In Silico dizajn promiskuitnej chimérickej multiepitopovej vakcíny proti Mycobacterium tuberculosis, časť 2

 2.15. Prehľad návrhu multiepitopovej vakcíny

Obr. 1 zhrnul celkový koncept tohto návrhu multiepitopovej vakcíny. Stručne, analyzovali sme antigenicitu proteínov M. tuberculosis získaných z IEDB a vybrali sme osem antigénnych kandidátov na konštrukciu multiepitopovej vakcíny s ohľadom na ich funkčnú klasifikáciu a subcelulárnu lokalizáciu. Potom sme predpovedali antigénne epitopy týchto ôsmich proteínov a vybrali 15 CTL epitopov, 16 HTL epitopov a 10 B-bunkových epitopov, ktoré boli ďalej spojené s HBHA adjuvans a PADRE prostredníctvom vhodných linkerov. Ďalej sme predpovedali antigenicitu, alergénnosť, fyzikálno-chemické vlastnosti a imunogénny profil navrhnutej multiepitopovej vakcíny. Medzitým sme tiež predpovedali sekundárne a terciárne štruktúry vakcíny a analyzovali jej potenciálnu interakciu s imunitným receptorom TLR4.

Mycobacterium tuberculosis je bežný patogén, ktorý spôsobuje tuberkulózu. Proteín Mycobacterium tuberculosis je jednou z hlavných zložiek Mycobacterium tuberculosis, ktorá je veľmi dôležitá pre funkciu ľudského imunitného systému.

Proteín Mycobacterium tuberculosis môže aktivovať ľudský imunitný systém a posilniť obranyschopnosť organizmu. Keď je telo infikované Mycobacterium tuberculosis, ľudský imunitný systém vytvorí sériu imunitných odpovedí, vrátane aktivácie a proliferácie špecifických T buniek a B buniek. Tieto bunky môžu uvoľňovať rôzne imunitné faktory, ako je interferón, interleukín atď., ako aj protilátky, ktoré pomáhajú telu odolávať invázii Mycobacterium tuberculosis.

Okrem toho proteín Mycobacterium tuberculosis môže tiež regulovať rovnováhu imunitného systému a zabrániť poškodeniu imunity spôsobenému nadmernou aktiváciou imunitnej odpovede organizmu. Výskum a vývoj vakcín proti tuberkulóze sa v posledných rokoch zameriava najmä na aplikáciu proteínu Mycobacterium tuberculosis, ktorý dokáže očkovaním posilniť imunitu ľudského imunitného systému a účinne predchádzať vzniku a šíreniu tuberkulózy.

Preto je proteín Mycobacterium tuberculosis veľmi dôležitý pre účinok ľudskej imunity. Aktívnym posilňovaním imunitného systému, správnym pohybom a rozumnou výživou môžete lepšie predchádzať tuberkulóze a iným infekčným ochoreniam a udržiavať si dobré zdravie. Z tohto hľadiska si musíme zlepšiť imunitu. Cistanche môže výrazne zlepšiť imunitu, pretože polysacharidy v mäse dokážu regulovať imunitnú odpoveď ľudského imunitného systému, zlepšiť stresovú schopnosť imunitných buniek a posilniť imunitu imunitných buniek. Baktericídny účinok.

Kliknite na doplnok cistanche deserticola

3. Výsledky

3.1. Získavanie proteínov M. tuberculosis pre konštrukciu multiepitopovej vakcíny

Na vytvorenie multiepitopovej vakcíny proti TBC sme najprv analyzovali antigenicitu proteínov v M. tuberculosis H37Rv. Celkovo bolo z databázy IEDB získaných 492 proteínov s overenými imunologickými vlastnosťami, z ktorých 402 proteínov (81,70 percent) bolo predpovedaných ako antigénnych. Na funkčnú charakterizáciu týchto 492 proteínov bolo 353 obohatených v databáze DAVID, zatiaľ čo 139 nie. Lokalizačná analýza ukázala, že 97 z 353 obohatených proteínov bolo lokalizovaných v extracelulárnom kompartmente, v priestore mimo bunkového povrchu. Proteíny lokalizované v extracelulárnom kompartmente zahŕňajú proteíny vonkajšej membrány a secernované proteíny.

Spomedzi 97 proteínov je 49 sekrečných proteínov. Ďalšie obohatenie o 49 secernovaných proteínov odhalilo, že päť proteínov sa vylúčilo do extracelulárneho priestoru a päť bolo potrebných na patogenézu (experimentálne overené BioCyc) [48]. Navyše, keď bolo týchto desať proteínov zarovnaných s celkovými proteínmi H. sapiens, dva proteíny (Mpt83 a Mpt70) boli veľmi podobné proteínom H. sapiens. Preto zostávajúcich osem proteínov, ktoré nie sú podobné proteínom H. sapiens (tabuľka 1), sa považovalo za konečných kandidátov na konštrukciu multiepitopovej vakcíny.

