In Silico analýza peptidu parazitoidného jedu Drosophila odhaľuje prevalenciu motívu klipu katión-polárny-katión v proteínoch uzla, časť 2

2.6. CPC klip je tiež prítomný v antimikrobiálnom peptide drosomycíne

Na rozdiel od LhKNOT obsahuje štruktúra drosomycínu iný záhyb s alfa-helixom a skrúteným trojvláknovým beta-listom, ktorý je stabilizovaný tromi disulfidovými mostíkmi [43]. Tento štrukturálny motív, nazývaný „motív stabilizovaný cysteínom“, sa nachádza aj v iných proteínoch na obranu hostiteľa, ako je antibakteriálny defenzín A hmyzu, toxíny škorpióna, rastlinné tioníny a antifungálne rastlinné defenzíny [43,44].

-helix je polypeptid s vysokou biologickou aktivitou, ktorý dokáže aktivovať ľudský imunitný systém a posilniť ľudskú imunitu, čím predchádza a lieči rôzne ochorenia. Štúdie ukázali, že -helix má účinok na zlepšenie imunitnej funkcie, môže výrazne zlepšiť fagocytárnu schopnosť makrofágov a aktivitu T buniek, zvýšiť odolnosť tela voči vonkajším patogénnym mikroorganizmom, znížiť citlivosť tela na nepriaznivé prostredie a podporiť zdravie.

Imunita je pre ľudské zdravie kľúčová. Môže nám pomôcť odolávať rôznym chorobám, udržiavať fyzickú kondíciu a zvyšovať odolnosť voči chorobám. Ľudia však žijú v prostredí plnom rôznych vystavení patogénom a znečisteniu životného prostredia a imunita je ľahko ovplyvnená. Preto je posilnenie imunity veľmi potrebné pre udržanie ľudského zdravia.

Ako prírodný aktívny peptid môže -helix nielen regulovať imunitný systém a zlepšovať imunitu, ale tiež zohráva dobrú úlohu pri prevencii kardiovaskulárnych chorôb a metabolických porúch, zlepšuje funkciu pečene, znižuje hladinu tukov v krvi a cukru v krvi a zlepšuje fyzickú silu - únavová schopnosť. Preto sa -helix široko používal v oblasti medicíny, zdravotníckych produktov a kozmetiky, dosiahol pozoruhodné účinky a bol vrelo vítaný.

Stručne povedané, -helix úzko súvisí s ľudskou imunitou, dokáže stimulovať ľudskú imunitu a zohráva dôležitú úlohu pri zabezpečovaní ľudského zdravia a dlhovekosti. V budúcom živote a práci by sme mali aktívne posilňovať imunitu, zlepšovať životné návyky, správne cvičenie a úpravu stravy, zvážiť použitie -helixu na zlepšenie imunity a aktívnejšie čeliť budúcim výzvam a príležitostiam. Je vidieť, že musíme zlepšiť imunitu. Cistanche môže výrazne zlepšiť imunitu, pretože polysacharidy v Cistanche môžu regulovať imunitnú odpoveď ľudského imunitného systému, zlepšiť stresovú schopnosť imunitných buniek a zvýšiť baktericídny účinok imunitných buniek.

Kliknite na doplnok cistanche deserticola

Vzhľadom na známu antimikrobiálnu funkciu Drosomycínu a jeho súvisiaceho „motívu stabilizovaného cysteínom“ [43,44] sme skúmali možnosť spoločného základu pre antimikrobiálnu aktivitu a zdieľané vzťahy medzi štruktúrou a funkciou s LhKNOT, aby sme lepšie pochopili potenciálny význam tohto motívu. v LhKNOT v kontexte obrany hostiteľa.

Napriek mierne odlišnému štruktúrnemu záhybu sa drosomycín prekrýva v rámci RMSD 2,2 Á LhKNOT aj pB1 (obrázok 5A). Keď bola predchádzajúca analýza CPC klipu rozšírená na Drosomycín, výsledky odhalili prítomnosť CPC klipového motívu aj v Drosomycíne. Motív klipu CPC v Drosomycíne (R6-S4-K38) spadá do odchýlky 2Á od parametrov motívu (obrázok 5B, doplnková tabuľka S5).

Okrem toho povrchová elektrostatika drosomycínu potvrdila predpokladanú tvorbu CPC klipu katiónovej väzbovej kapsy, ako sa pozorovalo aj pre LhKNOT a iné uzly (obrázok 5C, doplnková tabuľka S5).

