Imunostimulačná aktivita vodou extrahovateľných polysacharidov z Cistanche Deserticola ako rastlinného adjuvans in vitro a in vivo

Úvod

Vakcíny sú dôležité na kontrolu alebo prevenciu chorôb. Novo generované a v súčasnosti vyvíjané vakcíny sú vysoko purifikované rekombinantné antigény s vyššou bezpečnosťou, ale purifikované antigény nemôžu stimulovať uspokojivú imunitnú odpoveď v porovnaní s oslabenými alebo inaktivovanými patogénnymi prípravkami. S pomocou adjuvans môžu vakcíny vyvolať pretrvávajúce imunitné reakcie [1,2]. Nové silné adjuvans sú široko zainteresované v oboch vakcínachrozvoj a ľudské zdravie. K dnešnému dňu boli identifikované a rozsiahle študované rôzne adjuvans. Tieto adjuvans poskytujú vakcínam niekoľko výhod, vrátane zníženia potrebného množstva antigénov, minimalizácie počtu imunizácií potrebných pre normálnu imunitnú odpoveď a indukcie rýchlejšej, širšej a silnejšej imunitnej odpovede.3–5]. Hoci bolo vyvinutých mnoho účinných adjuvans, ako je lipopolysacharid (LPS) a Freundovo kompletné adjuvans (FCA), nie sú široko používané kvôli ich toxicite. Preto len niekoľko adjuvans, ako je kamenec, má licenciu na klinické použitie [6]. Celkovo by sa mali vyvinúť účinnejšie a bezpečnejšie adjuvans na podporu lepších profylaktických a terapeutických vakcín proti infekčným a neinfekčným ochoreniam.

PRÍRODNÁ CISTANCHE TUBULOSA NA ZVÝŠENIE IMUNITY PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Bezpečnosť je dôležitým faktorom pri vývoji adjuvans. Čínske bylinné zložky zahŕňajú živiny a dôležité aktívne zložky, ako sú fenolové zlúčeniny a polysacharidy, ktoré môžu pôsobiť ako silné imunostimulanty [7–9]. Spomedzi nich boli široko skúmané polysacharidy z tradičných čínskych bylín kvôli ich imunostimulačným aktivitám a nízkej toxicite. Napríklad inulín je imunitné adjuvans bez toxicity iných adjuvans, ako je FCA. AdvaxTM delta inulínové adjuvans tiež úspešne zvýšilo imunogenicitu vakcíny [10,11]. Astragalus, tiež známy ako Huangqi v čínštine a Radix Astragali v latinčine, je široko rozšírený po celom svete. Polysacharid je jednou z jeho hlavných aktívnych zložiek zodpovedných za imunomodulačnú aktivitu. Experimentálne štúdie ukázali, že polysacharid Astragalus má silné imunomodulačné účinky in vitro aj in vivo [12, 13]. Polysacharidy Lycium barbarum ako adjuvans vakcíny tiež vykazovali dobré zlepšenia a stimulačné účinky [14, 15]. Tieto štúdie naznačili, že čínske rastlinné polysacharidy boli ideálnymi kandidátmi na vývoj adjuvans.

Cistanche deserticolaYC Ma (CD, v čínštine „Rou Cong Rong“) je cenná tradičná čínska bylina a bežne sa považuje za „Ženšen púští“ pre svoje vynikajúce tonizujúce účinky. Je distribuovaný v suchých alebo polosuchých oblastiach v Xinjiang. V Číne sa jeho sušená dužinatá stonka používa ako tonizujúce jedlo už stovky rokov [16, 17]. Po mnoho rokov sa varené CD používa ako tonizujúce jedlo na liečbu porúch spôsobených nadmerným zaťažením, čo naznačuje, že je bezpečné na perorálne podávanie. Táto rastlina je široko považovaná za jej široké liečivé funkcie. Nedávne fytochemické a farmakologické štúdie ukázali, že polysacharidy boli hlavnými biologicky aktívnymi zložkami a mali rôzne biologické účinky, vrátaneimunomodulačná aktivita, antioxidačný účinok a protizápalové účinky[18 – 21]. Avšak aktivita na zvýšenie imunity vodou extrahovateľných polysacharidov z C. deserticola v Xinjiang bola hlásená len zriedka.

Je dobre známe, že DC sú dôležité bunky prezentujúce antigén (APC), ktoré poskytujú signály potrebné na spustenie imunitných reakcií a moduláciu vrodených a adaptívnych buniek. Niektoré adjuvans zlepšujúce vychytávanie antigénu DC môžu zvýšiť kostimulačné alebo MHC molekuly aposilniť imunitu. Keď začne dozrievanie DC, produkuje sa viac kostimulačných molekúl a cytokínov a DC vykazujú odlišné fenotypy [22, 23].