3.2. Predikcia T-bunkových a B-bunkových epitopov kandidátskych proteínov

Pred predikciou epitopu boli identifikované signálne peptidy a odstránené z kandidátskych proteínov. NetMHCpan predpovedal celkovo 623 CTL epitopov z ôsmich kandidátskych proteínov so 135 silnými väzbami (16 z A1, 40 z A2, 22 z A3, 19 z A24 a 38 z B7 supertypov MHC triedy I){{12} }.1 server (obr. 2A, B). Spomedzi 135 silných väzbových látok bolo 36 antigénnych aj imunogénnych. Nakoniec sme vybrali 15 z 36 CTL epitopov podľa nasledujúcich kritérií: tri epitopy na supertyp a aspoň jeden na kandidátsky proteín (Poznámka: EsxA nemal žiadne silné spojivo, ktoré by bolo antigénne aj imunogénne) (tabuľka 2).

Okrem toho sme predpovedali ich HTL epitopy (epitopy MHC triedy II). {{0}}merné epitopy zo štyroch alel (HLA_DRB, HLA_DP, HLA_DQ a H-2-I) s percentuálne hodnotenie Menšie alebo rovné 2.{27}} boli považované za silné spojivá a boli zoradené od najnižšieho po najvyššie skóre. Alely HLA-DR mali najvyšší počet viazačov MHC II (2990), zatiaľ čo alely HLA-DP mali najmenej (601) (obr. 2C, D). Treba poznamenať, že imunitnej odpovedi pri granulomatóznych poruchách, ako je tuberkulóza, lepra a sarkoidóza, dominujú T-pomocné -1 (Th1) bunky produkujúce IFN [97]. Predchádzajúce správy navyše odhalili, že expresia Th1 cytokínov (IFN- a IL2) sa u pacientov s tuberkulózou znížila [98]. Preto sme na stimuláciu Th1 buniek predpovedali peptidy týchto proteínov indukujúce 15-mer IFN- -. Pomocou NetMHCIIpan 4.0 bolo predpovedaných celkom 534 epitopov s aktivitou indukujúcou IFN, z ktorých 315 epitopov je antigénnych. Z týchto 315 epitopov 103 vykazovalo silnú väzbovú aktivitu k aspoň jednej HLA alele.

Polymorfizmus v alelách HLA tiež vedie k alelickým variáciám, čo vedie k značne odlišným špecificitám viazania peptidov [55]. V dôsledku toho sme vybrali jeden epitop s najsilnejšou väzbovou aktivitou (najpromiskuitnejší epitop) z každého z ôsmich kandidátskych proteínov. Okrem toho sa zvyšných 95 epitopov zoradilo na základe väzbovej sily a potom sa vybralo ďalších osem epitopov, s maximálne dvoma epitopmi na kandidátsky proteín. Nakoniec sme vybrali 16 zo 103 HTL epitopov podľa nasledujúcich kritérií: aspoň jeden epitop a maximálne tri epitopy na kandidátsky proteín, najsilnejšia väzbová aktivita na kandidátsky proteín a väčšina antigénov a IFN-indukujúcich. Potom sme ich použili na konštrukciu tejto multiepitopovej vakcíny (tabuľka 2).

Pokiaľ ide o predikciu lineárneho B-bunkového epitopu, použili sa dva servery (BepiPred2.0 a ABCpred) a získalo sa 166 epitopov. Predpovedali sme antigenicitu piatich najlepších epitopov pre každý proteín a potom sme vybrali desať antigénnych epitopov (16-mer, aspoň jeden z každého kandidátskeho proteínu) (tabuľka 2).

3.3. Konštrukcia multiepitopovej vakcíny

Na konštrukciu multiepitopovej vakcíny sa epitopy HBHA, PADRE, 16 HTL (15-mer), 15 CTL a 10 lineárnych B-buniek (16-mer) spojili pomocou vhodných linkerov a spojili sa pomocou His × 6 tag (obr. 3). Adjuvans sú dôležitými zložkami vakcín, ktoré môžu posilniť vrodené a adaptívne imunitné reakcie [99]. Mnohé proteíny z M. tuberculosis majú adjuvantné vlastnosti a použili sa pri navrhovaní vakcín [17,27,87,100–105]. Jedným z najpoužívanejších je HBHA [100–105], čo je silný imunostimulant, ktorý indukuje dozrievanie dendritických buniek (DC) prostredníctvom spracovania TLR4 [105, 106]. Zistilo sa, že DC ošetrené HBHA aktivujú naivné T bunky, polarizujú CD4 plus a CD8 plus T bunky, aby vylučovali IFN- a indukovali cytotoxicitu sprostredkovanú T-bunkami [47].

V tejto štúdii sme umiestnili HBHA ako proteínové adjuvans na N-koniec, pretože je vhodné iniciovať syntézu vakcínového konštruktu z HBHA, prirodzene sa vyskytujúceho proteínu. HBHA bola predtým umiestnená na N-koniec niektorých multiepitopových vakcín ako adjuvans [105,107]. Okrem adjuvancií môže PADRE, ktorý je bezpečný pre ľudí, významne zvýšiť imunogenicitu vakcíny, pretože sa s vysokou afinitou viaže na viaceré myšie a ľudské alely MHC-II s vysokou afinitou na vyvolanie reakcií sprostredkovaných Th bunkami [47,62]. HBHA a PADRE boli spojené špirálovým PEAK linkerom, ktorý poskytuje tuhosť a zároveň oddeľuje dve proteínové zložky na zvýšenie účinnosti a zníženie interferencie. Ďalej, mostík soli Glu-Lys vytvorený v segmentoch stabilizoval linker.

