv) I/R plus skupina NaHS (n=3). Celkom deväť myší Nrf2‑KO bolo náhodne rozdelených do nasledujúcich troch skupín: i) skupina Con (n=3); ii) I/R skupina (n=3); a iii) I/R plus skupina NaHS (n=3).
Podľa predchádzajúcich výskumov a predbežných experimentov (21,22) sa 20 mg/kg MCC950 (Sigma‑Aldrich; Merck KGaA) podávalo (ip) denne počas 14 dní pred chirurgickým zákrokom do I/R plus MCC950 skupina. Celkom 50 umol/kg hydrosulfidu sodného [NaHS; ip; zriedený v normálnom (0,9 percentnom) fyziologickom roztoku; Sigma-Aldrich; Merck KGaA] bol injekčne podaný pred chirurgickým zákrokom v skupine I/R plus NaHS. Po dokončení všetkých experimentálnych postupov sa myši usmrtili cervikálnou dislokáciou a tkanivo a krv sa odobrali na následnú analýzu.
Western blotting. Obličkové tkanivosa odobral z I/R modelových myší po 24-hodinovej reperfúzii na analýzu hladín expresie proteínu. V stručnosti, celkový a nukleový proteín boli extrahované pomocou RIPA pufra (Thermo Fisher Scientific, Inc.) a koncentrácia proteínu bola stanovená pomocou súpravy BCA Protein Assay kit (Thermo Fisher Scientific, Inc.). Celkom 40 µg proteínu na dráhu sa oddelilo pomocou 10 percent SDS-PAGE a prenieslo sa na polyvinylidéndifluoridové membrány, potom sa blokovalo 5 percentami mlieka počas 2 hodín pri izbovej teplote. Membrány sa následne inkubovali s nasledujúcimi primárnymi protilátkami cez noc pri 4 °C: Anti-NLRP3 (1:500; kat. č. ab214185; Abcam), anti-ASC (1:200; kat. č. sc-514414; Santa Cruz Biotechnology, Inc.), anti-kaspáza-1 (1:200; kat. č. sc-56036; Santa Cruz Biotechnology, Inc.), anti-IL-1 (1:1,000; kat. . č. ab200478; Abcam), anti-Nrf2 (1:1,000; kat. č. ab137550; Abcam), anti-heme oxygenáza (HO)-1 (1:2,000 ; kat. č. ab68477; Abcam), anti‑aktín (1:2,000; kat. č. ab8227; Abcam) a antihistón H3 (1:2,000; kat. č. číslo ab176842; Abcam). Po inkubácii primárnej protilátky sa membrány inkubovali so zodpovedajúcimi sekundárnymi protilátkami konjugovanými s HRP (1:5, 000; kat. č. ab6721 a ab6728; obe Abcam) počas 1 hodiny pri teplote miestnosti. Proteínové pásy boli vizualizované vylepšenou chemiluminiscenčnou súpravou (Thermo Fisher Scientific, Inc.) s použitím systému Bio-Imaging (Bio-Rad Laboratories, Inc.) a semi-kvantifikované pomocou softvéru Quantity One (V4.6) (Bio-Rad Laboratories , Inc.). Hladiny expresie proteínov boli normalizované na -aktín pre cytoplazmatický proteín alebo histón pre nukleový proteín.