V tejto štúdii sme najprv využili, či WPCD môže podporovať aktiváciu DC prostredníctvom signálnej dráhy TLR4 in vivo. Pretože DC boli spojením medzi vrodenými a adaptívnymi imunitnými odpoveďami, predpokladali sme, že aktivácia DC stimulovaná WPCD by ovplyvnila výsledok adaptívnej imunity. Skúmali sme špecifickú imunitnú odpoveď na ovalbumín (OVA) u myší liečených WPCD, vrátane titrov IgG, IgG1 a IgG2a podtriedy, T- a B- proliferácie a produkcie cytokínov. Skúmali sme, či by liečba WPCD zvýšila aktivitu DC a Treg buniek v slezine týchto myší. Naše zistenia potvrdili potenciálnu imunomodulačnú aktivitu prírodných polysacharidov z C. deserticola a rozšírili rozsah ich aplikácie.

Materiály a metódy

Zvieratá

Osem až desaťtýždňové samice myší C57BL/6, BALB/c alebo ICR boli zakúpené od First Hospital of Xinjiang Medical University (Urimuqi, Xinjiang, Čína). Myši boli chované v podmienkach bez patogénov podľa smerníc Výboru pre starostlivosť o zvieratá a ich používanie (ACUC) Univerzity Xinjiang pre zdravie a pohodu zvierat. Postupy pokusov na zvieratách boli schválené AUCC univerzity Xinjiang.

Extrakcia vodných extraktov

C. deserticola je závod v provincii Xinjiang v Číne. Surový polysacharid sa získal extrakciou vodou a zrážaním etanolom. Stručne, 10}0 g sušenej C. deserticola sa rozomlelo na prášok a potom sa prefiltrovalo. Prášok sa opakovane refluxoval s petroléterom pri teplote miestnosti a potom sa refluxoval s bezvodým etanolom počas 1 hodiny, aby sa odstránili farebné zložky a lipidy. Zvyšky sa trikrát extrahovali vriacou vodou a extrakty sa spojili, centrifugovali pri 4000 otáčkach za minútu počas 10 minút a refluxovali pri 60 °C počas 4 hodín. Do roztoku sa pridal štvornásobný objem 95 % etanolu, aby sa vyzrážali surové polysacharidy. Surové polysacharidy boli znovu rozpustené v destilovanej vode a ošetrené Sevageovým činidlom, aby sa odstránili proteíny. Extrakty boli rozpustené v PBS a sterilizované cez 0,{9}}μm filter. Nakoniec, celkový obsah cukru vo WPCD bol 59,58 %, ako ukazuje analýza fenol-kyselina sírová [24].

Generovanie DC

BM-DC boli vytvorené podľa skôr opísanej metódy s miernymi modifikáciami [25]. DC kostnej drene z myší C57BL/6 sa vypláchli kompletným médiom RPMI-1640 (Gibco) doplneným 10 % fetálnym teľacím sérom (Hyclone). Zozbierané bunky boli resuspendované v RPMI-1640 médiu s 50 μM merkaptoetanolu (Sigma, St Louis, MO) a 20 ng/ml myšieho GM-CSF (Peprotech, Rocky Hill, NY) a inkubované pri 37 ° C v atmosfére 5 % CO2. Polovica kultivačného média bola nahradená čerstvým médiom obsahujúcim GM-CSF každé 1 až 2 dni. Bunky boli zozbierané v deň 6, ošetrené rôznymi dávkami WPCD a LPS (100 ng/ml) (Sigma, St Louis, MO) počas 24 hodín a potom hodnotené prietokovou cytometriou.

Detekcia dozrievania DC a aktivácie T buniek in vitro

Účinok dozrievania in vitro WPCD na BM-DC sa hodnotil na základe výsledkov fenotypovej analýzy pomocou FAC. V deň 7 boli BM-DC z C57BL/6 indukované v prítomnosti GM-CSF a potom ošetrené rôznymi koncentráciami WPCD (0.01, 0.{{{{101} 11}}2, 0,05, 0,1 a 0,2 mg/ml) počas 12 hodín trojmo. LPS (100 ng/ml) sa použil ako pozitívna kontrola. Potom, čo sa BM-DC premyli v PBS a použil sa Fc Block (BD Biosciences, CA) na zabránenie nešpecifickej väzby protilátky, bunky sa zafarbili v PBS s použitím vhodného FITC-, PE- alebo APC-konjugovaného CD40, CD11c, CD{ {23}}, CD80 a protilátky MHC-II (BD) počas 20 minút pri 37 °C. Zafarbené bunky boli detegované pomocou FACs Calibur (BD). Analýza údajov sa uskutočnila pomocou softvéru FlowJo (Tree Star).

