Interferencia fenyletanoidových glykozidov z Cistanche Tubulosa s testom MTT

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com

Yu-Jie Wang, Si-Min Zhou, Gang Xu a Yu-Qi Gao

Abstrakt:

MTT test ako skríningová metóda sa široko používa na meranie životaschopnosti a proliferácie buniek. Treba však poznamenať, že test MTT nemusí presne odrážať účinokCistanche tubulosaetanolový extrakt na životaschopnosti buniek EA.hy926. Aby sa preskúmali a identifikovali zložky zodpovedné za protichodné pozorovania MTT testu, echinakozid a akteozid, boli izolované dva hlavné fenyletanoidové glykozidy z etanolového extraktu C. tubulosa. Údaje odvodené z testov CCK-8, Hoechst 33342 a anexín V-FITC/PI naznačujú, že kofeoylová skupina prítomná v oboch izolovaných zlúčeninách bola zodpovedná za protichodné výsledky testu MTT. Tieto údaje zdôrazňujú potrebu použitia množstva rôznych metód na určenie účinku liečivých látok na životaschopnosť buniek, aby sa predišlo vytváraniu zavádzajúcich výsledkov.

Kľúčové slová: test MTT;fenyletanoidový glykozid; kyselina kávová; životaschopnosť buniek; rušenie

Úvod

Parazitická rastlinaCistanche tubulosa(Schrenk) R. Wight (čeľaď Orobanchaceae) je široko rozšírený v severoafrických, arabských a ázijských krajinách [1]. Pramení zCistanche tubulosaaCistanche deserticolasú dôležité v tradičnej čínskej medicíne, pretože sa používajú na liečbu impotencie, sterility, bedrového kĺbu a zápchy v dôsledku zotrvačnosti hrubého čreva [2]. Okrem toho sa preukázalo, že etanolový extrakt z Cistanche tubulosa má významný ochranný účinok proti hypoxii mozgu u myší [3].

Endotelové bunky hrajú kľúčovú úlohu v patogenéze hypoxickej pľúcnej hypertenzie. Endotelová bunková línia EA.hy926 je značne podobná primárnym endotelovým bunkám. Počas našej vlastnej štúdie antihypoxického účinkuCistanche tubulosaetanolického extraktu na endotelovej bunke EA.hy926 sme si všimli, že 3-(4,5-dimetyltiazol-2-yl)-2,5-difenyltetrazóliumbromid (MTT) test, ktorý sa bežne používa na hodnotenie životaschopnosti buniek v štúdiách cytotoxicity a cytostatickej aktivity, priniesol protichodné výsledky tým, že ukázal zvýšenú životaschopnosť buniek EA.hy926 po liečbe.

Presné posúdenie bunkovej životaschopnosti je nevyhnutné na identifikáciu potenciálnych cytotoxických alebo cytoprotektívnych účinkov liečiva. Preto sme skúmali, ktoré zložky prítomné v etanolovom extrakte C. tubulosa môžu byť zodpovedné za protichodné výsledky pozorované pri teste MTT. Z etanolového extraktu C. tubulosa sme izolovali dva hlavné fenyletanoidové glykozidy (PhGs), echinakozid (ďalej zlúčenina 1) a akteozid (ďalej zlúčenina 2), a určili sme ich účinok na životaschopnosť buniek EA.hy926 pomocou rôznych metód. Okrem toho, aby sme ďalej objasnili, ktorý substituent zlúčenín 1 a 2 môže byť zodpovedný za protichodné výsledky, testovali sme ich aglykóny, kyselinu kávovú (ďalej len zlúčenina 3) a 3, 4-dihydroxylfenyletanol (ďalej len zlúčenina 4), na životaschopnosť buniek EA.hy926 použitím rovnakých metód.

Výsledky a diskusia

Identifikácia zlúčenín

Štruktúry dvoch zlúčenín izolovaných z etanolového extraktu C. tubulosa sa identifikovali analýzami nukleárnej magnetickej rezonancie (NMR) a hmotnostnej spektrometrie (MS) a sú znázornené na obrázku 1. Zlúčenina 1 bola identifikovaná ako echinakozid porovnaním s predtým uvedenou NMR (tabuľka 1) a MS (m/z 785 [M-H]-) dáta [4]. NMR spektrá zlúčeniny 2 boli vysoko podobné spektrám zlúčeniny 1, s výnimkou neprítomnosti -D-glukopyranozylovej skupiny (tabuľka 1). Zlúčenina 2 (m/z 623 [M-H]-) bola identifikovaná ako akteozid [5]. Dôležité je, že obe zlúčeniny majú rovnaký aglykón, ktorý zahŕňa kyselinu kávovú (zlúčeninu 3) a 3,4-dihydroxylfenyletanol (zlúčeninu 4).

