Polysacharidy z jujuby zmiernili anémiu u potkanov s chronickým ochorením obličiek

Kontakt: emily.li@wecistanche.com

Shiying Huang a kol

Abstraktné

Polysacharidy z jujuby (JP) sú jedným z aktívnych glykánov pochádzajúcich z potravy v ovocí Ziziphus jujuba, o ktorom sa uvažuje pri liečbe nedostatku krvi. V tejto štúdii achronickýobličkychoroba(CKD) potkaní model sa použil na vyhodnotenie účinku JP a jeho mechanizmu na anémiu spojenú s CKD. U potkanov CKD sa liečba JP výrazne zlepšilaobličkyfunkciu, obličkypatologickézraneniea hematologické parametre, vrátane zvýšenia počtu červených krviniek, hemoglobínu, hematokritu a počtu krvných doštičiek. Okrem toho LC-MS / MS cielené metabolomické výsledky ukázali, že JP podporoval uvoľňovanie mastných kyselín s krátkym reťazcom (SCFA) u CKD potkanov. Okrem toho JP striedal hladinu sérového erytropoetínu (EPO), obličkovú EPO mRNA aobličkyEPO proteín prostredníctvom HIF signalizácie. Súhrnne tieto výsledky poskytujú dôkaz, že účinok JP na anémiu spojenú s CKD môže byť zapojený do regulácie uvoľňovania SCFA a produkcie erytropoetínu, čo podporuje ďalší vývoj JP ako potravinových doplnkov pri liečbe anémie spojenej s CKD.

Kľúčové slová: Jujube polysacharidyChronickýobličky chorobaAnémia Erytropoetín Faktor indukovateľný hypoxiou – mastné kyseliny s krátkym reťazcom

Kliknutím sem získate viac informácií o Cistanche

1. Úvod

Chronickýobličky choroba(CKD) je definovaný ako klinický syndróm obličkových štrukturálnych abnormalít alebo funkčných porúch a stáva sa celosvetovo čoraz väčšou záťažou pre verejné zdravie (Webster, Nagler, Morton, & Masson, 2017). Renálna anémia patrí medzi najčastejšie komplikácie CKD, ktoré prispievajú k zvýšenému riziku úmrtia (Locatelli et al., 2019). Nedostatočná produkcia erytropoetínu (EPO) je uznávaným hlavným hnacím faktorom anémie pri CKD (Pappa, Dounousi, Duni a Katopodis, 2015). EPO sa tvorí v pečeni aobličky, ktorý je nevyhnutný pre tvorbu erytrocytov (Lappin & Lee, 2019). V hypoxických podmienkach môže hypoxiou indukovateľný faktor (HIF) aktivovať expresiu EPO (Sch¨ odel & Ratcliffe, 2019). Zacielenie na HIF na vyvolanie produkcie EPO sa teda považovalo za novú terapeutickú stratégiu na liečbu anémie spojenej s CKD.

Jujuba je plodom Ziziphus jujuba Mill. (Rhamnaceae), tiež známy ako čínsky dátum. Jujube má dlhoročné tradičné používanie trvajúce tisíce rokov ako liečivá bylina a doplnok stravy. Jujube sa používa ako zdravotný doplnok pre ľudí, ktorí majú hematogénnu alebo chronickú podvýživu. Jujube polysacharidy (JP), vo vode rozpustná zložka zložená s rôznymi pomermi monosacharidu a kyseliny urónovej (Ji, Hou, Yan, Shi a Liu, 2020), je jednou z aktívnych zložiek v jujube (Ji et al., 2017 ), ktorý bol dobre akceptovaný, že vykazuje hepatoprotektívny účinok a imunomodulačnú aktivitu a zvyšuje funkciu črevnej bariéry (Liu a kol., 2015, Yue a kol., 2015). V skutočnosti sa JP tiež bežne považuje za látku, ktorá má potenciálne účinky na anémiu. Molekulárny mechanizmus JP pri liečbe anémie je však stále menej známy.