Reverzná transkripcia-kvantitatívna(RT-q)PCR.Obličkové tkanivosa odobral z I/R modelových myší po 24 hodinách reperfúzie na analýzu hladín expresie mRNA. Stručne, celková RNA sa extrahovala z tkaniva pomocou činidla TRIzol® (kat. č. 15596026; Invitrogen; Thermo Fisher Scientific, Inc.). Celková RNA bola reverzne transkribovaná do cDNA pomocou súpravy RevertAid First Strand cDNA Synthesis kit (kat. č. K1621; Thermo Scientific™; Thermo Fisher Scientific, Inc.) podľa protokolu výrobcu. qPCR sa následne vykonala pomocou SYBR PCR Master Mix (Thermo Fisher Scientific, Inc.) na systéme 7500 Real-Time PCR (Applied Biosystems; Thermo Fisher Scientific, Inc.). Podmienky termocyklovania boli nasledovné: Denaturácia pri 95 °C počas 5 minút; 40 cyklov pri 95 °C počas 15 sekúnd; a predĺženie pri 60˚C na 20 sekúnd. Sekvencie génovo špecifických primérov sú uvedené v tabuľke I. Relatívne hladiny expresie cieľových génov sa vypočítali pomocou metódy 2‑ΔACq (23) a normalizovali sa na hladiny expresie GAPDH.
Imunohistochémia (IHC). Obličkové tkanivosa odobral z I/R modelových myší po 24-hodinovej reperfúzii na stanovenie hladín expresie NLRP3 a Nrf2. v skratke,obličkytkanivo sa fixovalo pri teplote miestnosti počas 48 hodín v 10 percentnom formalíne, zalialo sa do parafínu a narezalo sa na 5 um rezy. Rezy boli následne blokované 5 percentným mliekom pri 37˚C počas 30 minút a inkubované s anti-NLRP3 (1:100; kat. č. ab214185; Abcam) alebo anti-Nrf2 (1:200; kat. č. ab137550; Abcam) primárne protilátky cez noc. Po inkubácii primárnej protilátky boli rezy inkubované s HRP-značenou anti-králičou sekundárnou protilátkou (1:200; kat. č. ab214880; Abcam) pri 37 °C počas 30 minút, vyvinutou s použitím roztoku diaminobenzidínu na<3 min="" and="" counterstained="" with="" 0.5%="" hematoxylin="" for="" 3="" min="" at="" room="" temperature.="" a="" light="" microscope="" was="" used="" to="" visualize="" ihc="" staining="" (magnification,="" x200;="" biorevo="" bz‑9000;="" keyence="">
Test funkcie obličiek. Po centrifugácii pri 3,000 x g počas 10 minút pri 4 °C od myší s I/R modelom po 24-hodinovej reperfúzii sa odobrali celkovo 2-3 ml krvi. Na analýzu sa získalo sérumfunkcie obličiekprostredníctvom ELISA na stanovenie hladín kreatinínu (kat. č. C011; Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute) a dusíka močoviny v krvi (BUN; kat. č. C013; Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute), podľa pokynov výrobcu.Poranenie obličiekhladiny molekuly-1 (KIM-1) v sére sa merali pomocou ELISA (kat. č. EK0880; Wuhan Boster Biological Technology Co., Ltd.) podľa pokynov výrobcu.
Farbenie hematoxylínom a eozínom.Obličkové tkanivosa odobral z I/R modelových myší po 24 hodinách reperfúzie na vyhodnotenieobličkovéhistopatologické zmeny. Tkanivo sa fixovalo pri teplote miestnosti počas 48 hodín v 10 percentnom formalíne a potom sa zalialo do parafínu. Rezy zaliate do parafínu sa narezali na rezy s hrúbkou 5 µm a zafarbili sa 0,5 percentným hematoxylínom počas 5 minút a eozínom počas 3 minút pri izbovej teplote (25 °C). Prítomnosť krvácania, tubulárnej bunkovej nekrózy, tubulárnej dilatácie a tvorby cytoplazmatických vakuol v tkanive bola hodnotená nasledovne: 0, normálneobličky;1, minimálne poškodenie; 2, stredné poškodenie; a 3, vážne poškodenie (24).Poranenie obličiekskóre vypočítali naslepo dvaja výskumníci pod svetelným mikroskopom (zväčšenie, x200; Biorevo BZ-9000; Keyence Corporation).