Testy bunkovej životaschopnosti

Na analýzu účinku zlúčenín 1–4 na životaschopnosť buniek EA.hy926 sa použili testy MTT a CCK{{0}}. Test MTT ukázal, že životaschopnosť buniek EA.hy926 sa výrazne zvýšila po ošetrení 25 a 50 μM zlúčeniny 1, 2 alebo 3 (166,3 percenta a 174,1 percenta pre zlúčeninu 1, 205,8 percenta a 224,3 percenta pre zlúčeninu 2 a 164,8 percenta a 189,6 percenta pre zlúčeninu 3, v tomto poradí; p < 0,05),="" v="" porovnaní="" s="" kontrolnými="" bunkami="" (obrázok="" 2a).="" morfologická="" kontrola="" buniek="" ďalej="" určila,="" že="" ošetrenie="" 50="" μm="" zlúčeninou="" 1,="" 2="" alebo="" 3="" zvýšilo="" tvorbu="" purpurových="" kryštálov="" formazanu,="" ktoré="" sa="" považujú="" za="" priamu="" indikáciu="" podielu="" živých="" buniek="" (obrázok="" 3).="" naopak,="" test="" cck-8="" naznačil,="" že="" životaschopnosť="" buniek="" sa="" výrazne="" znížila="" po="" ošetrení="" 12,5,="" 25="" a="" 50="" μm="" zlúčeninou="" 1,="" 2="" alebo="" 3="" (75,5="" percenta,="" 45,1="" percenta="" a="" 43,7="" percenta="" pre="" zlúčeninu="" 1,="" 85,5="" percenta,="" 51,8="" percenta="" a="" 34,3="" percenta="" pre="" zlúčeninu="" 2="" a="" 64,5="" percenta,="" 48,2="" percenta="" a="" 36,4="" percenta="" pre="" zlúčeninu="" 3,="" v="" tomto="" poradí;="" p="">< 0,05),="" v="" porovnaní="" s="" kontrolnými="" bunkami="" (obrázok="" 2b).="" zlúčenina="" 4="" neovplyvnila="" životaschopnosť="" buniek="" v="" teste="" mtt="" ani="" cck-8.="" nesúlad="" medzi="" výsledkami="" získanými="" pri="" týchto="" dvoch="" testoch="" naznačuje,="" že="" jeden="" z="" dvoch="" testov="" nemusí="" presne="" odrážať="" účinky="" zlúčenín="" 1="" a="" 2="" na="" životaschopnosť="" buniek="">

Hodnotenie apoptózy farbením Hoechst

Hoechst 33342 je farbivo DNA prepúšťajúce bunky, ktoré je excitované ultrafialovým svetlom a vyžaruje modrú fluorescenciu pri 460 až 490 nm. Kondenzovaný chromatín apoptotických buniek sa farbí jasnejšie ako chromatín normálnych buniek [6]. Zatiaľ čo kontrolné bunky vykazovali rovnomerne dispergovaný chromatín, normálne organely a neporušené bunkové membrány, bunky inkubované s 50 uM zlúčeninami 1, 2 alebo 3 počas 48 hodín vykazovali typické farbenie apoptotických buniek (obrázok 4A). Naopak, vystavenie buniek 50 uM zlúčeniny 4 nezvýšilo počet apoptotických jadier v porovnaní s kontrolnou liečbou.