Pretože PADRE môže zvýšiť aktivitu vakcinačných HTL epitopov [54], umiestnili sme 16 HTL epitopov za PADRE. Linker GPGPG sa použil na spojenie epitopov HTL medzi sebou navzájom a s PADRE, pretože uľahčuje progresiu imunitných buniek a prezentáciu epitopov [108, 109]. Okrem toho GPGPG indukuje imunitnú odpoveď HTL, ktorá môže narušiť spojovaciu imunogenicitu a obnoviť imunogenicitu jednotlivých epitopov po spracovaní [108].

Pre 15 CTL epitopov bol individuálny epitop spojený AAY linkerom, ktorý pomáha epitopu produkovať vhodné miesta na naviazanie sa na TAP transportér a zvyšuje prezentáciu epitopu [47]. Ďalej, celá podjednotka CTL epitopu bola spojená s upstream epitopmi HTL cez HEYGAEALERAG linker, ktorý má päť vhodných miest štiepenia (A7-L8, A5-E6, Y3-G4, R 10-A11 a L8-E9) nevyhnutné pre eukaryotické proteazomálne a lyzozomálne degradačné systémy. V eukaryotoch sú proteazómy a lyzozómy najdôležitejším proteolytickým mechanizmom, ktorý využíva systém ubikvitín-proteazóm (UPS) a autofágovú dráhu [110].

HEYGAEALERAG linker bol tiež použitý na spojenie CTL epitopovej podjednotky s 10 downstream lineárnymi B-bunkovými epitopmi spojenými pomocou KK linkerov. Podľa predchádzajúcich štúdií KK linker bráni indukcii protilátok do aminokyselinovej sekvencie vyplývajúcej z kombinácie dvoch peptidov, čím uľahčuje špecifické zobrazenie každého peptidu na protilátku [111]. Nakoniec sa na C-koniec posledného lineárneho B-bunkového epitopu pripojil Hisx6 tag na následnú purifikáciu a charakterizáciu vakcíny (obr. 3).

Finálny chimérický proteín pozostáva z 933 aminokyselinových zvyškov, počínajúc HBHA adjuvans, nasledovanými 41 epitopmi a končiacimi Hisx 6 tagom (obr. 3). Keďže tento chimérický proteín sa skladá z multiepitopových antigénov z ôsmich proteínov, nazvali sme ho MTBV8, multiepitopová vakcína proti TB odvodená z 8 kandidátskych proteínov.

3.4. Analýza antigenicity, alergénnosti a fyzikálno-chemických parametrov MTBV8

Predchádzajúce štúdie ukázali, že antigénnosť je potrebná pre ľudské vakcíny na vyvolanie humorálnych imunitných reakcií, čo vedie k vytvoreniu pamäťových buniek namierených proti epitopom infekčných agens [112]. Preto sme pomocou servera VaxiJen 2.0 predpovedali antigenicitu multiepitopovej vakcíny MTBV8 a získali sme antigenicitu 0,97, čo je výrazne vyššia hodnota ako prahová hodnota ({{7} }.4) [45,46], aby sa bakteriálny proteín považoval za antigénny. Je pozoruhodné, že MTBV8 bol antigénnejší ako všetky zložkové proteíny (obr. 4), čo naznačuje, že môže účinne stimulovať imunitné reakcie hostiteľa

Okrem toho sa uvádza, že mnohé mikrobiálne makromolekuly majú potenciál vyvolať hypersenzitívne reakcie u ľudí [113]. Aby sme analyzovali problém precitlivenosti MTBV8 a ôsmich základných proteínov, predpovedali sme ich alergénnosť pomocou servera AllerTOP 2.0. Dva z ôsmich zložkových proteínov (LprA a EspC) boli predpovedané ako alergény (tabuľka 1). Treba poznamenať, že hoci navrhnutá multiepitopová vakcína (MTBV8) obsahovala desať epitopov získaných z týchto dvoch proteínov, predpokladalo sa, že nebude alergická, čo naznačuje, že táto vakcína je bezpečná.

Aby sme ďalej charakterizovali MTBV8, analyzovali sme jeho fyzikálno-chemické vlastnosti prostredníctvom servera ExPASy ProtParam. Rekombinantný proteín má molekulovú hmotnosť 94,84 kDa a izoelektrický bod 8,91. Okrem toho sa proteín považoval za stabilný s vypočítaným indexom nestability (II) 26,44 (proteíny s indexom nestability > 40 sa považovali za nestabilné) [64]. Odhadovaný polčas in vitro je 30 h v cicavčích retikulocytoch, dlhší ako in vivo 20 h v kvasinkách a in vivo 10 h v E. coli. Okrem toho bol alifatický index MTBV8 71,91 a celková priemerná hodnota hydrofilnosti (GRAVY) bola - 0,32, čo naznačuje, že rekombinantný proteín bol hydrofilný. Napokon, proporcionálna hodnota rozpustnosti pre MTBV8 (0,54) bola vyššia ako priemer pre súbor údajov o populácii (0,45), čo naznačuje, že kandidátna vakcína bola rozpustnejšia ako polovica proteínov E. coli [114]. Vyššie uvedené výsledky naznačujú, že MTBV8 má dobré fyzikálne a chemické vlastnosti a je vhodný na použitie ako vakcína.