V experimente dozrievania DC in vitro sa supernatanty bunkových kultúr odobrali aj na analýzu IL-12 a TNF- pomocou súprav na testovanie cytokínov (Boster, Wuhan, Čína) podľa pokynov výrobcu. Absorbancia pri 450 nm sa merala pomocou čítačky platní ELISA (Bio-Rad, USA). Množstvo cytokínov vo vzorkách sa vypočítalo pomocou štandardných kriviek rekombinantných cytokínov podľa regresnej lineárnej metódy.

Na testovanie ich alogénnej stimulačnej aktivity sa uskutočnil experiment zmiešanej lymfocytovej reakcie (MLR) podľa predchádzajúcej metódy [26] pomocou testu MTT (Sigma, St Louis, MO). Stručne, BM-DC z myší C57BL/6 použité ako stimulačné bunky sa získali v deň 7 v médiu RPMI-1640 plus GM-CSF a ošetrili sa rôznymi koncentráciami WPCD počas 12 hodín pri 37 °C. Bunky sa premyli a resuspendovali v médiu RPMI{10}} pred nanesením do 24-jamkovej platne. Bunky reagujúce na suspenziu singleplenocytov boli izolované z BALB/c myší. BM-DC boli zmiešané so splenocytmi v pomeroch 1:5 a 1:10. Bunky sa kultivovali pri 37 °C v atmosfére 5 % CO2 počas troch dní v troch vyhotoveniach. Liečba LPS sa použila ako pozitívna kontrola. Kultúry sa následne pridali s 20 ul MTT na poslednú 4-hodinovú kultiváciu. Absorbancie pri meracej vlnovej dĺžke (490 nm) a referenčnej vlnovej dĺžke (650 nm) sa merali pre analýzu proliferácie T buniek. Všetky vzorky sa merali oproti kontrole pozadia.

PRÍRODNÁ CISTANCHE TUBULOSA PRE ZLEPŠENIE VÁŠHO IMUNITNÉHO SYSTÉMU PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Liečba inhibítorom TLR4 in vitro

BM-DC boli vopred ošetrené 5 μM TAK-242 (inhibítor TLR4, Medchemexpress Inc. USA) počas 1 hodiny a potom spoločne kultivované s rôznymi koncentráciami WPCD (100 a 200 ug/ml) počas 12 hodín v prítomnosti alebo neprítomnosti Golgiho Stop v troch vyhotoveniach. V pozitívnej kontrole bol pridaný LPS. Bunky a supernatanty boli detegované pomocou FAC na analýzu povrchových markerov CD{10}} a CD40 a pomocou ELISA na analýzu cytokínov TNF-a a IL{13}}.

Imunizačný protokol

Test akútnej toxicity

Pri orálnom teste akútnej toxicity v tejto štúdii boli použité 40 zdravé dospelé ICR myši. ICR myši boli pred podaním dávky nalačno (potrava, ale nie voda cez noc). WPCD sa podával orálne v dávkach 0, 50, 500 alebo 5000 mg/kg telesnej hmotnosti každému zvieraťu počas 7 dní. Do kontrolnej skupiny boli zahrnuté myši liečené fyziologickým roztokom a alumom. Zvieratá boli pozorované denne počas 14 po sebe nasledujúcich dní. Myši boli jednotlivo pozorované, aby sa zaznamenala úmrtnosť a klinické príznaky. Okrem toho sa počas experimentu merala telesná hmotnosť a spotreba potravy a vody. V deň 14 sa index sleziny alebo týmusu vypočítal ako (hmotnosť sleziny alebo týmusu/telesná hmotnosť) × 10.

Detekcia imunomodulačnej aktivity WPCD in vivo.

Na zistenie, či má WPCD imunomodulačnú aktivitu, sa ako modelový antigén použil ovalbumín (OVA) (Sigma) a samice myší ICR boli náhodne rozdelené do 7 skupín (negatívna kontrolná skupina (0,9 % NaCl a WPCD 400 ug ) a pozitívna kontrola (alum 200 ug s OVA)). Myšiam sa dvakrát subkutánne podávalo 10 ug samotného OVA alebo WPCD s OVA podľa dávky 20, 100 alebo 400 ug s 2-týždňovým intervalom. Vzorky krvi a slezina sa získali po posilňovacej vakcinácii na detekciu titrov IgG, podtried IgG, proliferácie splenocytov a cytokínov, povrchových markerov DC a frekvencie Treg.