Prietoková cytometrická analýza apoptotických buniek

Test dvojitého farbenia anexínu V-FITC/PI identifikuje apoptotické bunky vysokoafinitnou väzbou anexínu V-FITC na fosfatidylserín, ktorý je externalizovaný v bunkách podstupujúcich apoptózu [7]. V tomto teste sa životaschopné bunky neviažu ani na anexín V, ani na PI, a preto nie sú zafarbené (dolný ľavý kvadrant), skoré apoptotické bunky sú zafarbené na zeleno väzbou anexínu V-FITC (dolný pravý kvadrant) a neskoré apoptotické bunky sú zafarbené na zeleno a načerveno väzbou anexínu V-FITC na fosfatidylserín a PI na nekrotické bunky (pravý horný kvadrant). Ako je znázornené na obrázku 4B, bunky inkubované s 50 uM zlúčeninami 1, 2 alebo 3 počas 48 hodín sa percento apoptotických buniek zvýšilo z 3,74 percenta (kontrolné bunky) na 10,32 percenta, 12,95 percenta a 11,30 percenta. V porovnaní s kontrolnými bunkami zlúčenina 4 nezvýšila percento apoptotických buniek EA.hy926.

V súlade s výsledkami získanými pomocou testu CCK{0}} a farbením Hoechst 33342 test prietokovej cytometrie ukázal, že zlúčeniny 1, 2 a 3 indukovali apoptózu v bunkách EA.hy926. Celkovo tieto pozorovania naznačujú, že zvýšenie životaschopnosti buniek EA.hy926 pozorované pomocou testu MTT po liečbe zlúčeninami 1–3 predstavovalo falošne pozitívny výsledok.

Diskusia

V roku 1983 Mosmann vyvinul kolorimetrický test MTT na mikrodoštičkách na meranie bunkovej proliferácie a cytotoxicity [8]. Tento jednoduchý test a jeho modifikácie sa teraz vo veľkej miere používajú v laboratóriách bunkovej biológie po celom svete. Frakcionačné štúdie v cicavčích bunkách ukázali, že redukovaný pyridínový nukleotidový kofaktor, NADH, je zodpovedný za väčšinu redukcie MTT. Toto bolo podporené štúdiami s použitím celých buniek [9]. Zníženie MTT je preto spojené s metabolicky aktívnymi bunkami a nie je spojené len s mitochondriálnym dýchaním, ale aj s cytoplazmou a nemitochondriálnymi membránami vrátane kompartmentu endozóm/lyzozóm a plazmatickej membrány [10]. Čistý kladný náboj na molekule MTT je primárnym faktorom pre jej bunkovú absorpciu prostredníctvom potenciálu plazmatickej membrány.

Je pozoruhodné, že test MTT nemusí občas presne odrážať skutočný účinok, ktorý má testovaná zlúčenina na špecifické bunky. Chemické štruktúry alebo skupiny, ktoré môžu spôsobiť konfliktné výsledky v teste MTT, však neboli identifikované. Nedávne štúdie ukázali, že test MTT by mohol podhodnotiť antiproliferatívny účinok (-)-epigalokatechín-3-galátu, najhojnejšieho polyfenolu v zelenom čaji [11]. V štúdiách využívajúcich MTT test na detekciu chemosenzitivity nádoru, protirakovinové chemoterapeutiká, ako je epirubicín, paklitaxel, docetaxel a imatinib mezylát (Gleevec), preukázali zvýšenú životaschopnosť buniek [12,13]. Okrem toho množstvo štúdií uvádza, že určité rastlinné extrakty a redox-aktívne polyfenoly by mohli interferovať s testom MTT, pretože priamo redukujú tetrazóliovú soľ MTT v neprítomnosti buniek [14].

Potreba solubilizovať kryštály MTT formazanu pred spektrofotometrickou analýzou v čítačke mikrodoštičiek a inherentná povaha koncového bodu reakcie obmedzuje použitie testu MTT na určité aplikácie. To viedlo k vývoju tetrazóliových analógov, v ktorých boli fenylové časti zdobené negatívne nabitými sulfonátovými skupinami, ako je 2,3-bis-(2-metoxy-4-nitro- 5- sulfofenyl)-2H-tetrazólium-5-karboxamid (XTT), vnútorná soľ s negatívnym nábojom [15] a 3-(4,5-dimetyltiazol-2-yl) -5-(3-karboxymetoxyfenyl)-2-(4-sulfofenyl)-2H-tetrazólium (MTS), slabo kyslá vnútorná soľ úzko súvisiaca s MTT [16] . Tieto modifikácie viedli k produkcii formazanových produktov rozpustných v kultivačnom médiu, ktoré eliminovali požiadavku solubilizačného kroku pred kvantifikáciou. V súlade s tým, keďže zvýšený záporný náboj na týchto molekulách znížil ich schopnosť pohybovať sa cez bunkové membrány [17], intermediárne akceptory elektrónov (IEA), ako je 1-metoxy-5-metylfenazíniummetylsulfát ({{25 }}metoxy PMS) boli potrebné na uľahčenie redukcie tetrazolového farbiva alebo na zvýšenie rýchlosti redukcie.