V posledných rokoch sa metabolomika široko používa na pochopenie potenciálnych faktorov, ktoré prispievajú k progresii ochorenia. Cielená metabolomika sa široko používa pri identifikácii molekulárnych markerov komplexných ľudských chorôb, ako je CKD. Indoxylsulfát (IS) a p-krezylsulfát (PCS) boli overené ako biomarker progresie CKD (Meijers & Evenepoel, 2011) a zvýšený stupeň trimetylamín-N-oxidu (TMAO) by mohol priamo viesť k renálnej tubulointersticiálnej fibróze a dysfunkcii. (Tang a kol., 2015). Mastné kyseliny s krátkym reťazcom (SCFA), metabolity závislé od črevných mikroorganizmov, sú energetické substráty so schopnosťou ovplyvňovať rôzne fyziologické procesy (LeBlanc et al., 2017) a uvádza sa, že zníženie SCFA prispieva k progresii CKD. (Koh, De Vader, Kovatcheva-Datchary, & B¨ ackhed, 2016, Wang a kol., 2019). Okrem toho boli SCFA schopné chrániť štruktúru obličiek pred poškodením prostredníctvom inhibície oxidačného stresu (Li, Ma, & Fu, 2017). Súčasne sa zistilo, že SCFA vykazujú priaznivý účinok na absorpciu železa a upregulujú expresiu génu embryonálneho/fetálneho globínu, čo indukuje erytropoézu a upravuje anémiu (Tako, Glahn, Knez a Stangoulis, 2014). Mechanizmus SCFA pri renálnej anémii je však stále potrebné objasniť.

V tejto štúdii predpokladáme, že JP by mohol regulovať uvoľňovanie SCFA a stimulovať produkciu EPO sprostredkovanú HIF, výsledkom čoho je korekcia renálnej anémie. Tu budeme skúmať účinok JP na zlepšenie renálnej anémie u 5/6 nefrektómiou indukovaných CKD potkanov, vrátane renálnych funkcií a hematologických parametrov. Cielený metabolomický prístup využívajúci LC-MS/MS je vyvinutý na stanovenie ôsmich SCFA vrátane kyseliny octovej, kyseliny propánovej, kyseliny izomaslovej, kyseliny maslovej, kyseliny 2-metylmaslovej, kyseliny izovalérovej, kyseliny valérovej a kyseliny hexánovej vo výkaloch a vzorky obličiek a hladiny cielených SCFA sa hodnotia u zdravých potkanov a potkanov CKD. Okrem toho sa odhalilo aj zapojenie HIF signalizácie u potkanov liečených JP.

Obr. 1. Typická GC–MS chromatografia JP. (A) Monosacharidové štruktúrne vzorce po derivatizácii aldononitrilacetátu; (B) Reprezentatívne profily GC-MS zmesovej iónovej chromatografie (MIC) štandardnej zmesi monosacharidov a JP hydrolyzovaných monosacharidov. Píky v chromatografických profiloch zodpovedali chemickému markeru uvedenému v (A): 1. ramnóza, 2. arabinóza, 3. fukóza, 4. xylóza, 5. manóza, 6. glukóza, 7. galaktóza, 8. inozitol (ISTD ).

2. Materiály a metódy

2.1. Príprava polysacharidu z jujuby

Plody Z. jujuba boli zakúpené od Shenzhen Huahui Pharmaceutical Co., Ltd. Materiály overil Dr. Jianping Chen podľa liekopisu Čínskej ľudovej republiky z roku 2015. Vzorky poukazov boli uložené v nemocnici tradičnej čínskej medicíny Shenzhen s číslom 18100601.

Surový JP bol extrahovaný z jujuby, ako je opísané vyššie, s malými úpravami (Ji et al., 2020). Stručne, jujuby boli inkubované s 10 objemami vody (v/w) vo vodnom kúpeli pri 80 °C počas 3 hodín a extrahované 3-krát. Po filtrácii sa filtráty spoja a táto zmes sa kondenzuje na rotačnej odparke za kontrolovaného vákua. Koncentrovaný roztok sa ďalej vyzrážal pridaním štvornásobku etanolu (v/v) pri 4 °C počas 12 hodín. Zrazenina sa oddelila odstredením a vysušila sa za zníženého tlaku do sucha, čím sa získal surový JP. Čistota JP bola stanovená na 80 percent pomocou kalorimetrie.

