Ishophloroglucín A izolovaný z Ishige Okamurae potláča melanogenézu indukovanú -MSH: in vitro a in vivo časť 1

Abstrakt:Difloretohydroxykarmalol (DPHC) izolovaný z Ishige Okamuru (IO) vykazoval potenciálne bieliace účinky proti UV-B žiareniu. Zložky IO a ich molekulárny mechanizmus proti hormónu stimulujúcemu melanocyty ( -MSH) však ešte neboli preskúmané. Táto štúdia sa teda zamerala na skúmanie inhibičných účinkov izofloroglucínu A (IPA), florotanínu izolovaného z hnedých rias IO a jeho surového extraktu (IOE), v melanogenéze in vivo v modeli zebrafish indukovanej -MSH a v bunkách melanómu B16F10 in vitro. Uskutočnili sa molekulárne dokovacie štúdie florotanínov, aby sa určili ich inhibičné účinky a objasnil sa spôsob ich interakcie s tyrozinázou, glykoproteínom súvisiacim s melanogenézou. Okrem toho sa morfologické zmeny a obsah melanínu znížili v modeli zebrafish indukovanej -MSH po liečbe IPA a IOE. Okrem toho Western blotting odhalil, že IPA upregulovala expresiu extracelulárneho proteínu v bunkách B16F10 stimulovaných MSH. Tieto výsledky teda naznačujú, že IPA izolovaná z IOE má potenciál na použitie vo farmaceutickom a kozmetickom priemysle.

Podľa relevantných štúdiícistancheje obyčajná bylina známa ako "zázračná bylina, ktorá predlžuje život". Jeho hlavnou zložkou jecistanozid, ktorý má rôzne účinky ako naprantioxidant, protizápalová a podpora imunitných funkcií. Mechanizmus medzi cistanche a bielením kože spočíva v antioxidačnom účinku cistanchových glykozidov.melanínv ľudskej koži vzniká oxidáciou tyrozínu katalyzovanou tyrozinázou. Oxidačná reakcia vyžaduje účasť kyslíka, preto sa bezkyslíkaté radikály v tele stávajú dôležitým faktorom ovplyvňujúcim tvorbu melanínu. Cistanche obsahuje cistanozid, ktorý je antioxidantom a môže tak znížiť tvorbu voľných radikálov v teleinhibícia produkcie melanínu.

1. Úvod

Morské riasy si získali obrovskú pozornosť vo funkčnom potravinárskom, kozmetickom a farmaceutickom priemysle, pretože využívajú bioaktívne zlúčeniny, ako sú florotaníny, fukoidány, polysacharidy a bielkoviny [1–7]. Podľa predchádzajúcej štúdie bol Ishige Okamurae (IO) skrínovaný na jeho inhibičné účinky na aktivitu tyrozinázy [8]. Hoci jeho florotanín, diflorethohydroxykarmalol (DPHC), bol hodnotený na antimelanogenéznu aktivitu indukovanú UV-B žiarením v in vitro modeli [8], neuskutočnili sa žiadne ďalšie štúdie na vysvetlenie interakcie medzi DPHC a proteínmi súvisiacimi s melanogenézou. V tejto štúdii bola nová polyfenolová zlúčenina Ishophloroglucin A (IPA) [9] hodnotená na svoju interakciu s tyrozinázou v štúdii molekulárneho dokovania v porovnaní s DPHC.

Kliknite na Organic Cistanche Tubulosa pre bielenie

Požiadajte o viac:

david.deng@wecistanche.com WhatApp:86 13632399501

Molekulárne dokovanie je efektívna výpočtová metóda na predpovedanie potenciálneho väzbového režimu malých molekúl alebo ligandov v aktívnom mieste proteínu alebo receptora so známou trojrozmernou štruktúrou na štúdium ich interakčných vzorov alebo na navrhovanie liekov [10–12]. Predchádzajúce štúdie uvádzali interakčné miesto enzýmu tyrozinázy a energetickú hodnotu skúmanú štúdiami molekulárneho dokovania [13,14]. Funkčne je tyrozináza enzým obmedzujúci rýchlosť, ktorý katalyzuje relatívne pomalú reakčnú rýchlosť v signálnej dráhe a hrá kľúčovú úlohu v biosyntéze melanínu v špecializovaných organelách nazývaných melanozómy, špecificky syntetizovaných melanocytovými bunkami [15]. Enzymatická aktivita tyrozinázy modelovaná prostredníctvom simulácií molekulového dokovania in silico bola teda cieľom skúmania inhibítorov na prevenciu kožných hyperpigmentovaných porúch. Na základe toho sa v experimentálnej a výpočtovej oblasti veľa fenolových zlúčenín alebo inhibítorov, ktoré majú schopnosť chelatovať kovy, široko skúmalo ako inhibítory tyrozinázy [16].