ELISA analýza hladín TNF-, IL-1 a IL-6. Krv sa odobrala (1 ml) z I/R modelu myší po 24-hodinovej reperfúzii. Sérum sa získalo centrifugáciou pri 3,000 x g počas 10 minút pri 4 °C. Sérové hladiny TNF‑ (kat. č. MTA00b), IL-1 (kat. č. MLB00C) a IL-6 (kat. č. M6000B) boli analyzované pomocou komerčné súpravy ELISA (R&D Systems, Inc.), podľa protokolu výrobcu na čítačke mikrodoštičiek (kat. č. CA94089; Molecular Devices, LLC).
CISTANCHE ZLEPŠÍ INFEKCIU OBLIČIEK/OBLIVÍN
Farbenie TUNEL.Obličkové tkanivosa odobral z I/R modelových myší po 24 hodinách reperfúzie na vyhodnotenie bunkovej apoptózy pomocou farbenia TUNEL. Stručne povedané, tkanivo bolo fixované pri teplote miestnosti počas 48 hodín v 10 percentnom formalíne, zaliate do parafínu a narezané na rezy s hrúbkou 5 μm. Rezy boli inkubované s činidlom TUNEL vo zvlhčenej komore pri 37 °C počas 60 minút v tme (Roche Diagnostics) a zafarbené s DAPI počas 5 minút pri teplote miestnosti. Potom sa náhodne vybralo 10 polí mikroskopu s vysokým výkonom a pozorovalo sa v každej sekcii fluorescenčným mikroskopom (zväčšenie x 10).Štatistická analýza. Údaje sú prezentované ako priemer ± SD z troch experimentov a boli analyzované pomocou GraphPad Prism 5 (GraphPad Software, Inc.). Štatistické rozdiely medzi dvoma skupinami boli analyzované pomocou párového Studentovho t-testu. Štatistické rozdiely medzi viac ako tromi skupinami boli analyzované s použitím jednosmernej ANOVA, po ktorej nasledoval post hoc Tukeyho viacnásobný porovnávací test. Všetky údaje boli normálne rozdelené a mali rovnaký rozptyl. P<0.05 was="" considered="" to="" indicate="" a="" statistically="" significant="">
Výsledky
Liečba MCC950 zabraňuje následnej aktivácii signalizácie NLRP3 indukovanej I/Rpoškodenie obličieku myší. Inflammasómová dráha NLRP3 je aktivovaná a zohráva kľúčovú úlohupoškodenie obličiek(25,26). Predchádzajúca štúdia tiež uviedla, že signalizácia NLRP3 je aktivovaná v obličkovom tkanive myší 24 hodín po reperfúzii (4). Preto sa ako aktuálny časový bod hodnotenia zvolilo 24 hodín po reperfúzii. Hladiny expresie proteínu NLRP3 boli upregulované poškodením I/R obličiek v skupine I/R v porovnaní s kontrolnou (Con) skupinou (obr. 1A a B). Podobný trend bol pozorovaný pri hladinách expresie mRNA NLRP3 (obr. 1C). Okrem toho sa počet buniek pozitívnych na NLRP3 zvýšil v skupine I/R v porovnaní so skupinou Con, ako bolo určené farbením IHC (obr. 1D a E).
Aby sa určil základný mechanizmus aktivácie zápalu NLRP3 a účinok na downstream signálnu dráhu po poškodení I/R obličiek, myši boli liečené inhibítorom NLRP3 MCC950. Výsledky Western blotting ukázali, že I/R upreguloval hladiny proteínovej expresie NLRP3 a jeho adaptéra ASC a podporil maturáciu z pro-kaspázy-1 na kaspázu-1 a pro-IL-1 na IL-1 v skupine I/R v porovnaní so skupinou I/R. Skupina Con (obr. 2A‑E). Tieto výsledky ukázali, že obličkové I / R môžu indukovať aktiváciu zápalovej dráhy NLRP3 a liečba MCC950 môže znížiť hladiny expresie NLRP3, ASC, kaspázy-1 a IL-1 po poškodení I / R obličiek.