3.5. Imunogénny profil MTBV8

Na vyhodnotenie profilu imunogenicity MTBV8 sme analyzovali imunitné reakcie in silico prostredníctvom imunitného servera C-IMMSIM. Ako je znázornené na obr. 5A, titre IgM a IgG1 boli podstatne zvýšené po sekundárnej imunitnej stimulácii pomocou MTBV8. Okrem toho sa hladina aktívnych B-buniek zvýšila a zostala na vysokej úrovni po každej imunizácii (obr. 5B). Dokonca aj pre B bunky v plazme zostali B izotypy IgM a IgG1 po imunizácii vysoké (doplnkový obrázok 1A, B). Pokiaľ ide o účinok na T bunky, hladiny Th pamäťových buniek (y2) (doplnkový obrázok 1C) a aktívnych Th buniek (obrázok 5C) sa rýchlo zvýšili po primárnej imunizácii a boli významne posilnené po sekundárnej imunizácii. Regulačné T bunky (primárne aktívne bunky) boli stimulované po počiatočnej imunizácii a potom rýchlo klesali (doplnkový obrázok 1D). Je zaujímavé, že hladina aktívnych cytotoxických T (Tc) buniek sa rýchlo zvýšila po primárnej imunizácii, zostala vysoká pri druhej imunizácii a potom neustále klesala, zatiaľ čo pokojové Tc bunky vykazovali opačný trend k aktívnym Tc bunkám (obr. 5D). Na rozdiel od toho hladiny anergických (y2) Tc buniek (obr. 5D) a pamäťových Tc buniek (doplnkový obrázok 1E) zostali po imunizácii nezmenené. Okrem toho je potrebné poznamenať, že hladiny imunitných faktorov IFN- a IL-2 vylučovaných T bunkami, ktoré sú kritické pre imunitnú odpoveď proti M. tuberculosis [115], sa tiež významne zvýšili po imunizácii MTBV8 (obr. 5E).

Ďalej sme predpovedali účinok vakcinácie MTBV8 na populácie vrodených imunitných buniek (obr. 5F a doplnkový obrázok 1FH). Prítomnosť -2 buniek v DC a makrofágoch sa rýchlo zvýšila po prvej imunizácii, zatiaľ čo po druhej imunizácii sa pozoroval len malý nárast (obr. 5F a doplnkový obrázok 1G). Okrem toho v makrofágoch prvá imunizácia viedla k súčasnému zvýšeniu alebo zníženiu aktívnych a pokojových makrofágov. Niekoľko týždňov po druhej imunizácii aktívne makrofágy rýchlo klesali, zatiaľ čo pokojové makrofágy rýchlo pribúdali. (Doplnkový obrázok 1G). Je pozoruhodné, že prirodzené zabíjačské bunky a populácie aktívnych epitelových buniek vykazovali po imunizácii pomerne konštantný vzor. (Doplnkový obrázok 1F, H). Celkovo tieto predpovede naznačujú, že MTBV8 môže silne stimulovať vrodené aj adaptívne imunitné reakcie, čo z neho robí potenciálne účinného kandidáta na vakcínu.

3.6. Predpokladané sekundárne a terciárne štruktúry MTBV8

Aby sme lepšie charakterizovali MTBV8, predpovedali sme jeho sekundárne a terciárne štruktúry, po ktorých nasledovalo spresnenie jeho terciárnej štruktúry. Sekundárna štruktúra MTBV8 pozostávala zo 42,12 percent špirál, 11,79 percent vlákien a 46,09 percent zvitkov (doplnkový obrázok 2). Podľa predpovedí DISOPRED3 bolo 27,11 percenta aminokyselinových zvyškov neusporiadaných.

Terciárna štruktúra MTBV8 bola predpovedaná serverom I-TASSER a získalo sa 5 modelov s dobrým C-skóre. C-skóre je medzi -5.0 a 2.0 a je úmerné spoľahlivosti predpovede. Tieto modely boli podrobené analýze ProSA-web a model 4 bol vybraný na základe nasledujúcich charakteristík; C skóre=−3,8, Z skóre=−4,4. Analýza Ramachandranovho grafu tejto terciárnej štruktúry ukázala, že menej ako 70,0 percent zvyškov bolo vo výhodných oblastiach, preto je potrebné ďalšie spresnenie terciárnej štruktúry.