Melanín primárne upravuje farbu pokožky a pôsobí ako ochranný pigment, keď je pokožka vystavená UV žiareniu [17]. Vystavenie UV žiareniu spôsobuje uvoľňovanie -melanocyty stimulujúceho hormónu ( -MSH) z kožných keratinocytov a melanocytov, aby sa indukovala syntéza melanínu a následne chránila koža pred škodlivými účinkami slnečného žiarenia [18]. Dlhodobé vystavenie UV žiareniu však indukuje významnú syntézu melanínu prostredníctvom -MSH, čo vedie k poškodeniu kože, ako sú pehy, slnečné škvrny a čierne škvrny na epidermis, čo vedie k fotopoškodeniu DNA a rakovine kože [19]. Následne sa široko skúmalo podávanie -MSH do melanocytov, aby vyvolalo značné zmeny v aktivite tyrozinázy pre melanogenézu pri melanóme [20].

Zebrafish vykazuje rozdiely vo farbe kože ako ľudia. Sú zvieracím modelom používaným na pochopenie genetického pôvodu farby ľudskej kože, spájajúci základnú biológiu modelového organizmu s ľudskou genetikou [21]. Okrem toho pigmenty vo ventrálnych a laterálnych oblastiach gastruly zebry a ich priehľadnosť počas larválnych štádií umožňujú jednoduché pozorovanie procesu pigmentácie, čo poskytuje príležitosť vyvinúť životaschopné modely na pochopenie porúch kožných buniek, ktoré sú výsledkom defektov vo vývoji melanocytov [22– 24].

K syntéze melanínu dochádza prostredníctvom aktivity niekoľkých proteínov súvisiacich s melanogenézou, ako je tyrozináza, transkripčný faktor spojený s mikroftalmiou (MITF), proteín súvisiaci s tyrozinázou-1 (Trp-2) a proteín súvisiaci s tyrozinázou{ {6}} (Trp-1) [15]. V tejto štúdii sme sa zamerali na skúmanie inhibičného účinku IPA a IO surového extraktu (IOE) na aktivitu tyrozinázy a melanogenézu na -MSH-indukované zebrafish in vivo a B16F10 melanómové bunky in vitro, aby sme vyhodnotili ich potenciálne použitie pri liečbe pigmentácie kože a melanómu. .

2. Výsledky

2.1. Štúdia molekulárneho dokovania

Bola vykonaná dokovacia metóda na simuláciu väzby komerčného enzýmu tyrozinázy s IPA, DPHC a arbutínom [25]. Väzbové režimy IPA, DPHC alebo arbutínu s hubovou tyrozinázou sú uvedené na obrázku 1A–C. Ako je znázornené na 3D diagrame komplexu tyrozináza-IPA (obrázok 1A), tyrozináza-DPHC (obrázok 1B) a tyrozináza-arbutín (obrázok 1C), hoci IPA, DPHC a arbutín sú pripojené k aktívnemu miestu, tyrozináze- IPA komplex vykazoval najväčšiu väzbovú plochu. Okrem toho, ako je znázornené na 2D diagrame, komplex tyrozináza-IPA vykazoval viac interakcií s rôznymi aminokyselinami tyrozinázy v porovnaní s tyrozináza-DPHC alebo tyrozináza-arbutín. Sedem benzénových kruhov (1., 2., 3., 8., 9., 12. a 16.) a ich atómy kyslíka majú π–π interakcie s histidínom60, metionínom61, lyzínom157, glutamátom158, prolínom160, 18 prolínom a arginínom201 . Najmä 16. benzénový kruh bol kombinovaný s histidínom60 a histidínom204, hlavnými aminokyselinami aktívneho miesta. Okrem toho mnohé atómy kyslíka v IPA interagovali prostredníctvom vodíkových väzieb s glutamátom158, prolínom160, aspartátom167, metionínom184, fenylalanínom197, asparagínom199, glutamínom202, asparagínom205 a arginínom209. Okrem toho sa na základe výsledkov dokovacej analýzy vypočítalo, že celková väzbová energia a energia interakcie CDOCKER pomocou programu interakčnej energie CDOCKER DS 3.0 (obrázok 1D) boli nasledovné: energia interakcie s tyrozinázou: Ishophloroglucin A (IPA): − 152,154 kcal/mol, diflorethohydroxykarmalol (DPHC): −65,5221 kcal/mol a arbutín: −33,6835 kcal/mol a väzbová energia s tyrozinázou: Ishophloroglucín A (IPA): −546,504 kcal/hocal 07 DPPC07 diphlohloret HC /mol a arbutín: −79,0913 kcal/mol.

2.2. Účinky melanogénnych inhibítorov na syntézu melanínu u lariev zebrafish

Účelom tejto štúdie bolo určiť, či IPA a IOE môžu in vivo inhibovať melanogenézu u lariev zebričiek. V našej predchádzajúcej štúdii IPA a IOE nepreukázali žiadnu toxicitu u lariev zebričiek [26]. Larvy zebričiek (0.05, 0,15 a 0,5 nM) a IOE (3, 10 a 30 µg/ml) sme ošetrili ) na určenie ich obsahu melanínu. Aby sme odhadli inhibičné aktivity, zmerali sme celkový obsah melanínu v extraktoch zebričiek. Fenotypový účinok na melanín zebričiek sa pozoroval analýzou pigmentácie ich tela pod mikroskopom pri izbovej teplote. Povrchový melanín bol významne znížený rôznymi koncentráciami cieľových inhibítorov (obrázok 2). Ošetrenie 3 nM -MSH významne zvýšilo obsah melanínu v zebrafish v porovnaní s neošetrenou skupinou. Najvyššie koncentrácie IPA (0,5 nM) a IOE (30 µg/ml) znížili celkový obsah melanínu o takmer 28,56 percent a 30,36 percent, v uvedenom poradí, čo malo podobné účinky ako skupina liečená arbutínom (200 uM) (obrázok 2A, B).