Tieto výsledky naznačujú, že môže existovať podobnosť v spôsobe účinku Drosomycínu a LhKNOT a že biochémia vložená do tohto štruktúrneho motívu môže riadiť antimikrobiálnu funkciu v oboch peptidoch.

Obrázok 5. (A) Superpozícia LhKNOT (modrá), hojiaceho peptidu Pereskia bleo (hnedá; pB1; kaktus; PDB: 5XBD) a drosomycínu (zelená; drosomycín; mucha; PDB: 1 MYN). (B) Vzdialenosti merané v PyMOL medzi centrami hmotnosti zúčastnených zvyškov (sivé pseudoatómy) v interakcii drosomycín-heparín. Vzdialenosti spadajú do 2 Á rozsahov hodnôt motívu klipu CPC. (C) Povrchová elektrostatika drosomycínu (lietať; PDB: 1 MYN), ukazujúca pozitívne nabitý väzobný povrch vytvorený klipom CPC, kde je dokovaný heparín. Povrchové elektrostatické potenciály sú farebne odstupňované od -4 kT/e (červená) do plus 4 kT/e (modrá).

3. Diskusia a špekulácie

Biochemické funkcie proteínov sú uľahčené ich celkovými štruktúrami, ktoré sú údajne 3–10-krát lepšie konzervované ako ich primárne štruktúry [45]. V dôsledku toho zarovnania sekvencií často zaostávajú pri skúmaní funkčného potenciálu proteínov, ako sú uzly, kde rôzne primárne štruktúry môžu zakrývať zdieľané vzťahy medzi štruktúrou a funkciou.

Metódy in silico uľahčujú rozsiahlu analýzu potenciálnych korelácií medzi štruktúrou a funkciou pre takéto zaujímavé záhyby [46–50]. Naša podrobná analýza štruktúry LhKNOT a jej štrukturálnych homológov podporuje myšlienku, že tento parazitný proteín má charakteristické znaky knottínového peptidu s funkciami v obrane hostiteľa: (a) najbližšie zhody s LhKNOT sú antimikrobiálne peptidy; (b) Signatura LhKNOT Pfam ho opisuje ako "antifungálny peptid" s cysteínovým uzlom; a (c) je prítomný klip CPC.

Analýza uzlového peptidu hojiaceho rany pB1 z listového kaktusu Pereskia bleo spočiatku odhalila prítomnosť CPC klipu, konzervovaného štrukturálneho podpisu proteínov viažucich heparín [42]. Má imunitné a signalizačné funkcie pri hojení rán a rakovine a používa sa ako antikoagulant [51].

GAGs sú prítomné na povrchoch živočíšnych buniek a stávajú sa čoraz obľúbenejším cieľom štúdií od klinických po kozmetické [52]. CPC klipový motív proteínov viažucich heparín sa považuje za minimálny požadovaný motív pre afinitu viazania heparínu a je definovaný špecifickými priestorovými vzťahmi medzi tromi zvyškami, dvoma katiónovými (Arg/Lys) a jedným polárnym (Asn, Gln, Ser, Thr, Tyr).

Tento CPC klipový motív je definovaný vzdialenosťami medzi uhlíkmi príslušných zvyškov, ako aj vzdialenosťami medzi centrami hmotnosti zahrnutých zvyškov. Je známe, že proteíny viažuce heparín interagujú promiskuitne s inými negatívne nabitými substrátmi, najmä s povrchovými membránami mikróbov [41].

V dôsledku toho môžu proteíny viažuce heparín vykazovať antimikrobiálnu aktivitu v rôznej miere [53]. Zatiaľ čo presné mechanizmy tohto antimikrobiálneho potenciálu nie sú dobre definované, predpokladá sa, že klip CPC môže uľahčiť tieto interakcie proteín-mikrób [41]. Objavujú sa nové potenciálne úlohy väzby heparínu, ako napríklad v potenciálnych terapeutických zásahoch pre amyloidogenézu [54], takže pochopenie štrukturálnych determinantov CPC klipu v rôznych proteínoch môže byť kľúčom k vymedzeniu mechanizmu interakcie a jej narušenia.

Kľúč k možnému antimikrobiálnemu mechanizmu pre LhKNOT pochádza z nášho zistenia, že jeho inhibičný cysteínový uzol a uzly iných tu skúmaných uzlov majú klip CPC vlastný ich záhybom (doplnková tabuľka S5).

Bolo zaznamenané, že štrukturálne a biofyzikálne požiadavky na schopnosť proteínov viažucich heparín interagovať s heparínom sú nápadne podobné štrukturálnym vlastnostiam mnohých známych AMP [53]. Motív klipu CPC teda môže spĺňať kritériá pre obe tieto požiadavky [41].