Terciárna štruktúra získaná I-TASSER bola vylepšená serverom ModRefiner, po ktorom nasledoval server GalaxyRefine na vytvorenie piatich modelov. Spomedzi piatich vylepšených modelov mal model 2 najlepšiu štruktúru pri zvažovaní nasledujúcich parametrov: test globálnej vzdialenosti vysoká presnosť (0.89), RMSD (0.58), MolProbity (2.31), kolízia skóre (14,8), slabé rotamérové ​​skóre ({{10}},80) a skóre Ramachandranovho grafu (86,5 percent) (obr. 6A). Ramachandranova analýza tejto štruktúry pomocou PROCHECK odhalila, že zo 753 neglycínových, neprolínových a neterminálnych zvyškov bolo 78,9 percent z nich v najpriaznivejšej oblasti [A, B, L], 17,3 percenta v dodatočne povolená oblasť [a, b, l, p] a 1,5 percenta vo všeobecne povolenej oblasti [~a,~b,~l,~p], pričom iba 2,4 percenta v nepovolenej oblasti (obr. 6B). Pri analýze Ramachandranovho grafu rafinovanej štruktúry pomocou Molprobity sme zistili, že 86,5 percenta aminokyselinových zvyškov sa nachádzalo v priaznivej oblasti, čo bolo rovnaké ako získané serverom GalaxyRefine (obr. 6C) . Okrem toho 98,0 percent zvyškov bolo v povolenej oblasti, zatiaľ čo 19 zvyškov bolo odľahlých (phi, psi) (obr. 6C). Hoci rafinovaný model má viac zvyškov vo obľúbenej oblasti v porovnaní s modelom generovaným I-TASSER, potrebuje ďalšiu validáciu.

Validácia modelu je kľúčovým krokom v procese vytvárania modelu, pretože dokáže identifikovať potenciálne chyby v predpovedaných 3D modeloch [116]. Na overenie vylepšeného modelu MTBV8 sa vykonali analýzy ProSA-web a ERRAT. ProSA-web analýza ukázala Z-skóre -5,76 pre MTBV8 (obr. 6D), čo bolo mierne mimo experimentálne stanoveného rozsahu skóre pre proteíny podobnej veľkosti. Analýza ERRAT však ukázala celkový faktor kvality 70,94 pre rafinované MTBV8. Keďže skóre ERRAT vyššie ako 50 predstavuje model dobrej kvality [117], skóre 70,94 naznačuje, že máme vysokú dôveru v modelovanú štruktúru pre následnú analýzu.

3.7. Molekulárne dokovanie MTBV8 s receptormi imunitných buniek

Silná afinita vakcín k receptorom imunitných buniek vytvára stabilnú imunitnú odpoveď [118]. Aby sme získali prehľad o potenciálnych interakciách medzi MTBV8 a receptormi imunitných buniek, uskutočnili sme molekulárne dokovanie medzi MTBV8 a imunitným receptorom TLR4 (obr. 7A a B). Predchádzajúce štúdie ukázali, že ligandy TLR4 môžu aktivovať DC, ktoré následne aktivujú naivné T bunky, účinne polarizujú T bunky (CD4 plus a CD8 plus bunky), aby vylučovali IFN- a indukovali cytotoxicitu sprostredkovanú T bunkami [106]. Tieto procesy by viedli k zvýšeniu zásoby efektorových pamäťových buniek [119]. Keďže interakcia TLR4 s antigénnymi peptidmi vedie k reakciám proti infekcii TBC, zamerali sme sa na interakcie medzi MTBV8 a TLR4 (obr. 7A). Výsledky molekulárneho dokovania z Firedocku ukázali, že najobľúbenejší rafinovaný model mal globálnu energiu − 40,28, príťažlivú van der Waalsovu energiu (aVdW) − 19.86, odpudzujúcu energiu (červená) 2,19, energiu atómového kontaktu 4,70 a príspevok vodíkovej väzby (HB) − 1,03 (obr. 7B). Okrem toho Prodigy predpovedal väzbovú energiu medzi TLR4 a MTBV8 - 8,6 kcal/mol. Vyššie uvedené výsledky naznačujú, že MTBV8 má silnú afinitu k TLR4, čo mu umožňuje vytvárať stabilnú imunitnú odpoveď.

3.8. Simulácia molekulárnej dynamiky

Na analýzu pohybu atómov vo vakcíne bola použitá molekulárna dynamická simulácia [120]. Deformovateľnosť hlavného reťazca odhaľuje rozsah, v akom sa môže molekula deformovať na každom zvyšku zložky. Oblasti s vysokou deformáciou indikovali polohu reťazového "závesu" ​​(obr. 7C) a experimentálny faktor B sa získal z príslušnej PDB databanky, pričom výpočet sa uskutočnil vynásobením mobility NMA 8pi^2 (obr. 7D ). Vlastná hodnota priradená každému normálnemu režimu je mierou tuhosti pohybu, ktorá priamo súvisí s deformačnou energiou celej konštrukcie. Vlastná hodnota je priamo úmerná ľahkosti deformácie (obr. 7E). Rozptyl každého normálneho režimu je nepriamo úmerný vlastnej hodnote. Jednotlivé odchýlky sú zafarbené hnedou, zatiaľ čo kumulatívne odchýlky sú zafarbené zelenou farbou) (obr. 7F). V kovariančnej matici existuje spojenie medzi pármi zvyškov a boli zobrazené korelované (červené), nekorelované (biele) a antikorelované (modré) pohyby (obr. 7G). Sieť elasticity predstavovala páry atómov spojených pružinami a každá bodka predstavovala pružinu medzi zodpovedajúcimi pármi atómov. Farba bodiek značila ich tuhosť; tmavšie sivé bodky znázorňujú tuhšie pružiny a naopak (obr. 7H). Simulácie molekulárnej dynamiky pomocou servera iMODS naznačili, že dokovací komplex medzi MTBV8 a TLR4 bol stabilný.