Detekcia OVA-špecifických protilátok

OVA-špecifické IgG titre a podtriedy boli skúmané pomocou ELISA podľa predchádzajúcej metódy [27]. Doštičky ELISA (Nunc, Thermo Fisher Scientific) boli cez noc potiahnuté a potom blokované. Vzorky séra sa sériovo zriedili na analýzu titra IgG alebo detekciu IgG1 a IgG2a (Southern Biotech, Inc.). Doštičky sa potom inkubovali s PBST obsahujúcim HRP-konjugovaný anti-myší IgG, IgG1 a IgG2a počas 1 hodiny pri 37 °C. Kolorimetrická reakcia bola vyvolaná tetrametylbenzidínom (TMB) a potom boli zmerané absorbancie pri 450 nm/655 nm a vyjadrené ako jednotky optickej hustoty (OD).

Detekcia proliferácie splenocytov a cytokínov

Proliferácia splenocytov bola stanovená testom MTT. V deň 21 po prvej vakcinácii sa získala suspenzia jedného splenocytu. Bunky sa kultivovali v RPMI-1640 médiu v 96-jamkových doštičkách podľa koncentrácie 1 x 106 buniek/jamku v troch vyhotoveniach. Kultúry boli stimulované pomocou OVA (konečná koncentrácia 10 ug/ml), ConA (konečná koncentrácia 5 ug/ml) (Sigma, St Louis, MO) a LPS (konečná koncentrácia 100 ng/ml) počas 48 hodín pri 37 °C. . Bunky sa kultivovali 48 hodín a do každej jamky sa pridalo 20 ul (5 mg/ml) MTT (Sigma, St Louis, MO) a inkubovalo sa ďalšie 4 hodiny. Po pridaní 50 ul DMSO do každej jamky, aby sa zastavil vývoj farby (Sigma), sa platne odčítali pri 570 nm pomocou čítačky mikrotitračných platní (BioRad, CA, USA). Proliferácia splenocytov bola vyjadrená ako stimulačný index (SI), čo bol pomer OD570 nm stimulovanej jamky k nestimulovanej jamke.

Výťažky IL{0}} a IFN- v T bunkách sa merali intracelulárnym cytokínovým farbením podľa publikovaného protokolu s menšími úpravami [27, 28]. Suspenzia jednotlivých splenocytov bola pripravená v deň 21 po prvej vakcinácii. Po lýze červených krviniek sa splenocyt (2 x 106 buniek/ml) inkuboval s OVA (10 ug/ml) počas 4-h stimulácie a pridala sa Golgiho zastávka (BD) na 12 hodín inkubácie, PMA ako pozitívny ovládanie. Bunky boli zozbierané, premyté PBS, zafarbené CD4-FITC/CD8-FITC a fixované a permeabilizované pomocou súpravy Cytofix/Cytoperm (BD) podľa pokynov výrobcu. Intracelulárne cytokínové farbenie sa uskutočnilo s vhodnou koncentráciou IL-4-PE alebo IFN- -APC protilátok pri 4 °C počas 20 minút. Zafarbené bunky boli detegované pomocou FAC. Analýza údajov sa uskutočnila v zariadení FlowJo.

Hodnotenie dozrievania DC a Treg buniek v slezine

Na analýzu dozrievania DC zo splenocytov u myší sa uskutočnilo farbenie povrchu buniek CD11c-PE, CD40-FITC a CD80-APC protilátkami. V deň 3 po prvej vakcinácii sa získala suspenzia jednotlivých splenocytov (1 x 106 buniek/ml) a bunky sa podrobili dvojitému farbeniu. Intenzity fluorescencie sa merali pomocou FACs Calibur a namerané údaje sa analyzovali pomocou FlowJo.

Sledovať, či WPCD dokáže znížiť frekvenciu buniek CD4+ CD25+ Foxp3+ Treg. Suspenzia jednotlivých splenocytov bola pripravená v deň 7 po druhej vakcinácii. Splenocyt (2 x 106 buniek/ml) sa podrobil farbeniu povrchu buniek s protilátkou CD4-APC, po čom nasledovalo farbenie jadrového cytokínu vhodnými protilátkami CD25-FITC a Foxp3-PE pomocou súpravy na farbenie myších regulačných T-buniek (eBiosciences) podľa pokynov výrobcu. Frekvencia buniek CD4+ CD{12}} Foxp{13}} Treg bola testovaná na FAC. Analýza údajov sa uskutočnila v zariadení FlowJo.

Štatistická analýza

Na analýzu rozdielov medzi viacerými experimentálnymi skupinami sa uskutočnila jednosmerná analýza rozptylu (ANOVA) testov (Tukey's Multiple-Comparison Test). Všetky hodnoty sú vyjadrené ako priemer ± SD. P< 0.05 is believed to be statistically significant. The statistical analyses were performed using Prism 5.0 software.