2.2. Charakterizácia monosacharidového zloženia jujubového polysacharidu

Systém Shimadzu GC–MS (Shimadzu GC–MS TQ8040 prepojený so Shimadzu GC 2010 plus) vybavený zdrojom EI, kapilárnou kolónou SH-Rxi-5Sil MS (30 m x 0,25 mm ID, 0,25 um hrúbka filmu, Shimadzu) sa použil na stanovenie derivatizačných hydrolyzovaných monosacharidov s deliacim pomerom 10:1. Teplota vstrekovania, iónového zdroja a rozhrania boli 250 ◦C, 200 ◦C a 250 ◦C. Počiatočná teplota kolóny sa udržiavala na 120 ◦C počas 1 minúty, potom sa zvýšila rýchlosťou 15 ◦C/min na 160 ◦C a udržiavala sa 4 minúty, 2 ◦C/min na 165 ◦C a udržiavala sa 2 minúty, 20 ◦C /

min na 195 ◦C, 5 ◦C/min na 250 ◦C a udržiavané 3 minúty. Prietok nosného plynu hélia sa udržiaval na 46 cm/s a do prístroja sa vstrekli 2 ul každej vzorky. Analyty boli kvantifikované vo vybranom režime monitorovania iónov (SIM), cieľový ión: ramnóza (m/z 129.00), arabinóza (m/z 115.00), fukóza (m/). z 103.00), xylóza (m/z 115.00), manóza (m/z 115.00), glukóza (m/z 115.00 ), galaktóza (m/z 115.00), inozitol (m/z 126.00). Štandardy monosacharidov boli uvedené nasledovne: L ( plus )-arabinóza (1506–200202), fukóza (112014–201902), D-xylóza (111508–201605), D-glukóza (110833–201908), 08833–201908, 211rhamnose512121 ), galaktóza (100226–201807), D-manóza (140651–201805) boli zakúpené od National Institutes for Food and Drug Control. Inositol bol získaný od Sigma (1 7508-50 g).

Extrahovaný JP (10 mg) sa hydrolyzoval na monosacharidy s 10 ml 2 mol/l kyseliny trifluóroctovej (TFA) pri 105 °C počas 3 hodín a hydrolyzované monosacharidy z JP sa skoncentrovali a premyli pri zníženom tlaku pri 60 °C na odstrániť TFA a zvyšky boli rekonštituované 2 ml vody. Pridalo sa 250 ul 20 mg/ml roztoku hydroxylamín hydrochloridu/pyridínu do 100 ul hydrolyzovaného roztoku monosacharidov a zmes sa udržiavala vo vodnom kúpeli s teplotou 90 °C počas 45 minút. Potom sa pridalo 250 ul anhydridu kyseliny octovej a zmes sa udržiavala vo vodnom kúpeli s teplotou 90 °C počas ďalších 45 minút. Na konci reakcie sa zmes 5-krát extrahovala 1 ml cyklohexánu a cyklohexánová vrstva sa skoncentrovala na 1 ml. Vstreknite 1 µl supernatantu do GC-MS na analýzu (Li & Shi, 2013).

2.3. Zvieratá

Všetky experimenty sa uskutočňovali s protokolmi schválenými Inštitucionálnym výborom pre starostlivosť o zvieratá z Guangzhou University of Chinese Medicine. Potkany Sprague-Dawley, samce a samice, s hmotnosťou 180 – 220 g, boli získané z Guangdong Medical Laboratory Animal Center (Foshan, Čína, povolenie č. SCXK (Yue) 2008 – 0002) a udržiavané v špecifickom prostredí bez patogénov (SPF ) zariadenie pre zvieratá v 12-hodinovom cykle svetlo-tma s voľným jedlom a vodou.

Na indukované zlyhanie obličiek bola vykonaná 5/6 nefrektómia podľa predchádzajúceho popisu (Chen et al., 2019). Všetky chirurgické operácie sa uskutočnili v anestézii 10 percentným chloralhydrátom. Skupina simulovanej operácie (n=6) urobila rovnaké kroky na otvorenie brušnej dutiny a odhalenie obličky. 5/6 potkanov s nefrektómiou sa náhodne rozdelilo do dvoch skupín. Potkany bez liečby (CKD skupina, n=6) a potkany dostávajúce JP (CKD plus JP skupina, n=6) ​​orálne žalúdočnou sondou v dávke 1,2 g/kg/deň. Po 90 dňoch prevádzky začalo 90 dní podávania. 90. deň bol konečný čas podania JP potkanom a po 24 hodinách boli zvieratá usmrtené odobratím krvi z brušnej aorty a od každého potkana boli odobraté vzorky moču, výkalov, séra a obličiek. Všetky vzorky boli pred ďalšou analýzou skladované pri -80 ◦C.