Náš objav tohto klipového motívu CPC nielen v LhKNOT, ale aj v 75 ďalších súvisiacich alebo nesúvisiacich proteínoch knottínu (doplnková tabuľka S5) naznačuje, že tento motív klipu CPC môže byť vysoko konzervovaným znakom proteínov knottínu.

Zhodný výskyt klipového motívu CPC v štruktúre cysteínového uzla v rôznych proteínoch naznačuje, že samotný motív klipu CPC môže byť základom antimikrobiálnej funkcie. Pretože však tento štrukturálny motív je identifikovaný aj v útočných uzloch (doplnková tabuľka S5), môže tiež slúžiť všeobecnejšej úlohe prostredníctvom tohto všeobecnejšieho motívu interakcie klipov CPC.

Objav domnelého motívu klipu CPC v Drosomycíne je zaujímavý, pretože vrhá svetlo na možný mechanizmus účinku tohto antifungálneho peptidu a podporuje možnú antimikrobiálnu funkciu samotného motívu klipu CPC. Predchádzajúce štúdie ukázali dôležitosť zvyškov drosomycínu R6 a K38, ktoré sú súčasťou jeho klipového motívu CPC (R6-S4-K38), pre jeho antifungálny potenciál; zmeny týchto zvyškov znižujú antifungálnu aktivitu [55]. Naša štrukturálna analýza osieho LhKNOT a jeho podobnosti s Drosophila Drosomycínom ponúka možný pohľad na schopnosť L. heterotoma široko potlačiť dráhu TollNF-κB v D. melanogaster a napriek tomu uspieť na hostiteľoch s oslabenou imunitou.

Pri absencii funkčnej imunitnej dráhy Toll, a teda bez produkcie drosomycínu, môžu larvy Drosophila často podľahnúť oportúnnym patogénom [11,13,56]. Predpokladané antimikrobiálne aktivity LhKNOT môžu brániť hostiteľa pred oportúnnymi mikrobiálnymi patogénmi v larvách hostiteľa s oslabenou imunitou a vo vývoji kukel infikovaných osami. Alternatívne, podobne ako Drosomycín, by LhKNOT mohol indukovať apoptózu hemocytov [57]. EV L. heteroatom vstupujú do hemocytov po infekcii [58] a ich aktivity v rámci EV ohrozujú enkapsuláciu [19,21].

Ukázalo sa, že klip CPC sa promiskuitne spája s GAG [41], ktoré sú však všadeprítomné u hmyzu vrátane Drosophila [59]. Heparínsulfátové GAG v muchách slúžia ako receptory rastových faktorov a podieľajú sa na vytváraní a udržiavaní morfogénnych gradientov [60]. Ukázalo sa tiež, že klip CPC sa promiskuitne spája s lipopolysacharidmi (LPS) [41]. Bakteriálne LPS, ktoré sú hlavnými povrchovými zložkami gramnegatívnych baktérií, sú extrémne silnými stimulátormi vrodenej imunitnej odpovede u rôznych eukaryotických druhov vrátane hmyzu [61]. GAG v Drosophila tiež riadia väzbu proteínu C, determinantu virulencie streptokoka skupiny B [62].

Je teda možné, že klip CPC obsahujúci LhKNOT a Drosomycín (a možno aj iné mušie AMP, ako je Defensin [63]) môže modulovať imunitnú signalizáciu (a/alebo väzbu na proteíny virulencie patogénu), podobne ovplyvňujúc bakteriálny patogén/metazoán výsledok parazita. Predchádzajúce štúdie ukázali, že tri homológne uzly (Alo-1, 2, 3) z chrobáka harlekýna Acrocinus longimanus sú aktívne proti kvasinke Candida glabrata [30]. Okrem toho kandidacidný peptid tvoriaci póry, Psacotheasin, napáda Candida albicans [64]. Nakoniec, rastlinná patogénna hrdza, populárna Melampsora, produkuje peptid knottin ako kandidátsky efektor [65].

Naše zistenie, že dospelé parazitoidné osy Drosophila môžu vylučovať viacero domnelých uzlových peptidov, bolo neočakávané a zaujímavé. Zatiaľ čo ich funkcie nie sú známe, možná existencia rodiny génov knottin naznačuje určitú nadbytočnosť v ich funkciách, ktorá môže súvisieť s históriou života parazitov. Skúmanie štrukturálneho záhybu uzla v nesúvisiacich a ešte neobjavených uzlíkoch sa ukáže ako cenné. Naša práca poskytuje krátky zoznam zvyškov významných pre navrhovanú fyziologickú aktivitu pre výskum proteínov rodiny Knottin. Takéto informácie možno začleniť do racionálneho objavovania liekov a navrhovania infekčných chorôb a súvisiacich terapií.