Výsledky WPCD podporovalo dozrievanie a funkciu BM-DC in vitro

Adaptívna imunita je určená aktiváciou DC, vrátane typov kostimulačných molekúl a cytokínov [29, 30]. Spočiatku sme skúmali, či WPCD môže podporovať expresiu kostimulačných molekúl. Podľa rôznych dávok WPCD, BM-DC

z C57BL/6. Analyzovali sa hladiny expresie CD11c, CD86, CD80, CD40 a MHC-II v bunkách (obr. 1). Bunky uzavreté pomocou SSC a FSC ukázali, že ošetrenie rôznymi dávkami WPCD nezmenilo morfológiu BM-DC (údaje nie sú uvedené). Hladiny expresie CD86, CD80 a CD40 boli významne upregulované spôsobom závislým od dávky v porovnaní s neliečenou skupinou a dosiahli plató pri dávke 20 ug/ml WPCD, ale rozdiel bol nevýznamné v porovnaní so skupinou LPS (obr. 1A–1C). Hladina expresie MHC-II bola významne zvýšená na svoju maximálnu hodnotu pri dávke 50 ug/ml (obr. 1D). Výsledky analýzy bunkových povrchových markerov ukázali, že DC ošetrené LPS alebo WPCD vykazovali významne zvýšené hladiny expresie CD86, CD80, CD40 a MHC-II a podporovali fenotypové dozrievanie.

Niektoré adjuvans by mohli zvýšiť kostimulačné molekuly na DC alebo priamo indukovať sekréciu cytokínov. IL-12 a TNF- sú hlavné cytokíny na aktiváciu Th1 imunitnej odpovede. Analyzovali sme výťažky cytokínov v BM-DC po liečbe WPCD. Potom, čo boli BM-DC ošetrené rôznym obsahom WPCD počas 12 hodín, supernatant sa odobral na detekciu obsahu IL-12 a TNF- pomocou súpravy ELISA. WPCD by mohol v závislosti od dávky zvýšiť produkciu IL-12 (obr. 2A) a TNF- (obr. 2B). Výsledky ukázali, že WPCD môže vyvolať funkčné dozrievanie DC.

Pri imunitnej odpovedi je potrebné funkčne aktivovať DC. Potom bola vyššia úroveň alogénnej proliferácie T-buniek indukovaná úplne zrelými DC. Preto bola funkčná odpoveď DC na WPCD skúmaná pomocou MLR. Alostimulačná schopnosť DC indukovaných WPCD, podobne ako LPS, sa dramaticky zvýšila spôsobom závislým od dávky v uvedenom pomere (obr. 2C a 2D). Výsledky ukázali, že WPCD zlepšilo prezentáciu antigénu a optimalizovalo odpoveď T-buniek pomocou MLR in vitro.

WPCD podporovalo dozrievanie DC prostredníctvom dráhy TLR4

Z vyššie uvedených výsledkov možno odvodiť, že BM-DC aktivované pomocou WPCD indikovali podobné expresie povrchových molekúl DC ako LPS (ligand TLR4). Preto sme predpokladali, že BM-DC sú aktivované WPCD prostredníctvom dráhy TLR4. Potom, čo boli BM-DC vopred ošetrené TAK-242 (inhibítor TLR4) a kokultivované s WPCD a LPS počas 12 hodín, expresia CD40, CD86, TNF-a alebo IL{{12 }} bol detekovaný pomocou FAC alebo ELISA. Ako je znázornené na obrázku 3A a 3B, liečba TAK{15}} viedla k výrazne zníženej expresii CD40 a CD{18}} indukovanej LPS alebo WPCD a produkcii cytokínov IL-12 alebo TNF-a boli tiež významne znížené (obr. 3C a 3D). Výsledky ukázali, že WPCD môže aktivovať dozrievanie DC prostredníctvom dráhy TLR4.

WPCD zvýšila humorálnu a bunkovú imunitu

Na porovnanie sme hodnotili účinky WPCD na vyvolanie humorálnej imunitnej odpovede u myší imunizovaných OVA. Pred očkovaním a v dňoch 14., 21.

35 a 49 po prvej vakcinácii sa odobrala krv na detekciu titra IgG a séra podtried IgG pomocou ELISA. IgG protilátková odpoveď na OVA sa zvyšovala so zvyšovaním dávky podávania WPCD (100 a 400 ug) spôsobom závislým od dávky (obr. 4). Optimálna koncentrácia bola 100 ug/ml WPCD a zvýšila odpovede IgG dvojnásobne v porovnaní so samotným OVA v dňoch 21, 35 a 49 (obr. 4A). Značné zvýšenia hladín protilátok IgG1 a IgG2a špecifických pre OVA pri podaní 20 a 100 ug WPCD sa dosiahli v porovnaní so skupinou s OVA v sére v deň 35 (obr. 4B). Medzitým Alum podporoval iba hladiny expresie protilátok IgG a IgG1 špecifických pre OVA u imunizovaných myší. Samotný WPCD nespúšťal protilátky špecifické pre OVA. Vyššie uvedené výsledky ukázali, že WPCD generoval vyššie titre protilátok a vyváženejšie Th1/Th2 reakcie ako Alum.