2.4. Biochemická analýza

Podľa pokynov výrobcu sa dusík močoviny v krvi (BUN) a sérový kreatinín (Scr) merali pomocou súpravy na detekciu kreatinínu v sére a súpravy na detekciu BUN (WAKO, Ginza, Japonsko) a proteín v moči sa meral súpravou Elisa (Nanjing Jiancheng Bioengineering Institution, Nanjing, Čína). Červené krvinky (RBC), hemoglobín (Hb), hematokrit (HCT) a počet krvných doštičiek (PLT) boli analyzované Hematology Systems (Siemens 2021i, Erlangen, Nemecko) podľa pokynov výrobcu.

2.5. Histologické vyšetrenie

Na hodnotenie renálneho patologického poškodenia sa použilo farbenie kyselina jodistá-Schiff (PAS) a Masson, medzi nimi farbenie PAS sa použilo na odhalenie renálnej tubulárnej atrofie a glomerulárnej oblasti a farbenie podľa Massona sa použilo na renálnu intersticiálnu fibrózu (Xie et al. , 2020). Metóda kvantitatívnej analýzy bola vykonaná podľa predchádzajúcich štúdií (Chen et al., 2019). Stručne povedané, skóre tubulárnej atrofie pri farbení PAS bolo definované nasledovne: 1. zriedkavý jediný atrofický tubulus; 2. niekoľko zhlukov atrofických tubulov; 3. masívna atrofia. Glomerulárna oblasť bola meraná softvérom ZEN 3.1 (Axio Scope A1, ZEISS, Jena, Nemecko). Fibrózna oblasť pri farbení podľa Massona sa merala pomocou softvéru Image J (NIH, Bethesda, MD, USA). Najmenej desať mikroskopických polí (200x) 6 potkanov na skupinu bolo zachytených náhodne, aby sa zmeralo skóre atrofie, glomerulárnej oblasti a fibrotickej oblasti, s aspoň jedným glomerulom v každom mikroskopickom poli.

2.6. Imunohistochemická analýza

Rez obličkového parafínu (4 μm) z každej vzorky bola postupná dehydratácia dvakrát xylénom a gradient etanolu (100–95–90–80–70 percent), antigén bol získaný pufrom kyseliny citrónovej (pH 6,0 ) počas 30 minút, blokované 3 percentným peroxidom vodíka počas 10 minút a kozím sérom počas 30 minút pri teplote miestnosti. Tkanivové rezy boli inkubované oddelene primárnou protilátkou HIF-1 (Bioss, bs-0737R, 1: 500, šarža: BA01279129), HIF-2 (Bioss, bs{18}} R, 1: 500, šarža: BJ2044786) pri 4 °C počas 10 hodín a kozia anti-králičia sekundárna protilátka konjugovaná s HRP (Abcam, ab6712, 1:1000) pri izbovej teplote počas 30 minút, DAB (diaminobezid in) sa použil na detekovať aktivitu HRP, jadro bolo kontrastne zafarbené hematoxylínom. . Imunohistochémia sa analyzovala pod mikroskopickými poľami 400x z každej skupiny a fixovala sa stupnica=20 μm pomocou Axio Scope A1, ZEISS, Jena, Nemecko. Jadro bolo sfarbené domodra hematoxylínom a imunopozitivita DAB bola hnedá, hlbšie zafarbenie DAB znamená silnejšie imunohistochemicky pozitívne.

2.7. Detekcia EPO

Obsah EPO v sére sa detegoval pomocou súpravy ELISA (Abcam, ab274398) a experiment sa odvolával na protokol súpravy ELISA. Ako bolo zhrnuté, do vzorky sa pridal kokteil protilátok EPO a inkubovali sa 1 hodinu. po inkubácii sa každá jamka 3-krát premyla premývacím pufrom, do druhej jamky inkubovanej počas 15 minút sa pridal TMB a reakcia sa zastavila.