4. Metódy

4.1. Sekvenčná analýza

Počiatočné skeny databázy neredundantných proteínových sekvencií (nr) NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein; prístupné 4. apríla 2018), databáza sekvencií Transcriptome Shotgun Assembly (TSA) (https: //www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/tsa; prístup 16. apríla 2018) [66] a Protein Data Bank (PDB; https://www.rcsb.org; prístup 5. júla 2018) [67] s kompletnou aminokyselinovou sekvenciou L. heteroatómového knottínového peptidu (GAJC01011813.1) s použitím NCBI BLAST (BLASTp; https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/ Blast. cgi; prístup k 16. apríla 2018) [68] boli použité na získanie súvisiacich proteínových sekvencií v iných organizmoch. Vzdialené homológy sa hľadali pomocou polohovo špecifických iteračných BLAST (PSI-BLAST; https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi; prístup 4. apríla 2022) [69] a Hidden Markov Models (HMMER; https://www.ebi.ac.uk/Tools/hmmer; prístupné 6. apríla 2022) [70,71]. BLAST vyhľadávania boli upravené na veľkosť slova 2 a maticu hodnotenia BLOSUM45, zatiaľ čo predvolené parametre boli použité pre HMMER.

Na identifikáciu homológov uzlov vo vybraných Leptopilina a Ganaspis spp. nie sú dostupné v proteínových databázach, použili sa cielené vyhľadávania pomocou preložených BLAST proti genómovým a transkriptomickým súborom údajov. Na identifikáciu ďalších L. heteroatómových uzlov, L. heteroatómového ženského brušného transkriptómu GAJC [72] a celotelových transkriptómov z Ground GHUQ (GenBank Accession: GHUP00000000; TSA: Leptopilina heteroatómový kmeň Lh14, transkriptómová brokovnica) a Space GHUP (GenBank Accession: GHUQ00000000; TSA: Leptopilina heteroatómový kmeň Lh14, transkriptómová brokovnica) boli prehľadané pomocou tblastn (prah e-hodnoty nastavený na 1, BLOSUM62, povolený filter nízkej zložitosti, filter pokrytia dopytu nastavený na 20 percent ) proti LhKNOT.

Na identifikáciu uzlíkov L. boulardi sa podobne hľadali nasledujúce transkriptómy: ženský brušný transkriptóm L. boulardi GAJA [72] a celotelové transkriptómy z Ground GITC (GenBank Accession: GITC00000000; TSA: Leptopilina boulardi kmeň Lb17, transkriptomová brokovnica), Space GISX (GenBank Access: GISX00000000; TSA: Leptopilina boulardi kmeň Lb17, transkriptomová brokovnica) a GGGI00000000 (ženské brucho/hlava) [73]. Okrem toho cielené vyhľadávanie Ganaspis spp. boli vykonané homológy. Pre G. hookeri, GAIW00000000 TSA: Ganaspis spp.

G1 dataset [74] sa prehľadal (tblastn, prah e-hodnoty nastavený na 1, BLOSUM45, filter nízkej zložitosti povolený, filter pokrytia dotazu nastavený na 20 percent) pomocou dotazu LhKNOT. Na preklad týchto TSA sekvencií bol použitý nástroj Expasy (web.expasy.org/translate/; prístupný 9. decembra 2022) [75]. Výsledné predpovedané peptidové sekvencie boli manuálne upravené na základe prítomnosti cysteínového motívu. Pre G. brasiliensis, založené na AUGUSTUS (http://bioinf.uni-greifswald.de/augustus; prístup 9. apríla 2020) [76] predpovede génov z čiastočne zostavenej genómovej sekvencie (Gen-Bank: GCA{{15} }.1) boli vyrobené pomocou tréningového modulu genómu Nasonia vitripenis.

Výsledné predpovedané proteíny boli vyhľadávané pomocou blastp (prahová hodnota e nastavená na 1, povolený filter nízkej zložitosti, filter pokrytia dotazu nastavený na 20 percent) proti LhKNOT. Zarovnania a vizualizácie boli vykonané pomocou EBI's Clustal Omega (https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo; prístupné 9. decembra 2022) [77] na potvrdenie prítomnosti motívu uzla a na ďalšie ošetrenie sekvencie.