Proliferácia splenocytov je ďalším indikátorom bunkovej imunity. ConA stimuluje T-bunky a LPS stimuluje proliferáciu B-buniek. V deň 21 po prvej vakcinácii bola získaná suspenzia jednotlivých splenocytov, ktorá bola stimulovaná OVA (10 ug/ml), OVA323-339 (10 ug/ml) peptidom, ConA (5 ug/ml) a LPS ( 5 ug/ml) počas 48 hodín. Potom sa merala proliferácia T buniek metódou MTT. WPCD by mohol významne podporovať OVA-antigén, Con A-mitogén a LPS mitogénom stimulovanú proliferáciu splenocytov u myší imunizovaných OVA a WPCD (obr. 5) a optimálna koncentrácia WPCD bola 100 ug/ml. Tieto údaje naznačujú, že WPCD ako adjuvans vakcíny u myší imunizovaných OVA by mohol účinnejšie indukovať aktiváciu T-buniek a B buniek ako Alum.

Všetky testované WCPD adjuvans formulované s OVA vakcínami vytvorili rovnako silnú humorálnu a bunkovú imunitu (obr. 4 a 5). Na základe týchto údajov, aby sme ďalej vyhodnotili vplyvy WPCD na odpoveď pomocných (Th) buniek špecifických pre OVA, sme ďalej analyzovali expresiu cytokínov v CD8+ a CD4+ T bunkách pomocou prietokovej cytometrie (obr. 6) . V deň 21 po prvej vakcinácii sa izoloval jeden splenocyt myší a potom sa kokultivoval s OVA (10 ug/ml). Výťažok IL-4 v CD{10}} T bunkách v skupine, ktorej sa podávalo 100 ug OVA/WPCD, bol významne vyšší ako v skupine OVA/Alum a skupine OVA a podobný ako v PMA (obr. 6A). Okrem toho bol výťažok IFN- v CD8+ a CD4+ T bunkách tiež významne zvýšený u myší, ktorým bol podávaný OVA/WPCD (20, 100 a 400 ug) (obr. 6B a 6C). V porovnaní s adjuvans Alum WPCD preukázal lepšiu schopnosť indukovať sekréciu IL-4 a IFN- z T buniek.

WPCD stimulované dozrievanie DC a znížená frekvencia Treg in vivo DC sú uznávané ako najsilnejšie APC zapojené do iniciácie primárnych imunitných reakcií. Teda v deň 3 po prvej vakcinácii sme tiež skúmali účinky WPCD na CD40 a CD80 na DC v slezine u myší (obr. 7A a 7B). Myši v skupine 100-ug OVA/WPCD produkovali významne vyššie hladiny CD40 a CD80 na DC ako myši v skupine OVA/Alum. Tieto údaje ukázali, že WPCD môže aktivovať DC a vyvolať dozrievanie DC u myší. Treg bunky môžu vyrovnávať toleranciu a imunitné reakcie. Aby sa ďalej preskúmalo, ako WPCD moduloval imunitnú odpoveď, bunky Treg v slezine u myší sa zafarbili pomocou súpravy na farbenie myších regulačných T buniek. Na 21. deň po prvej vakcinácii bola pozorovaná znížená frekvencia CD25+ Foxp3+ Treg buniek v celkovom množstve CD4+ T buniek (obr. 7C). V porovnaní so skupinami OVA a OVA/Alum skupina WPCD vykazovala významne zníženú frekvenciu Treg.

Hodnotenie bezpečnosti WPCD u myší

Na odhad orálnej akútnej toxicity sme vykonali test akútnej toxicity. Myši, ktorým sa perorálne podávalo 5000 mg/kg telesnej hmotnosti, nevykazovali žiadne abnormálne správanie alebo vedľajšie účinky a v teste hodnotenia toxicity sa nezistila žiadna úmrtnosť. Medzi rôznymi skupinami myší, ktorým sa podávali rôzne dávky WPCD, nebol zaznamenaný žiadny významný rozdiel v prírastku telesnej hmotnosti, indexe týmusu a indexe sleziny a nemal žiadny významný rozdiel (tabuľka 1). Po 14 dňoch nebola pozorovaná žiadna mortalita. Preto hodnota LD50 WPCD bola viac ako 5000 mg na kg telesnej hmotnosti.