Nedávno bola vyvinutá nová generácia vo vode rozpustných tetrazóliových solí, ktorých prototypom je WST-1 [18]. WST-1, záporne nabitá disulfónovaná vnútorná soľ obsahujúca jódový zvyšok, je stabilnejšia ako XTT a MTS v prítomnosti 1-metoxy PMS, čo je jeho povinná IEA. To viedlo k marketingu WST-1/1-metoxy PMS ako pohodlnej súpravy na proliferáciu buniek s jedným činidlom. Bolo vyvinutých niekoľko ďalších tetrazóliových solí zo série WST, z ktorých možno najužitočnejšie je WST-8 [19]. Zdá sa, že WST-8 má veľmi podobné vlastnosti bunkovej redukcie ako WST{10}} a predáva sa nezávisle ako test CCK{11}}. WST-8 je bunková nepriepustná, a preto sa redukuje extracelulárne prostredníctvom transportu elektrónov z intracelulárneho NADH do WST-8 cez plazmatickú membránu sprostredkovaného 1-metoxy PMS. Hoci zníženie MTT a WST-8/1-metoxy PMS je poháňané intracelulárnym NADH, zdá sa, že zdroj NADH sa v rámci týchto dvoch metód líši. Zníženie WST-8/1-metoxy PMS je viac závislé od jablčnanu/aspartátu, ktorý spája mitochondriálny cyklus trikarboxylových kyselín-NADH s extramitochondriálnym priestorom [20].

V predbežných experimentoch sme potvrdili, že zlúčeniny 1, 2, 3 a 4 nemohli priamo redukovať MTT tetrazóliovú soľ (nie je znázornené). V tejto štúdii sa priamy vplyv zlúčenín samotných s činidlom eliminoval opatrným premytím mikroplatní fyziologickým roztokom pufrovaným fosfátom (PBS) pred pridaním roztoku MTT alebo CCK-8, ako je uvedené v protokoloch výrobcu. Napriek tomu boli výsledky získané použitím týchto dvoch metód stále protichodné (obrázok 2). Ako sa očakávalo, inkubácia buniek so zlúčeninami 1, 2 a 3 zvýšila redukciu tetrazóliovej soli na purpurový formazan v porovnaní s kontrolnou skupinou (obrázok 3), čo naznačuje, že iba redukcia tetrazóliovej soli v prítomnosti špecifickej zlúčeniny nie je dostatočná na posúdenie schopnosti zlúčeniny interferovať s MTT testom.

Aby sa určilo, či zlúčeniny 1, 2, 3 a 4 môžu indukovať apoptózu v bunkách EA.hy926, hodnotili sa bunkové morfologické zmeny a externalizácia fosfatidylserínu. V súlade s poklesom bunkovej životaschopnosti pozorovaným pri teste CCK-8 výsledky Hoechstovho farbenia a analýzy prietokovej cytometrie s použitím anexínu V-FITC/PI naznačujú, že inhibícia rastu pozorovaná po liečbe zlúčeninou 1, 2 a 3 bola aspoň čiastočne v dôsledku apoptózy buniek EA.hy926. Naše výsledky tiež podporili myšlienku, že kaffeoylová skupina prítomná v zlúčeninách 1 a 2 bola zodpovedná za protichodné výsledky získané pomocou testu MTT.

Podobne ako pri našich zisteniach, Rottlerin, silný otvárač draslíkových kanálov s veľkou vodivosťou, nevykazoval in vitro reaktivitu voči MTT. Silne však zosilnil tvorbu formazanových kryštálov vo vnútri buniek, čo je výsledok, ktorý bol v evidentnom rozpore s inhibíciou NF-κB rottlerínom a bunkovou proliferáciou pozorovanou analýzou inkorporácie [3H]-tymidínu do DNA [21]. Mechanizmus, ktorým Rottlerin zosilnil redukciu MTT, bol pripísaný jeho mitochondriálnemu uncoupling efektu [22]. Rottlerin má substitučnú skupinu kyseliny cinnamoylovej. V porovnaní s kyselinou cinnamoylovou obsahuje zlúčenina 3 dva ďalšie hydroxylové zvyšky, ktoré sa nachádzajú na C-3 a C-4. Preto predpokladáme, že mechanizmus, ktorým zlúčeniny 1 a 2 spôsobujú konfliktné výsledky v teste MTT, môže byť tiež spojený s ich mitochondriálnymi odpájacími účinkami. Na testovanie tejto hypotézy sú potrebné porovnávacie štúdie medzi zlúčeninami 1, 2 a chemickým odpájacím zariadením, ako je trifluórkarbonylkyanidfenylhydrazón (FCCP).