Sada identifikovaných sekvencií bola porovnaná s LhKNOT, aby sa vytvorilo viacnásobné zarovnanie sekvencií pomocou T-COFFEE (https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/tcoffee; prístupné 9. decembra 2022) [78] a vizualizované pomocou ESPript3 (https://espript.ibcp.fr/ESPript/ESPript/index.php; prístup 9. decembra 2022) [79] na identifikáciu akýchkoľvek konzervovaných zvyškov a/alebo motívov v zoradených sekvenciách.

4.2. Analýza primárnej štruktúry LhKNOT

Sekvencia LhKNOT bola analyzovaná aj databázou na detekciu domén/motívov Conserved Domain Database (CDD; https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/cdd. shtml; prístupná 6. apríla 2018) a Pfam ( pfam.xfam.org; prístupné 6. apríla 2018) na identifikáciu akýchkoľvek domén alebo sekvenčných podpisov [80,81].

Sekvencia bola ďalej analyzovaná pomocou softvéru na predikciu sekvencie signálov SignalP{{0}}.0 (https://services.healthtech.dtu. dk/service.php?SignalP-5 .0; prístup 6. apríla 2018) [82] a Phobius (https://www. ebi.ac.uk/Tools/pfa/phobias; prístup 6. apríla 2018) [83] na identifikáciu polohy signálnej sekvencie a umožňujú presnejšiu charakterizáciu peptidu. Na ďalšiu analýzu sa použil zrelý peptid s 36 aminokyselinami (s predpovedanou signálnou sekvenciou, zvyšky 1–24, odstránené).

Sekundárna štruktúra peptidu bola predpovedaná pomocou metaservera Sympred (https://www.ibi.vu.nl/programs/sympredwww; prístup 6. apríla 2018) [84] a analyzovaná, aby sa potvrdila jej zhoda s očakávanou sekundárnou štruktúra pre uzlový záhyb: počiatočný alfa-helikálny segment (predpovedaná signálna sekvencia) nasledovaný tromi antiparalelnými beta vláknami.

4.3. Predikcia terciárnej štruktúry a hodnotenie LhKNOT a jeho homológov

Programy I-Tasser (https://zhanggroup.org/I-TASSER; prístup 16. apríla 2018) [85], Modelár (https://salilab.org/modeller; prístup 16. apríla 2018) [{{7 }}] a HHPred (https://toolkit.tuebingen.mpg.de/tools/hhpred; prístup 6. apríla 2018) [37] boli použité na modelovanie terciárnej štruktúry LhKNOT. Tri štruktúrne homológy s Alo-3 (PDB: 1Q3J) [30], omega-agatoxín-IVA (PDB: 1IVA) [28] a PAFP-S (PDB: 1DKC) [25]. boli identifikovaní ako najlepší kandidáti a použité ako šablóny v programoch vytvárania modelov.

Predpokladaný model pre LhKNOT vyhodnotila Verify3D (https://www.doe-mbi.ucla.edu/verify3d; prístup 18. apríla 2018) [39], VoroMQA (https://bioinformatics.lt/wtsam/voromqa; prístupné 18. apríla 2018) [40] a Prosaweb (https://prosa.services.came.sbg.ac.at/prosa.php; prístupné 18. apríla 2018) [38]. Hodnotenie malých peptidov pomocou štandardných hodnotiacich nástrojov môže mať obmedzenia.

Na interpretáciu hodnotiacich skóre našich modelov LhKNOT sa teda použili skóre z vyriešených terciárnych štruktúr NMR a peptidov odvodených z kryštalografie podobnej veľkosti a tvaru (PDB: 1Q3J, 1IVA a 1DKC). Najvyššie hodnotený model bol vytvorený pomocou HHPred [37], modelovacieho programu, ktorý využíva základný program na vytváranie modelov, Modeller [86] s použitím komparatívneho modelovania založeného na obmedzeniach. Okrem toho sa na vyhodnotenie terciárnej štruktúry modelu použil nástroj KNOTER3D databázy KNOTTIN (https://www.dsimb.inserm.fr/KNOTTIN/knoter3d.php; prístup 15. mája 2020) [36], čím sa potvrdilo, že LhKNOT prijal Knottin záhyb. Všetky identifikované homológy bez známych štruktúr boli modelované pomocou horného templátu identifikovaného v HHPred [37].