Účinok zápalu NLRP3 napoškodenie obličiekzápalu a apoptózy u myší s renálnym I/R modelom. Za účelom
Na stanovenie účinku NLRP3 na poškodenie obličiek sa I/R modelové myši liečili inhibítorom NLRP3 MCC950. Myši s modelom renálneho I/R vykazovali signifikantne zvýšené hladiny BUN, sérového kreatinínu a KIM-1, čo je biomarker poškodenia obličiek (obr. 3A-C), čo naznačuje úspešnú indukciu I/R poškodenia obličiek. Histologické vyšetrenie obličkového tkaniva z myší s I/R modelom odhalilo zvýšené histologické skóre, ktoré bolo dokázané ťažkým tubulárnym epiteliálnym opuchom, tubulárnou dilatáciou a intersticiálnym edémom, vakuolárnou degeneráciou a stratou kefkového lemu, čo naznačuje, že obličkové I/R môžu podporovať významné poškodenie obličkového tkaniva a zvýšené histologické skóre (obr. 3D a E). Inhibícia NLRP3 liečbou MCC950 významne znížila I/R-indukované zvýšenie hladín BUN, kreatinínu a KIM-1 a znížilo histologické skóre, pričom obličkové tkanivo vykazovalo menej vážne poškodených tubulov (obr. 3A-E).
Okrem toho sa hladiny zápalových faktorov a apoptotických buniek po podaní MCC950 analyzovali na modeli obličkových myší I/R. Indikátory zápalu, vrátane TNF-, IL-1 a IL-6, boli významne upregulované v skupine I/R v porovnaní so skupinou Con (obr. 3F-H). Navyše, v porovnaní so skupinou Con bolo percento apoptotických buniek významne zvýšené 24 hodín po reperfúzii v skupine I/R (obr. 3I a J). V porovnaní so skupinou I/R boli sekrečné hladiny cytokínov, TNF‑, IL‑1 a IL‑6 a percento apoptotických buniek znížené liečbou MCC950 v skupine I/R plus MCC950 (obr. 3F‑J ). Tieto výsledky naznačujú, že inhibícia zápalu NLRP3 môže zabrániť uvoľňovaniu zápalových faktorov a apoptóze obličkového tkaniva indukovanej I/R.
Nrf2 je nevyhnutný pre renálnu I/R-indukovanú reguláciu zápalovej aktivity NLRP3.Predchádzajúca štúdia odhalila, že Nrf2 je aktivovaný a hladiny expresie cieľových génov Nrf2 sú upregulovanéobličkové tkanivopo poškodení I/R obličiek (27). Podobné zistenia sa získali aj v tomto výskume. Hladiny expresie nukleových kyselín, celkového proteínu a mRNA Nrf2 sa analyzovali 24 hodín po poškodení I/R obličiek. Výsledky ukázali, že v porovnaní so skupinou Con boli hladiny expresie nukleových kyselín, celkového proteínu a mRNA Nrf2 v skupine I/R upregulované (obr. 4A-D). Okrem toho analýza IHC zistila, že hladiny expresie Nrf2 v obličkovom tkanive boli zvýšené, čo bolo preukázané zvýšeným počtom Nrf2-pozitívnych
bunky pozorované v skupine I/R (obr. 4E a F). Tieto údaje naznačujú, že aktivácia signálnej dráhy Nrf2 môže iniciovať ochrannú reakciu u myší s renálnym I/R modelom. Aby sa overil účinok Nrf2 na zápalovú dráhu NLRP3 v obličkových I / R, v nasledujúcich experimentoch sa použili myši Nrf2‑KO. Hladiny proteínovej expresie Nrf2 a jeho cieľového génu, HO-1, boli významne znížené po renálnej I/R u KO myší v porovnaní s myšami divokého typu (obr. 5A-C). Naopak, v porovnaní so skupinou I/R divokého typu boli hladiny expresie NLRP3 a jeho adaptéra, ASC, kaspázy-1 a IL-1 upregulované v skupine I/R KO (obr. 5A a D-G). Tieto údaje naznačujú, že obličkové I / R môžu indukovať aktiváciu zápalu NLRP3 u myší Nrf2-KO.