experimentálna sekcia

Činidlá a chemikálie

Zlúčenina 3 (kyselina kávová – prášok, čistota=98,6 percent) bola zakúpená od Chengdu Push Bio-Technology Co., Ltd. (Chengdu, Čína). Zlúčenina 4 (3,4-dihydroxylfenyletanol–olej, čistota=98,5 percenta) bola získaná od Chengdu Must Bio-Technology Co., Ltd. (Chengdu, Čína). MTT a dimetylsulfoxid (DMSO) boli získané od Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). Test CCK{11}} bol zakúpený od Dojin Laboratories (Kumamoto, Japonsko). Hoechst 33342 a anexínové V-FITC/PI súpravy na detekciu apoptózy boli zakúpené od Beyotime Institute of Biotechnology (Haimen, Čína)

Rastlinný materiál

Stonky C. tubulosa boli zozbierané z prefektúry Yutian, Ujgurská autonómna oblasť Xinjiang, Čína. Vzorky poukazov boli uložené v Key Laboratory of High Altitude Medicine, Tretia vojenská lekárska univerzita (Chongqing, Čína) a overené Yi Zhangom z Chengdu University of Traditional Chinese Medicine (Chengdu, Čína).

Extrakcia a izolácia rastlinného materiálu

Na vzduchu sušené stonky C. tubulosa (0,6 kg) boli rozdrvené a extrahované 50 percentným etanolom počas 2 hodín pri 70 stupňoch. Po odstránení rozpúšťadla za zníženého tlaku sa etanolový extrakt (212,5 g) rozpustil a suspendoval vo vode (2 1) a extrahoval n-butanolom (2 1 x 3). n-butanolový extrakt (110 g) sa chromatografoval na polyamidovej kolóne a eluoval sa zmesou etanol/voda (0:100, 5:95, 15:85, 30:70, 50:50) za vzniku piatich frakcií (A–E) . Frakcia B (65 g) sa frakcionovala na kolóne ODS; elúciou zmesou etanol:voda (1:9) sa oddelí zlúčenina 1 (3 g). Frakcia D (10,5 g) sa frakcionovala na kolóne ODS; elúciou zmesou etanol/voda (1:4) sa oddelí zlúčenina 2 (1 g).

NMR spektrá boli zaznamenané na spektrometri Bruker Avance 600 v CD3OD s tetrametylsilánom (TMS) ako vnútorným štandardom. Hmotnostné spektrá boli uskutočnené na hmotnostnom spektrometri BioTOF-Q.

Bunková kultúra

Bunkové línie EA.hy926 sa získali z American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA). Bunky sa kultivovali v médiu RPMI 1640, doplnenom 10 percentami (objem/objem) fetálnym hovädzím sérom a 1 percentom (objem/objem) penicilín-streptomycínom vo zvlhčenom prostredí s 5 percentami CO2 pri 37 stupňoch.

Životaschopnosť buniek

Životaschopnosť buniek bola hodnotená pomocou testov MTT a CCK {{0}}. Zlúčeniny 1 a 2 a ich aglykóny, kyselina kávová (3) a 3, 4-dihydroxylfenyletanol (4) boli rozpustené v DMSO na konečnú koncentráciu DMSO < 0,1="" percenta="" (obj./obj.)="" v="" kultivačnom="">