4.4. Identifikácia motívu klipu CPC

Superpozícia štrukturálneho modelu LhKNOT so známymi štruktúrami klipu CPC obsahujúceho knottin peptid z kaktusu Pereskia bleo (PDB: 5XBD) [26] pomocou programov Superpose (http://superpose.wishartlab.com; prístup 12. septembra 2{ {11}}18) [87] a MultiProt (http://bioinfo3d.cs.tau.ac.il/MultiProt; prístup 12. septembra 2018) [88] navrhli prítomnosť motívu klipu CPC viažuceho heparín. Na potvrdenie prítomnosti CPC klipu v LhKNOT, analýza dokovania pomocou programu ClusPro 2.0 (ktorý ponúka parametre špecifické pre heparín ako ligand; https://cluspro.org; prístupné 2. marca 2019) [89] a následná analýza predpovedaných scenárov dokovania vo vizualizačnom programe PyMOL (https://pymol.org; prístup 10. marca 2019) [90].

Všetky potenciálne scenáre dokovania sa analyzovali na identifikáciu zvyškov tvoriacich predpokladaný motív klipu CPC pomocou nasledujúcich krokov. Všetky polárne interakcie medzi LhKNOT a heparínom sa vizualizovali v PyMOL a zostavili sa zoznamy zúčastnených zvyškov. Predpovede, ktoré obsahovali potrebné interakcie katión-polárny-katión, sa potom ďalej skúmali z hľadiska dodržiavania parametra motívu klipu CPC meraním vzdialeností medzi alfa uhlíkmi zúčastnených zvyškov, ako aj vzdialeností medzi ťažiskom zúčastnených zvyškov. Na meranie vzdialeností medzi uhlíkmi zúčastnených zvyškov sa použil nástroj PyMOL "Measurements" Wizard.

Na vyhodnotenie vzdialeností medzi ťažiskami je k dispozícii používateľsky vytvorený skript dostupný na webovej stránke Pymolwiki (Henschel, https://pymolwiki.org/index.php/Center_of{2}}hmotnosti; prístupný na 15. marca 2019) sa použil na generovanie pseudoatómov vo vypočítanom ťažisku bočného reťazca. Na vykreslenie povrchovej elektrostatiky pre modelovaný LhKNOT bol použitý PyMOL's APBS Electrostatics Plugin [91]. Podobné kroky sa uskutočnili na identifikáciu klipového motívu CPC v každom zo zostávajúcich proteínov uzla v doplnkovej tabuľke S5.

4.5. Združenie LhKNOT s inými GAG

Na posúdenie, či by klip CPC uľahčil väzbu s ďalšími GAG, sa uskutočnilo ďalšie dokovanie s kyselinou hyalurónovou (PDB: 1HYA) a keratánsulfátom (PDB: 1KES). V prípade kyseliny hyalurónovej boli z priestoru obklopujúceho molekulu odstránené cudzie atómy (O, Na). Keratansulfátový model bol použitý tak, ako je. Ukotvenie bolo vykonané pomocou AutoDock (https://autodock.scripps.edu; prístup 7. apríla 2020) [92] a výsledky boli vizualizované v PyMOL. Výsledky sa potom vložili do PDBSum (http://www.ebi.ac.uk/thornton-srv/databases/pdbsum/Generate.html; prístupné 10. apríla 2020) [93], aby sa vygenerovali ligploty na potvrdenie väzby GAG-CPC klipu .

4.6. Analýza dokovania proteín-heparín pre mutovaný CPC klip v LhKNOT

Na preskúmanie dôležitosti klipu CPC vo väzbe heparínu sa vytvorili mutované modely LhKNOT pomocou nástroja na mutagenézu PyMOL, pričom sa zvyšky klipov CPC nahradili alanínom. Modely boli vytvárané po častiach, najprv sa nahradilo len R14, potom R1 a R14 a nakoniec R14, R1 a S3. Heparínové dokovanie všetkých modelov sa uskutočnilo pomocou ClusPro a analýza sa uskutočnila tak, ako je opísané vyššie.

4.7. Analýza dokovania proteín-heparín v štrukturálnych homologoch a drosomycíne

Na ďalšie vyhodnotenie prítomnosti klipového motívu CPC v rodine knottinových peptidov sa predchádzajúce metódy ďalej rozšírili na (a) štrukturálne homológy LhKNOT (PDB: 5XBD, 1Q3J, 1IVA a 1DKC) [25,26,28,30 ]; (b) Drosophila Drosomycin (PDB: 1MYN) [43], peptid so známou antifungálnou aktivitou; (c) modelované homológne knottin proteíny a (d) reprezentatívne knottin z rôznych kategórií v databáze KNOTTIN. Výsledky sa považovali za priľnuté k motívu, ak merania spadali do 3 Á parametrov CPC klipu, aby sa umožnila určitá flexibilita konformácií proteínovej slučky.