3.9. In silico optimalizácia a klonovanie MTBV8

Predpokladom jej aktivity je syntéza bielkovín [121]. V súlade s tým je zvýšená transkripčná a translačná účinnosť vakcíny potrebná na jej nadmernú expresiu v bunkách E. coli prostredníctvom samoreplikujúceho plazmidu pET28a(plus) [103]. Jeho optimalizácia bola dosiahnutá indexom adaptácie kodónov (CAI) 0,99 a obsahom GC (54,81 percent) medzi 30 percentami a 70 percentami, ktoré sa všeobecne považujú za priaznivé pre expresiu proteínu v hostiteľovi. Fragment DNA mtbv8 by sa mohol klonovať do vektora pET-28a(plus) medzi reštrikčné miesta Ncol a Xhol pomocou SnapGene na vytvorenie rekombinantného plazmidu pET-28a(plus)-mtbv8 (doplnkový obrázok .3).

4. Diskusia

4.1. Vznik multiepitopových vakcín proti tuberkulóze

Očkovanie je najspoľahlivejší spôsob boja proti tuberkulóznej infekcii. Po mnoho rokov vedci identifikovali množstvo sľubných kandidátov na vakcíny, ktoré by mohli nahradiť BCG, jedinú schválenú vakcínu proti TBC [8100,122–125]. Rekombinantným vakcínam proti TBC sa v poslednej dobe venuje zvýšená pozornosť. Niekoľko rekombinantných vakcín preukázalo svoju účinnosť v predklinických a klinických štúdiách, vrátane ID93/GLA-SE pozostávajúcej zo štyroch kandidátov na vakcínu Rv2608 (rodina PE/PPE), Rv1813 (exprimovaná pri strese/hypoxii), ESXV a ESXW, ktoré sú sľubné v predklinická štúdia na myšiach [122]. V klinických štúdiách bol GamTBvac získaný fúziou Ag85a a ESAT{10}}CFP10 úspešný v štúdiách fázy I [125], zatiaľ čo M72, pozostávajúci z dvoch kandidátov [Mtb39A (PPE18) a Mtb32A], priniesol významnú účinnosť vo fáze II pokusy [123].

Úspešné štúdie týchto rekombinantných vakcín naznačujú väčšiu účinnosť vakcín založených na epitopoch, ktoré jednoducho začleňujú imunologické vlastnosti rôznych kandidátskych proteínov do syntetického proteínu [124]. Je pozoruhodné, že niekoľko vakcín podjednotiek TBC bolo odvodených z veľkého počtu kandidátov na vakcínu a ukázali sa ako potenciálne atraktívni kandidáti v štúdiách na zvieracích modeloch [100]. Napríklad MP3RT, multiepitopový peptidový kandidát na TB vakcínu pozostávajúci zo šiestich imunogénnych HTL peptidov, indukoval významne vyššie hladiny IFN- a CD3 plus IFN- plus T lymfocytov a nižšie jednotky tvoriace kolónie (CFU) v pľúcach a slezine humanizovaných myší ako myši divokého typu [8]. V budúcnosti viedol výskum väčšej účinnosti týchto vakcín k obohateniu potenciálnych proteínových kandidátov.

Ďalej sa pri navrhovaní MTBV8 brali do úvahy aj proteíny vylučované M. tuberculosis (tabuľka 1), pretože sú dôležité pre patogenézu a virulenciu TBC [126]. Okrem toho niektoré vylučované proteíny vonkajších vrstiev buniek M. tuberculosis môžu slúžiť ako užitočné antigény. Napríklad EsxA a EsxB boli purifikované z kapsuly M. tuberculosis [127] a retencia EsxA v kapsule sa podieľa na cytotoxicite [128]. Okrem toho je EsxA potrebný na integritu bakteriálnej bunkovej steny [129]. Celkovo majú vylučované proteíny dostatočne exponované povrchy, takže sú cieľmi hostiteľských imunitných reakcií [130, 131].

4.2. Potenciálna stimulácia vrodeného imunitného systému MTBV8

Skríning na epitop v kandidátskych proteínoch zahŕňa aktiváciu vrodeného imunitného systému, po ktorej nasleduje rozpoznanie antigénu lymfocytmi, pretože oba faktory sú potrebné na následnú aktiváciu adaptívneho imunitného systému [50]. Pre vrodenú odpoveď je dôležitá tvorba stabilného komplexu medzi MTBV8 (pomocou TLR4 stimulátora HBHA ako adjuvans) a TLR4 DC (obr. 5F), pretože TLR4 ligandy môžu aktivovať DC a aktivované DC môžu naopak aktivovať naivné T bunky, účinne polarizujú CD4 plus a CD8 plus T bunky, aby vylučovali IFN- a indukovali cytotoxicitu sprostredkovanú T bunkami [106] a následne zvýšili zásobu efektorových pamäťových buniek [119].