Aby sa otestovalo, či má WPCD negatívne účinky na rast myší, pred a po subkutánnej vakcinácii sa pre každú myš stanovila telesná hmotnosť (tabuľka 2). Pri následnom pozorovaní myší neboli pozorované vedľajšie účinky alebo abnormálne správanie. Okrem toho telesná hmotnosť myší, ktorým bol podávaný WPCD, a myší, ktorým bol podávaný fyziologický roztok alebo OVA/Alum, nevykazovala žiadny významný rozdiel. Tieto výsledky pozorovania ukázali, že podávanie WPCD bolo bezpečné.

Diskusia

Adjuvans sú kľúčovými zložkami vakcín [31]. Vďaka pokroku v genomike a proteomike sa identifikuje stále viac rekombinantov a molekúl syntetických vakcín. Preto je potrebných viac adjuvans a formulácií. Niektoré silné adjuvans sú vo všeobecnosti spojené so zvýšenou toxicitou, napríklad FCA. Preto je potrebné nájsť bezpečnú formuláciu obsahujúcu rôzne synergické zložky, ktoré prípadne poháňajú požadovanú imunitnú odpoveď.Polysacharidy z čínskych bylín sú netoxickéa nevykazujú žiadne významné vedľajšie účinky [32,28]. Pre určitú vakcínu je potrebný bezpečný adjuvans.

Cistanche deserticola je dôležitá posilňujúca bylina, ktorá sa bežne vyskytuje v suchých krajinách a teplých púštiach na severozápade Číny. Cistanche deserticola je široko znepokojený kvôli svojim biologickým aktivitám vrátane imunomodulačných, antioxidačných, antibakteriálnych a protinádorových účinkov [20,21]. Určitý pokrok sa dosiahol v štruktúrnej charakterizácii a imunologickej aktivite Cistanche deserticola, ktorá je dobrým kandidátom na vývoj adjuvans. Experimentálne sme hodnotili adjuvantné účinky a mechanizmus WPCD in vitro a in vivo. Subkutánne podanie WPCD významne podporilo humorálne a bunkové imunitné reakcie zvýšením sérových protilátok a proliferácie lymfocytov, zvýšením expresie cytokínov, zvýšením regulácie dozrievania DC a znížením frekvencie CD4+CD{{5} } Foxp3+ bunky Treg.

DC sú kľúčové APC na primovanie naivných T buniek. Aktivácia DC je dôležitá pre adjuvans. DC, najmä DC odvodené z myšacej drene, sa často používajú na hodnotenie adjuvans a vakcín. Prietoková cytometria dokáže rozlíšiť bunky, ktoré boli aktivované po zachytení antigénu z okolitých buniek. V FCM analýze stupeň agregácie stimulovaných

buniek je nepriamym indikátorom hodnotenia bezpečnosti imunomodulátorov [3]. Údaje o adjuvantnej aktivite WPCD v DC in vitro teda môžu poskytnúť cenné informácie pre zvieracie modely. Na základe modelu BM-DC boli hladiny expresie MHC-II, CD86, CD80 a CD40, produkcia cytokínov a proliferácia alogénnych T buniek detegované v optimálnom rozsahu koncentrácie WPCD. Hladiny expresie MHC-II, CD{7}}, CD80 a CD40 boli upregulované v BM-DC a výťažky TNF-a a IL-12 boli zvýšené v závislosti od dávky. Pozorovala sa alogénna proliferácia T buniek. Morfológia BM-DC sa nezmenila. Vyvolaním aktivácie BM-DCs a sekrécie zápalových cytokínov in vitro môže adjuvans WPCD významne zvýšiť množstvo antigénu a počet APC a stimulovať T bunky k sekrécii IFN-, čo prispieva k zvýšeniu imunomodulačnej aktivity.

RôzneČínske bylinné polysacharidysú schopné aktivovať imunitný systém a majú vynikajúce adjuvantné schopnosti prostredníctvom stimulácie dozrievania DC dráhou TLR4 [33,28]. Predpokladáme teda, že TLR4 sa podieľa na signálnej dráhe dozrievania DC indukovaných WPCD. Ako sa očakávalo, liečba inhibítormi TLR4 viedla k významnému zníženiu TNF-a a IL-12. Okrem toho inhibícia dráhy TLR4 tiež bránila expresii CD40 a CD80 na DC, čo naznačuje, že dozrievanie DC bolo závislé od TLR4. Preto je zrejmé, že TLR4 sa podieľa na dozrievaní DC indukovaných WPCD.

PRÍRODNÁ CISTANCHE TUBULOSA NA ZLEPŠENIE IMUNITY PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Optimálna dávka adjuvans a vakcínová formulácia je empiricky určená v mnohých experimentoch. Aby sme preskúmali vzťah medzi dávkou a odozvou adjuvans WPCD a antigénov OVA u myší, vybrali sme rôzne dávky WPCD na základe predtým hlásených údajov z BM-DC in vitro na subkutánne podávanie ICR myšiam dvakrát. Zistili sme, že WPCD významne zvýšilo výťažok OVA-špecifických protilátok a vyvolalo vyváženú imunitnú odpoveď Th1/Th2 so zvýšením hladín IgG1 a IgG2a. Najmä hladina IgG2a bola vyššia ako hladina ošetrená kamencom v optimálnej dávke. Preto WPCD viedla k vyšším hladinám špecifických protilátok a vyššej účinnosti s nižšími injekciami.