Doplnkové materiály:

Nasledujúce podporné informácie si môžete stiahnuť na https://www.mdpi.com/article/10.3390/pathogens12010143/s1. Tabuľka S1. Identifikované homológy LhKNOT pomocou rôznych prístupov založených na sekvencii. Tabuľka S2. Predpokladané homológy L. heterotoma LhKNOT. Sekvencie boli identifikované pomocou tblastn z troch súborov údajov transkriptómu Lh14 (pozri Metódy pre prístupové čísla).

Transkripty zoskupené tieňovanými bunkami kódujú identické knottin peptidy. Prístupové čísla prepisu zobrazené tučným písmom kódujú dva odlišné peptidy. Výsledky boli získané z opisnej tabuľky dostupnej z výsledkov výbuchu NCBI. Tabuľka S3. Predpokladané homológy uzlov L. boulardi LhKNOT. Sekvencie boli identifikované pomocou tblastn zo štyroch súborov transkriptómových údajov L. boulardi (pozri Metódy pre prístupové čísla). Identické knottin peptidy odvodené z rôznych transkriptov sú zoskupené podľa farby. Výsledky boli získané z opisnej tabuľky z výsledkov výbuchu NCBI. Tabuľka S4.

Predpokladané knottínové sekvencie z Ganaspis spp., homológne s LhKNOT. Sekvencie G. hookeri boli identifikované pomocou tblastn, zatiaľ čo sekvencie G. brasiliensis boli identifikované pomocou blastu. Výsledky pre G. hookeri a G. brasiliensis boli získané z opisnej tabuľky dostupnej z výsledkov vyhľadávania NCBI. Stínované sekvencie kódujú identické peptidy. Tabuľka S5.

Zoznam aminokyselinových zvyškov v CPC klipoch skúmaného známeho knottínu, modelovaných knottínových peptidov a drosomycínu. Sú znázornené merania vzdialenosti (Á) alfa-uhlíka a ťažiska bočného reťazca (prostredníctvom pseudoatómu) zúčastnených zvyškov identifikovaných CPC klipových motívov. Kľúč: plus Známe útočné uzly (toxíny), Φ in silico modely, * non-knottin fold, ±alternatívny predpokladaný peptid, zvýraznený zelenou a žltou farbou na ohraničenie peptidov vznikajúcich z rovnakého prepisu. Obrázok S1: (A) Hodnotiaci profil Prosa-web. Z-skóre modelu je znázornené ako čierna bodka na pozadí Z-skóre známych štruktúr z PDB (vľavo) a vizualizácia trojrozmerného modelu LhKNOT so zvyškami zafarbenými od modrej po červenú v poradí rastúceho zvyšková energia (vpravo). (B) Overte profil hodnotenia. Graf zobrazuje spriemerované a hrubé 1D-3D skóre pre LhKNOT a panel navrchu uvádza percento zvyškov, ktoré dosiahli priemerné skóre 0,2 alebo vyššie.

Prechádzajúci model má aspoň 80 percent svojich zvyškov skóre nad 0,2. (C) Hodnotiaci profil VoroMQA. Globálne skóre VoroMQA v kontexte vysokokvalitných skóre röntgenovej štruktúry (vľavo) a grafu lokálneho skóre a celkového skóre pre LhKNOT (vpravo). Obrázok S2. Ligplot zobrazujúci interakcie LhKNOT s keratánsulfátom (PDB: 1KES) zahŕňa zvyšky CPC klipov (R1-S3-R14). Zelené prerušované čiary znázorňujú interakcie vodíkových väzieb. Obrázok S3. Ligplot zobrazujúci interakcie LhKNOT s kyselinou hyalurónovou (PDB: 1HYA) zahŕňa zvyšky CPC klipov (R1-S3-R14).

Zelené prerušované čiary znázorňujú interakcie vodíkových väzieb. Obrázok S4. (A) Ligplot zobrazujúci interakcie divokého typu LhKNOT interagujúceho s heparínom prostredníctvom primárneho klipu CPC (R1-S3-R14). (B) Ligplot zobrazujúci interakcie mutanta R14A LhKNOT interagujúceho s heparínom prostredníctvom sekundárneho klipu CPC (R1-S3-R30). Zelené prerušované čiary znázorňujú interakcie vodíkových väzieb. Odkazy [94–111] sú citované v doplnkových materiáloch.

Príspevky autora:

Konceptualizácia, SS, SG a JA; metodika, JA a SS; validácia, SS, SG, JA, JL a LVC; formálna analýza, JA, JL a LVC; vyšetrovanie, JA, JL a LVC; zdroje, SS a SG; spracovanie údajov, JA, JL a LVC; písanie – príprava pôvodného návrhu, JA; písanie – recenzie a úpravy, SS, SG, JA, JL a LVC; vizualizácia, JA a JL; dozor, SS a SG; administrácia projektu, SS a SG Všetci autori si prečítali a súhlasili s publikovanou verziou rukopisu.