Tento komplex pravdepodobne prispel k zvýšeniu populácie pamäťových buniek (y2) v B lymfocytoch (doplnkový obrázok 1A) a Th lymfocytoch (doplnkový obrázok 1C) v porovnaní s nepamäťovými bunkami. Imunitná stimulácia pomocou MTBV8 je porovnateľná so stimuláciou získanou inými multiepitopovými vakcínami proti TBC [33,37,39] a iným ochoreniam [27,62,107,124,132]. To naznačovalo konzistentnosť mechanizmu multiepitopovej vakcíny.

4.3. Potenciálna stimulácia adaptívneho imunitného systému pomocou MTBV8

B a T lymfocyty sú primárne efektorové bunky, ktoré koordinujú adaptívne imunitné reakcie prostredníctvom humorálnej alebo bunkami sprostredkovanej imunity rozpoznávaním častí inváznych patogénov, označovaných ako antigény [50]. Na vyvolanie humorálnej adaptívnej imunitnej odpovede sme začlenili B-bunkové epitopy s vysokým skóre (tabuľka 2) na rozpoznávanie a deštrukciu protilátkami exprimovanými a vylučovanými B lymfocytmi [50,133]. Stimulácia aktívnych B lymfocytov vakcínou (obr. 5B), väčšinou B buniek vylučujúcich IgM a IgG1- (doplnkový obrázok 1A), môže viesť k nadmernej sekrécii IgM a IgG1 (obr. 5A).

Vysoká antigenicita vakcíny (obr. 4) môže mať dôležité dôsledky na zosilnenie protilátkových odpovedí (obr. 5A). Bunkami sprostredkované imunitné reakcie sú skutočne vysoko závislé od schopnosti T buniek rozpoznať antigény [134]. Aby sme to dosiahli, vybrali sme silné antigénne a silne MHC-viažuce CTL a HTL epitopy (tabuľka 2), ktoré zvýšili stabilitu komplexu peptid: MHC (pMHC), čo je kľúčový faktor kontrolujúci imunogenicitu MHC peptidu [135] a hrá úlohu v aktivácia CD8 plus a CD4 plus T buniek DC, čo vedie k reakciám T lymfocytov (obr. 5C, doplnkový obrázok 1C) [136].

Začlenenie vhodných linkerov a syntetických oligopeptidov (PADRE a HEYGAEALERAG) a presné umiestnenie každej zložky by mohlo uľahčiť spracovanie a prezentáciu epitopu (obr. 3). Kvôli variácii alel medzi ľuďmi sme vybrali CTL epitopy na základe rozpoznávania alel MHC-I hlavných ľudských rás Doplnková tabuľka 1 (tabuľka 2) a promiskuitné HTL epitopy sa vybrali po skríningu na IFN-indukujúce vlastnosti a antigenicitu.

4.4. Vyhliadky rozvoja MTBV8

Tento dizajn vakcíny in silico je relevantným ukazovateľom vo fázach skríningu z hľadiska syntézy a účinnosti kandidátskych vakcín. Na účely syntézy naše predpovede odhalili, že sa môže syntetizovať v systéme E. coli, avšak ak by systémy založené na E. coli predstavovali ťažkosti, mohli by sa zvážiť aj iné systémy, ako sú bunky hmyzu a cicavcov. Mokré laboratórne overenie je ďalšou fázou potvrdenia kandidátov na vakcínu po štúdiách in silico. Táto metóda bola skutočne účinne použitá v niektorých kandidátoch na vakcíny, ktoré boli tiež najprv navrhnuté in silico a neskôr sa ukázali ako účinné v experimentálnej fáze [137].

5. Záver

Kľúčovou podporou cieľa udržateľného rozvoja WHO pre úplnú eradikáciu TBC je prístup k účinnej vakcíne na prevenciu infekcie M. tuberculosis. Predchádzajúce štúdie ukázali, že chimérické multiepitopové vakcíny môžu využívať imunitné/antigénne vlastnosti určitých proteínov na zvýšenie imunitnej účinnosti. V tejto štúdii sme použili prístup in silico na navrhnutie chimérickej vakcíny (MTBV8) integráciou 41 promiskuitných epitopov odvodených z ôsmich antigénnych proteínov vylučovaných M. tuberculosis H37Rv. Predpokladalo sa, že MTBV8 je stabilný, rozpustný, bezpečný, vysoko antigénny a imunogénny.

Imunoinformatická analýza ukázala, že MTBV8 vykazoval dobrú afinitu k hlavnému receptoru imunitných buniek TLR4. Dôležité je, že vakcinačná stimulácia MTBV8 by mohla významne zvýšiť hladiny B buniek, T buniek a populácie vrodených imunitných buniek a stimulovať produkciu imunoglobulínov (IgG1, IgM atď.), ako aj imunitných faktorov (IFN-, IL{{6 }}, atď). Celkovo vzaté, multiepitopová vakcína MTBV8 je relevantným ukazovateľom vo fáze navrhovania vakcín proti TBC a môže sa stať potenciálnym základným kameňom pri realizácii „stratégie konca TB“.