2.3. Účinky IPA a IOE na syntézu melanínu v bunkách B16F10

Cytotoxické účinky IPA a IOE na bunky B16F10 sa merali pomocou MTT (3-(4,5-dimetyltiazol-2-yl)-2,{{ 7}}difenyltetrazólium bromid). Spočiatku sme skúmali cytotoxické účinky IPA a IOE na bunky B16F10 ošetrené rôznymi koncentráciami bez stimulácie -MSH. IPA (0,15, 0,5, 1,5 a 5 nM) neodhalila žiadnu významnú cytotoxicitu na bunkách B16F10, zatiaľ čo IOE (1, 3, 10 a 30 ug/ml) nevykazovala žiadnu cytotoxicitu (obrázok 3A, B). Na ďalšiu štúdiu sa použili koncentrácie IPA a IOE bez toxicity.

Skúmali sme, či účinok inhibície melanínu z liečby buď IPA alebo IOE in vivo bol reverzibilný bez stimulácie -MSH v bunkách B16F10. Obsah melanínu sa významne znížil po liečbe IPA (5 nM) alebo IOE (30 ug/ml) v porovnaní s kontrolnou skupinou (obrázok 3C, D). Tieto výsledky naznačujú, že IPA a IOE inhibovali syntézu melanínu bez stimulácie -MSH v bunkách B16F10, čím prispeli k jeho antimelanogenetickému účinku.

2.4. Účinky IPA a IOE na aktivitu tyrozinázy a syntézu melanínu v bunkách B16F10 stimulovaných MSH

Preto sa dávky IPA (0,5, 1,5 a 5 nM) a IOE (3, 10 a 30 ug/ml) inkubovali s bunkami melanómu B16F10, aby sa určila ich biologická aktivita v aktivite bunkovej tyrozinázy a -MSH - sprostredkovaná melanogenéza.

Koncentrácie -MSH a arbutínu boli stanovené na základe výsledkov ich cytotoxicity a produkcie melanínu v bunkách B16F10 (obrázok S2A–D). Analýzou údajov o miere prežitia sa na ďalšie experimenty použilo 1 nM -MSH a 100 uM arbutínu.

Čo sa týka aktivity bunkovej tyrozinázy, hoci inhibičné účinky 1,5 nM IPA boli relatívne nižšie ako tie, ktoré sú znázornené v pozitívnej kontrole, koncentrácia sa líšila takmer 10-krát, s vyššou koncentráciou arbutínu pri 100 uM (obrázok 4A). IOE znížila aktivitu tyrozinázy s miernym kolísaním medzi účinkami rôznych koncentrácií v porovnaní so skupinou liečenou -MSH (obrázok 4B). Čo sa týka melanogenézy sprostredkovanej -MSH, v skupinách liečených 1,5 a 5 nM IPA sa pozorovalo významné zníženie obsahu melanínu (obrázok 4C). Okrem toho 30 ug/ml IOE inhibovalo pigmentáciu do bodu, ktorý sa podobal slepej skupine (obrázok 4D). Tieto výsledky naznačujú, že IPA a IOE znížili aktivitu tyrozinázy a že tento inhibičný účinok môže viesť k zníženej syntéze bunkového melanínu v bunkách B16F10.

2.5. Účinky IPA a IOE na molekulárny mechanizmus v bunkách B16F10 stimulovaných MSH

Aby sme objasnili mechanizmus zodpovedný za ich inhibičný účinok na melanogenézu, určili sme vplyv IPA a IOE na hladiny expresie signálnych molekúl zapojených do syntézy melanínu (obrázok 5). ERK (extracelulárnym signálom regulovaná kináza), JNK (Jun N-terminálna kináza) a p38 patria do mitogénom aktivovanej proteínkinázy (MAPK) intracelulárnej signálnej transdukčnej kaskády [27,28]. Ako je znázornené na obrázku 5A, B, fosforylácia ERK bola zvýšená ošetrením IPA, zatiaľ čo fosforylácia JNK bola mierne znížená po ošetrení IPA (1,5 a 5 nM) alebo IOE (30 ug/ml). Okrem toho, ako je znázornené na obrázku 5C, hladiny p-p38 boli vysoko zvýšené v skupinách stimulovaných -MSH, približne o 80 percent v porovnaní s kontrolou. Okrem toho po ošetrení IPA, IOE alebo arbutínom bola fosforylácia p38 mierne potlačená. Tieto zistenia naznačujú, že melanogénne inhibičné účinky IPA a IOE môžu súvisieť so signálnymi dráhami JNK a p38 MAPK.

Požiadajte o viac: david.deng@wecistanche.com WhatApp:86 13632399501