Financovanie:

Tento výskum nedostal žiadne finančné prostriedky.

Vyhlásenie inštitucionálnej revíznej rady:

Nepoužiteľné.

Vyhlásenie informovaného súhlasu:

Nepoužiteľné.

Vyhlásenie o dostupnosti údajov:

Údaje uvedené v tejto štúdii sú dostupné v článku a doplnkových materiáloch.

Poďakovanie:

Sme vďační Brianovi Weyovi za pomoc s predikciami génu G. brasiliensis a SA Tasnimovi Ahmedovi za pomoc pri formátovaní obrázkov.

Konflikt záujmov:

Autori nedeklarujú žiadny konflikt záujmov.

Referencie

1. Penczykowski, RM; Laine, AL; Koskella, B. Pochopenie ekológie a vývoja interakcií hostiteľ-parazit naprieč mierkami. Evol. Appl. 2015, 9, 37–52. [CrossRef] [PubMed]

2. Lambrechts, L.; Fellous, S.; Koella, JC Koevolučné interakcie medzi genotypmi hostiteľa a parazita. Trendy Parasitol. 2006, 22, 12–16. [CrossRef]

3. Quicke, DL parazitické osy; Springer: Dordrecht, Holandsko, 1997.

4. Poirié, M.; Colinet, D.; Gatti, J. Pohľady do funkcie a vývoja parazitoidných jedov osí. Curr. Opin. Insect Sci. 2014, 6, 52–60. [CrossRef] [PubMed]

5. Kraaijeveld, AR; Godfray, HCJ Evolúcia hostiteľskej rezistencie a parazitoidnej protirezistencie. Adv. Parasitol. 2009, 70, 257–280. [CrossRef] [PubMed]

6. Burke, GR; Strand, MR Systematická analýza arzenálu osieho parazitizmu. Mol. Ecol. 2014, 23, 890–901. [CrossRef] [PubMed]

7. Yan, Z.; Fang, Q.; Wang, L.; Liu, J.; Zhu, Y.; Wang, F.; Li, F.; Warren, JH; Ye, G. Vhľad do zloženia jedu a vývoja endoparazitoidnej osy kombináciou proteomických a transkriptomických analýz. Sci. Rep. 2016, 6, 19604. [CrossRef]

8. Lue, C.; Driskell, AC; Leips, J.; Buffington, ML Prehľad rodu Leptopilina (Hymenoptera, Cynipoidea, Figitidae, Eucoilinae) z východu Spojených štátov amerických, vrátane troch novo popísaných druhov. J. Hymenoptera. Res. 2016, 53, 35–76. [CrossRef]

9. Heavner, ME; Hudgins, AD; Rajwani, R.; Morales, J.; Govind, S. Využitie prirodzeného modelu parazitoidov Drosophila na integráciu imunity hmyzu s funkčnou genomikou. Curr. Opin. Insect Sci. 2014, 6, 61–67. [CrossRef]

10. Lee, MJ; Kalamarz, ME; Paddibhatla, I.; Small, C.; Rajwani, R.; Govind, S. Faktory a stratégie virulencie Leptopilina spp.: Selektívne reakcie u hostiteľov Drosophila. Adv. Parasitol. 2009, 70, 123–145. [CrossRef]

11. Buchon, N.; Silverman, N.; Cherry, S. Imunita v Drosophila melanogaster - Od mikrobiálneho rozpoznávania k fyziológii celého organizmu. Nat. Rev. Immunol. 2014, 14, 796–810. [CrossRef]

12. Govind, S. Vrodená imunita u Drosophila: Patogény a dráhy. Insect Sci. 2008, 15, 29–43. [CrossRef]

13. Kounatidis, I.; Ligoxygakis, P. Drosophila ako modelový systém na odhalenie vrstiev vrodenej imunity voči infekcii. Otvorte Biol. 2012, 2, 120075. [CrossRef]

14. Schlenke, TA; Morales, J.; Govind, S.; Clark, AG Kontrastné infekčné stratégie u všeobecných a špecializovaných osích parazitoidov Drosophila melanogaster. PLoS Pathog. 2007, 3, 1486–1501. [CrossRef]

15. Qiu, P.; Panvica, PC; Govind, S. Úloha dráhy Drosophila Toll/Cactus v larválnej hematopoéze. Vývoj 1998, 125, 1909–1920. [CrossRef]

For more information:1950477648nn@gmail.com