NaHS zmierňuje I/R-indukovanú upreguláciu hladín expresie proteínu NLRP3 u myší divokého typu, ale nie u myší Nrf2-KO. Ukázalo sa, že NaHS má účinky na expresiu Nrf2 a aktiváciu zápalu NLRP3 v rôznych modeloch chorôb (28-30). Táto štúdia skúmala, či sa účinok NaHS na aktiváciu dráhy NLRP3 vyskytuje prostredníctvom signálnej dráhy Nrf2 analýzou hladín expresieproteínov spojených s zápalom Nrf2 a NLRP3 u myší divokého typu a KO myší.U myší divokého typu v porovnaní so skupinou Con boli hladiny expresie Nrf2, NLRP3, kaspázy-1 a IL-1 upregulované poškodením I/R obličiek. Okrem toho liečba NaHS ďalej zvýšila expresiu Nrf2 a znížila hladiny expresie NLRP3, kaspázy-1 a IL-1 v skupine I/R plus NaHS v porovnaní so skupinou I/R (obr. 6A-E). U myší Nrf2‑KO neboli pozorované žiadne štatisticky významné rozdiely v hladinách expresie Nrf2, NLRP3, kaspázy‑1 a IL‑1 medzi skupinami I/R a I/R plus NaHS (obr. 6A‑E). V skupine I/R plus NaHS boli hladiny expresie Nrf2 významne znížené, zatiaľ čo hladiny expresie NLRP3, kaspázy-1 a IL-1 boli významne zvýšené u myší Nrf2-KO v porovnaní s myšami divokého typu. Tieto výsledky naznačujú, že NaHS môže znížiť aktiváciu zápalu NLRP3 prostredníctvom signálnej dráhy Nrf2 pri poškodení I/R obličiek
NaHS zmierňuje poškodenie obličiek, zápal a apoptózu prostredníctvom signálnej dráhy Nrf2 u myší s renálnym I/R modelom. NaHS zohráva dôležitú úlohu pri poškodení obličiek v modeloch AKI, I/R a iných chorôb (31). NaHS zmiernil renálne I/R-indukované histopatologické poškodenie, ktoré sa prejavilo znížením tubulárneho epitelového opuchu, tubulárnou dilatáciou a intersticiálnym edémom aobličkyhistologické skóre v skupine I/R plus NaHS v porovnaní so skupinou I/R u myší divokého typu (obr. 7A a B). Indikátory funkcie obličiek, vrátane kreatinínu, BUN a KIM-1, boli tiež znížené liečbou NaHS v skupine I/R plus NaHS v porovnaní so skupinou I/R u divokého typu
myši (obr. 7C-E). U myší Nrf2‑KO však NaHS nedokázal znížiť zvýšenieobličkyhistologické skóre a hladiny indikátorov funkcie obličiek vyvolané I/R obličiek. Okrem toho, percento apoptotických buniek a uvoľňovanie cytokínov, TNF-, IL-1 a IL-6, boli všetky znížené po liečbe NaHS v I/R plus NaHSskupina v porovnaní so skupinou I/R u myší divokého typu (obr. 7F-J). NaHS však nebol schopný uplatniť ochranný účinok proti apoptóze a nadmernému uvoľňovaniu zápalových faktorov po reperfúzii obličkového tkaniva v skupine I/R plus NaHS myší Nrf2‑KO v porovnaní s myšami divokého typu I/R plus NaHS (obr. 7F-J). Tieto výsledky naznačujú, že NaHS môže zmierniť poškodenie obličiek, zápal a apoptózu u myší divokého typu I / R, ale nie u myší Nrf2-KO.