Bunky EA.hy926 boli nasadené na 96-jamkové platne v množstve 4 x 103 buniek/jamku. Po inkubácii počas 24 hodín boli bunky ošetrené 6, 25 až 50 uM zlúčeniny 1, 2, 3 alebo 4 počas 24 hodín. Kultivačné médium sa odstránilo a bunky sa dvakrát premyli fyziologickým roztokom pufrovaným fosfátom (PBS). Alikvóty (10 ul) zásobného roztoku MTT (5 mg · ml - 1 ) sa pridali do každej jamky obsahujúcej 100 ul média a inkubovali sa s bunkami počas 4 hodín. Po inkubácii sa médium odstránilo a do každej jamky sa pridali 150 ul alikvóty DMSO, aby sa kryštály formazanu rozpustili. Absorbancia sa merala pri 490 nm pomocou čítačky mikrodoštičiek (Bio-Tek Synergy HT, Winooski, VT, USA). Životaschopnosť buniek bola vyjadrená ako percento zníženia MTT, pričom 100 percentná hodnota bola priradená absorbancii kontrolných buniek. Všetky experimenty boli uskutočnené trikrát a prezentované ako priemer ± štandardná odchýlka (SD).

Test CCK-8 bol vykonaný podľa literatúry s miernymi úpravami [23]. Konkrétne boli bunky ošetrené 6, 25 až 50 μM zlúčeninami 1, 2, 3 alebo 4 počas 24 hodín a dvakrát premyté PBS pred pridaním 10 μl roztoku CCK{11}} a 100 μl kultivačného média. Po inkubácii mikrodoštičky pri 37 stupňoch počas 2 hodín sa merala absorbancia pri 450 nm pomocou čítačky mikrodoštičiek. Životaschopnosť buniek bola vyjadrená ako percento životaschopných buniek vzhľadom na kontrolné bunky (100 percent). Všetky experimenty sa uskutočnili trikrát a vyjadrili sa ako priemer ± SD.

Hodnotenie apoptózy farbením Hoechst 33342

Apoptotické morfologické zmeny boli pozorované farbením Hoechst 33342. Stručne, bunky EA.hy926 sa naočkovali na 48-jamkové platne (2 x 104 buniek/jamka) a ošetrili 50 uM zlúčeniny 1, 2, 3 alebo 4 počas 48 hodín pri 37 stupňoch, dvakrát sa premyli PBS, a fixované 4 percentami (obj./obj.) paraformaldehydom počas 15 minút pri teplote miestnosti. Po dvojnásobnom premytí PBS sa bunky farbili s Hoechst 33342 (10 ug.ml-1) počas 5 minút pri teplote miestnosti a dvakrát sa premyli PBS. Hoechstovo zafarbené jadrá sa vizualizovali pomocou fluorescenčného mikroskopu (Olympus, Tokio, Japonsko).

Analýza apoptózy prietokovou cytometriou

Apoptotické bunky sa detegovali pomocou dvojitého farbenia anexínom V-FITC/PI a analýzy prietokovou cytometriou. Stručne, po ošetrení 50 uM zlúčeninou 1, 2, 3 alebo 4 počas 48 hodín sa bunky zozbierali a resuspendovali v PBS pri 1 x 105 buniek · ml-1. Po centrifugácii pri 500 x g počas 5 minút pri 25 stupňoch sa pridalo 195 ul anexín V-FITC väzbového pufra a 5 ul anexínu V-FITC. Po jemnom vortexovom miešaní sa zmes inkubovala 10 minút pri teplote miestnosti v tme. Po centrifugácii pri 500 x g počas 5 minút pri 25 stupňoch sa pridalo 190 ul FITC-konjugovaného anexín V väzbového pufra a 10 ul PI. Po jemnom vortexovom miešaní sa vzorky analyzovali pomocou FACSCalibur Flow Cytometer (Becton Dickinson, San Jose, CA, USA) v priebehu 30 minút.

Štatistická analýza

Všetky experimentálne údaje boli vyjadrené ako priemer ± SD. Významnosť rozdielov medzi experimentálnymi vzorkami a zodpovedajúcou kontrolou bola hodnotená jednosmernou analýzou rozptylu (ANOVA) s použitím softvéru SPSS (verzia 11.5). Štatistická významnosť bola stanovená na p <>

Závery

Naše výsledky naznačujú, že nadhodnotenie počtu životaschopných buniek pozorovaných v teste MTT by mohlo maskovať cytotoxicitu určitých zlúčenín. Preto počas procesov skríningu liekov odporúčame použiť rôzne metódy na určenie účinku špecifickej zlúčeniny na životaschopnosť buniek (ako sú testy CCK{0}} a 3H-TdR), aby sa predišlo vytváraniu zavádzajúcich výsledkov.