Nové vakcíny vyžadujú vyvolanie silných bunkových odpovedí, ktoré zahŕňajú protilátky, pomocné T bunky (Th) a cytotoxické T lymfocyty (CTL). Terapeutická vakcína má za cieľ vyvolať silnejšie reakcie T buniek. Ideálne adjuvans zvyšuje účinnosť vakcíny a podporuje bunkami sprostredkovanú imunitu bez toho, aby spôsobovalo toxické účinky [34]. Medzi pozorovaniami na modeloch imunizovaných myší viedla WPCD k zvýšeniu OVA-špecifickej a nešpecifickej proliferácie splenocytov v porovnaní s Alum. Niektoré adjuvans up-regulujú cytokíny a imunitný systém. Saponíny môžu napríklad stimulovať bunkami sprostredkované imunitné reakcie na antigén, ktorý normálne indukuje len protilátky. Vybrali sme IL-4 a IFN- ako indikátory na nepriame vyhodnotenie úrovní imunity u myší. WPCD môže indukovať viac sekrécií IL-4 a IFN- ako kamenec. V dôsledku očkovania WPCD sa teda pozorovali silné reakcie pomocných T-buniek a sekrécie cytokínov, čo naznačuje, že WPCD by mohla účinnejšie stimulovať lymfocyty, aby sekretovali cytokín typu Th{11}} a cytokín typu Th{12}} než Kamenec.

Adjuvanty ovplyvňujúce prezentáciu antigénu môžu ovplyvniť komplexné imunitné procesy. Treg bunky môžu modulovať odpovede Th1 a Th2 [35]. Vhodná dávka WPCD môže podporiť dozrievanie DC u myší zvýšením hladín expresie CD80 a CD40 a zosilnením schopnosti prezentácie antigénu OVA v skorej imunitnej odpovedi. Experimentálne výsledky aktivácie DC a frekvencie Treg ukázali, že WPCD indukoval dozrievanie DC a znížil frekvenciu Treg v slezine u myší. Tieto výsledky dokázali, že WPCD zvýšilo účinnosť OVA vakcín zvýšením zacielenia buniek prezentujúcich antigén a podporou aktivácie špecifickej pre T-bunky.

Pri vývoji adjuvancií je ťažké selektívne vyvolať vhodnú imunitnú odpoveď proti zodpovedajúcej infekcii. Vhodné adjuvans by malo mať nízke vedľajšie účinky a toxicitu pre ľudí alebo zvieratá. Preto by sa mala zvážiť bezpečnosť WPCD vrátane okamžitých a dlhodobých vedľajších účinkov. V tejto štúdii sme skúmali akútnu toxicitu WPCD a negatívny účinok WPCD na rastový výkon myší počas 110 dní. Výsledky akútnej toxicity WPCD ukázali, že telesná hmotnosť, index týmusu alebo index sleziny nemali žiadny významný rozdiel. Hodnota LD50 WPCD bola viac ako 5000 mg na kg telesnej hmotnosti. Počas experimentálneho následného pozorovania myší sa nezistili žiadne vedľajšie účinky alebo abnormálne správanie u myší. Tieto výsledky ukázali, že WPCD je bezpečný.

Na záver, v tejto štúdii WPCD, surový polysacharid extrahovaný z C. deserticola zo Xinjiangu, vykazoval niektoré vlastnosti adjuvans. Napríklad WPCD zosilnil Th1 aj Th2 reakcie aktiváciou DC, zvýšením protilátkových reakcií a zlepšením produkcie cytokínov. Okrem toho sme skúmali mechanizmus účinnosti WPCD analýzou dozrievania a funkcie DC prostredníctvom dráhy TLR4 in vitro. U myší liečených iba WPCD sa nepozoroval žiadny zjavný vedľajší účinok. WPCD teda mala vyššiu imunostimulačnú aktivitu v bunkových a humorálnych imunitných odpovediach. Adjuvans sú zmesou niekoľkých zlúčenín. Zmes niekoľkých surových extraktov môže mať väčšie priaznivé účinky ako jeden rastlinný extrakt. Je potrebné systematicky skúmať WPCD extrakty, testovať ich účinnosť a bezpečnosť a objasňovať mechanizmy ich účinkov.

PRÍRODNÁ CISTANCHE TUBULOSA NA ZLEPŠENIE IMUNITY PHGS75% ECH 30% ACT 12%