Diskusia
Zápal je kľúčovým patogénnym procesom AKI vyvolaným I/R (4). Inflammasóm NLRP3 a signálna dráha Nrf2 sa podieľajú na regulácii zápalu vpoškodenie obličiek(32). Táto štúdia zistila, že AKI indukovaný I/R aktivoval zápal NLRP3 a jeho adaptér, ASC, podporil dozrievanie pro-kaspázy-1 a pro-IL-1 a urýchlil nadmerné uvoľňovanie cytokínov a apoptózu, ktorá vyvrcholila závažnou renálna dysfunkcia. Inhibícia zápalu NLRP3 liečbou MCC950 zlepšila funkciu obličiek, hladiny zápalu a apoptózy v obličkovom tkanive. Okrem aktivácie NLRP3 renálny I/R aktivoval aj signálnu dráhu Nrf2. Neprítomnosť Nrf2 u myší Nrf2‑KO však viedla k ďalšej regulácii zápalu NLRP3 a jeho adaptéra. Zistilo sa, že liečba NaHS zmierňuje aktivitu zápalu NLRP3 prostredníctvom signálnej dráhy Nrf2. Okrem toho sa poškodenie obličiek, zápal a apoptóza znížili liečbou NaHS prostredníctvom inhibície aktivácie zápalu NLRP3 sprostredkovanej Nrf2.
Poškodenie I/R obličiek je dôležitým klinickým problémom a primárnou príčinou AKI, čo vedie k zvýšenému riziku vzniku chronickejochorenie obličiek(33). Zápal je dôležitým patologickým znakom ischemického poškodenia a vyskytuje sa ako dôsledok aktivácie imunitných buniek prostredníctvom rozpoznania molekulárnych vzorov spojených s patogénom a poškodením (34). Okrem toho sa už predtým uvádzalo, že zápal NLRP3 zohráva úlohu v rôznych oblastiachochorenia obličiekreguláciou zápalu, pyroptózy, apoptózy a fibrózy (35). Inflammasóm NLRP3 je proteínový komplex obsahujúci NLRP3, jeho adaptorový proteín, ASC a kaspázu-1. Kaspáza-1 štiepi pro-IL-1 a pro-IL-18 na zrelé, aktivované sekrečné formy. Poškodenie obličiek vyvolané rôznymi patologickými stavmi, vrátane ischémie (33), aktivuje inflammasómový komplex, upreguluje expresiu NLRP3 a podporuje následné dozrievanie pro-IL-1 (36). NLRP3 KO s použitím malej interferujúcej RNA u myší alebo renálnych tubulárnych epitelových buniek má ochranný účinok proti poškodeniu obličkového tkaniva vyvolanému ischémiou alebo poškodením buniek v neprítomnosti glukózy (37). Súčasné výsledky ukázali, že renálna I/R indukovala aktiváciu zápalu NLRP3, zatiaľ čo inhibícia NLRP3 pomocou MCC950 významne znížila hladiny expresie NLRP3 a ASC a dozrievanie pro-kaspázy-1 a pro-IL-1 v obličkovom I/R model zranenia. Okrem toho inhibícia NLRP3 pomocou MCC950 zlepšila renálnu dysfunkciu a znížila histopatologické poškodenie a skóre, nadmerné uvoľňovanie cytokínov a počet apoptotických buniek. Tieto údaje naznačujú, že aktivácia NLRP3 môže hrať kľúčovú úlohu pri poškodení obličiek a inhibícia NLRP3 môže mať ochranný účinok proti poškodeniu tkaniva a dysfunkcii vyvolanej renálnym I/R.