Kreditné vyhlásenie o autorskom príspevku

Binda T. Andongma: Konceptualizácia, metodológia, softvér, písanie – pôvodný návrh. Yazheng Huang: Správa údajov, softvér. Fang Chen: Softvér, vizualizácia. Qing Tang: Spracovanie údajov, formálna analýza. Min Yang: Softvér, vizualizácia. Shan-Ho Chou: Písanie – recenzia a úprava. Xinfeng Li: Konceptualizácia, metodológia, softvér, akvizícia financovania. Jin He: supervízia, písanie – kontrola a editácia, získavanie financií.

Vyhlásenie o konkurenčnom záujme

Autori vyhlasujú, že nemajú žiadne známe konkurenčné finančné záujmy alebo osobné vzťahy, ktoré by mohli ovplyvniť prácu uvádzanú v tomto článku.

Poďakovanie

Túto prácu podporila Národná nadácia pre prírodné vedy Číny (32200026, 31900057), otvorené fondy Štátneho kľúčového laboratória poľnohospodárskej mikrobiológie (AMLKF202108) a Čínska nadácia pre postdoktorandské vedy (2019M662654).

Príloha A. Podporné informácie

Doplňujúce údaje súvisiace s týmto článkom nájdete v online verzii na adrese doi:10.1016/j.csbj.2023.01.019.

Referencie

[1] Boineau R, Domanski M, Troutman C, Anderson J, Johnson G, Mcnulty SE, Clappchanning N, Davidson-ray LD, Fraulo ES, Fishbein DP a kol. Amiodarón alebo implantovateľný kardioverter-defibrilátor na kongestívne zlyhanie srdca. New Engl J Med 2005;352(3):225–37.

[2] Khoshnood S, Heidary M, Haeili M, Drancourt M, Darban-sarokhalil D, Nasiri MJ, Lohrasbi V. Noví kandidáti vakcíny proti Mycobacterium tuberculosis. Int J Biol Macromol 2018;120(Pt A):180–8.

[3] Kyu HH, Maddison ER, Henry NJ, Ledesma JR, Wiens KE, Reiner R a kol. Globálna, regionálna a národná záťaž tuberkulózou, 1990-2016: vyplýva zo štúdie globálnej záťaže chorobami, zraneniami a rizikovými faktormi z roku 2016. Lancet Infect Dis 2018;18(12):1329–49.

[4] Svetová zdravotnícka organizácia (2022). Globálna správa o tuberkulóze. 〈https://www. SZO. int/publications/i/item/9789240061729〉.

[5] Mirzayev F, Viney K, Linh NN, Gonzalez-Angulo L, Gegia M, Jaramillo E, Zignol M, Kasaeva T. Odporúčania Svetovej zdravotníckej organizácie o liečbe tuberkulózy rezistentnej voči liekom, aktualizácia z roku 2020. Eur Respir J 2021;57(6):2003300.

[6] Ahmad Khan F, Fox G, Menzies D. Tuberkulóza odolná voči liekom. New York: Handbook of Antimicrobial Resistance Springer; 2017. s. 263 – 86.

[7] Mitchison D, Davies G. Chemoterapia tuberkulózy: minulosť, prítomnosť a budúcnosť. Int J Tube Lung Dis 2012;16(6):724–32.

[8] Gong W, Liang Y, Mi J, Jia Z, Xue Y, Wang J, Wang L, Zhou Y, Sun S, Wu X. Vakcína založená na peptidoch MP3RT vyvolala ochrannú imunitu proti infekcii Mycobacterium tuberculosis v humanizovanom myšom modeli . Front Immunol 2021;12:1–19.

[9] Lange C, Aaby P, Behr MA, Donald PR, Kaufmann SHE, Netea MG, Mandalakas AM. 100 rokov Mycobacterium bovis bacille Calmette-Guérin. Lancet Infect Dis 2022;22(1):e2–12.

[10] Glaziou P, Floyd K, Raviglione MC. Globálna epidemiológia tuberkulózy. Semin Respir Crit Care Med 2018;39(3):271–85.

[11] Ernst JD. Mechanizmy imunitného úniku M. tuberculosis ako výzvy pre návrh vakcíny proti TBC. Bunkový hostiteľský mikrób 2018;24(1):34–42.

[12] Li X, Chen F, Liu X, Xiao J, Andongma BT, Tang Q, Cao X, Chou SH, Galperin MY, He J. Clp proteáza a antisense RNA spoločne regulujú globálny regulátor CarD na sprostredkovanie odpovede mykobakteriálneho hladovania. eLife 2022;11:1–22.

[13] Liu CH, Liu H, Ge B. Vrodená imunita pri tuberkulóze: obrana hostiteľa verzus vyhýbanie sa patogénom. Cell Mol Immunol 2017;14(12):963–75.

[14] Elvang T, Christensen JP, Billeskov R, Hoang TTKT, Holst P, Thomsen AR, Andersen P, Dietrich J. CD4 a CD8 T bunkové reakcie na M. tuberculosis Ag85B-TB10.4 podporované adjuvovanou podjednotkou, adenovektorom alebo heterológne prime-boost očkovanie. PLoS ONE 2009;4(4):e5139.

[15] Rossjohn J, Gras S, Miles JJ, Turner SJ, Godfrey DI, McCluskey J. Rozpoznanie molekúl prezentujúcich antigén T bunkovým receptorom. Annu Rev Immunol 2015;33:169–200.

For more information:1950477648nn@gmail.com