Predchádzajúce štúdie uvádzajú, že Nrf2 sa podieľa na zápalovej odpovedi (10-12). Okrem toho má Nrf2 kľúčovú protizápalovú, antioxidačnú alebo antiapoptotickú úlohu pri ischemických stavoch. Aktivácia signálnej dráhy prvku Nrf2/antioxidačnej odozvy zmierňuje zápal a apoptózu v obličkovom tkanive myší indukovaných cyklofosfamidom (38). Ďalšia štúdia preukázala, že aktivácia Nrf2 sulforafanom inhibuje aktivitu signálnej dráhy NF‑κB, čím zmierňuje zápal v dystrofickom svalovom tkanive (39). Okrem toho knockdown Nrf2 podporuje aktiváciu zápalu NLRP3 a vedie k aktivácii IL-1 v modeli ischémie (11). Súčasné údaje podporili zistenia, že obličkové I / R môžu indukovať signálnu dráhu Nrf2 a expresiu jej downstream cieľových génov, ako je HO-1. Myši Nrf2‑KO ďalej podporovali aktiváciu zápalu NLRP3, čo naznačovalo, že hladiny expresie NLRP3, ASC, kaspázy-1 a IL-1 sa zvýšili v renálnom I / R modeli. Tieto výsledky naznačujú, že Nrf2 má inhibičný účinok na aktiváciu zápalu NLRP3 pri poškodení obličiek I / R.
Predchádzajúci výskum uvádza, žeobličkyprodukuje H2S (40). Okrem toho H2S zvyšuje prietok krvi obličkami a podporuje funkciu klírensuobličkyčo dokazuje zvýšená rýchlosť glomerulárnej filtrácie (41). Okrem toho H2S nielen zmierňuje zápal a oxidačný stres, ale tiež zohráva kľúčovú úlohu pri regulácii endoteliálnej dysfunkcie a hypertenzie (28). H2S sa podieľa na regulácii ochorení spojených s obličkami, ako je poranenie I/R a obštrukčná a diabetická nefropatia (42), avšak základné mechanizmy zostávajú nedostatočne pochopené. NHS sa používa ako exogénny darca H2S vo výskume (43). V tejto štúdii bola dodávka H2S vo forme NaHS. Súčasné výsledky ukázali, že NaHS zlepšilo poškodenie tkaniva,obličkydysfunkcia, nadmerné uvoľňovanie cytokínov a apoptóza indukovaná renálnym I/R. Už skôr bolo uvedené, že NaHS zabraňuje mikrogliálnej aktivácii a zápalu vyvolanému poranením nervov prostredníctvom regulácie signálnej dráhy Nrf2 (44). V súlade s hypotézou, že NaHS reguluje zápal prostredníctvom signálnej dráhy Nrf2, súčasné výsledky ukázali, že NaHS upreguloval hladiny expresie Nrf2 a inhiboval hladiny expresie NLRP3 u myší s modelom obličkového I/R. Okrem toho Nrf2 KO zrušil regulačné účinky NaHS na Nrf2 a zápal NLRP3. Táto štúdia tiež skúmala úlohu Nrf2 pri poškodení a funkcii obličiek po liečbe NaHS; inhibícia Nrf2 nielen čiastočne zvrátila ochranný účinok NaHS napoškodenie obličieka dysfunkcia, ale tiež zvrátili inhibičný účinok NaHS na zápalovú odpoveď a apoptózu po renálnej I/R. Tieto výsledky naznačujú, že Nrf2 môže byť potrebný na ochranný účinok NaHS na AKI indukovaný I / R a NaHS môže vykonávať svoju ochrannú úlohu proti poškodeniu tkaniva prostredníctvom inhibície zápalu NLPR3 sprostredkovanej Nrf2. Záverom, I/R-indukované poškodenie obličiek aktivovalo NLRP3 inflammasóm a signálnu dráhu Nrf2 a inhibícia NLRP3 inflammasómu chránila pred poškodením obličiek. Nrf2 negatívne reguloval aktiváciu zápalu NLRP3 a zmiernil NaHSpoškodenie obličieka dysfunkcia, apoptóza a zápalová odpoveď prostredníctvom inhibície zápalu NLRP3 sprostredkovanej Nrf2. Tieto výsledky poskytujú nový pohľad na potenciálny budúci cieľ liečby ischemického poškodenia obličiek.