Celková mRNA obličiek sa extrahovala zo zmrazeného tkaniva obličiek pomocou Trizolu a mRNA sa preložila na cDNA. Real-time PCR sa uskutočnila s Maxima SYBR Green/ROX qPCR Master Mix (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA USA, K0223) podľa protokolu výrobcu. Zelený signál SYBR sa získal a zmeral pomocou ABI Prism 7300 Sequence Detection System (Applied Biosystems, Foster City, CA). Priméry boli: 5'-CCG TCC CAG ATA CCA AAG TC-3′ a 5′-ACC CGA AGC AGT GAA GTG-3′ pre potkany EPO (214 bps, NM_017001). 2); 5′- GTC GGT GTG AAC GGA TTT G-3′ a 5′-TCC CAT TCT CAG CCT TGA C- 3′ pre GAPDH (181 bps, NM_017008,3), housekeeping gens ako interná kontrola vo všetkých prípadoch. A relatívna kvantifikácia génovej expresie bola vypočítaná metódou normalizovanej génovej expresie (2− ΔΔCT).

Rovnaké množstvá proteínu lyzátov kôry obličiek sa naniesli a oddelili 10 percentným SDS gélom a potom sa preniesli na nitrocelulózové membrány. Po blokovaní v 5 percentnom nemastnom mlieku počas 2 hodín pri teplote miestnosti sa membrány inkubovali s primárnou protilátkou pri 4 °C cez noc. Potom sa membrány inkubovali s HRP (chrenová peroxidáza)-konjugovaným anti-myším IgG (Life Technologies) pri teplote miestnosti počas 45 minút. Aktivita HRP bola vizualizovaná pomocou substrátu Clarity Western ECL a analyzovaná zobrazovacím systémom Tanon. V tejto štúdii sa použila nasledujúca primárna protilátka: monoklonálny EPO (B- 4) z myší (Santa Cruz Biotechnology, sc{8}}, riedenie 1/500), monoklonálny -aktín z myší (technológia bunkovej signalizácie, 8H10D10, riedenie 1/1000).

2.8. Analýza mastných kyselín s krátkym reťazcom

Systém Shimadzu UHPLC-LCMS/MS (Shimadzu LC-MS 8045 prepojený so Shimadzu LC-20AD) vybavený zdrojom ESI.

Chromatografické separácie sa uskutočnili na stĺpci Shim-pack GIST C18 (2,1 × 100 mm, 2 μm) s použitím {{10}},1 percenta kyseliny mravčej vo vode ( rozpúšťadlo A) a acetonitril (rozpúšťadlo B) pri prietokovej rýchlosti 0,3 ml/min gradientovou elúciou: 0–9 min, 25–30 percent B; 9–11 min, 30–40 percent B; 11 – 20 min, 40 – 50 percent B; 20 – 20,1 min, 50 – 100 percent B; 20,1–23 min, 100 percent B; 23,1 min – 25 percent B na opätovné ekvilibrovanie. Teplota kolóny bola 35 °C a automatický vzorkovač sa počas analýzy udržiaval pri teplote 4 °C, do prístroja sa vstrekol 1 μl každej vzorky. Detekcia analytu sa uskutočňovala v režime monitorovania viacerých reakcií (MRM), prevádzkovanom v režime pozitívnych iónov. Parametre MS: prietok rozprašovacieho plynu: 3,0 l/min; Sušenie Prietok plynu: 10 l/min; Kúrenie Prietok plynu: 10 l/min; DL teplota: 250 ◦C; teplota rozhrania: 300 ◦C; Vyhrievací blok: 400 ◦C. MRM prechody a kolízna energia (CE) boli vybrané a optimalizované priamou infúziou každého štandardného derivátu. Analytické množstvá MRM prechodov boli zhrnuté v tabuľke S1.

Fekálne SCFA: Pridalo sa 100 ul 50 percentného acetonitrilu do 3 mg lyofilizovaných výkalov a vírilo sa 2 minúty. Potom bola zmes centrifugovaná pri 12 000 ot./min. počas 10 minút pri 4 °C a napipetovaný supernatant.

Obličkové SCFA: Odvážilo sa 100 mg obličkového tkaniva a vortexovalo sa na ľade so 4-násobkom normálneho fyziologického roztoku (100 mg/400 ul), aby sa pripravil tkanivový homogenát. 3-krát pridaný studený metanol do 300 μl tkanivového homogenátu a vortexovaný 2 minúty, potom bola zmes centrifugovaná pri 12 000 ot./min počas 10 minút pri 4 °C a napipetovaný supernatant. Supernatant sa vysušil N2 a rekonštituoval sa 100 ul 50 % acetonitrilu.

Pridal sa 500 mmol/l hydrochloridu N-(3-dimetylaminopropyl)-Ń-etylkarbodiimidu (EDC, Aladdin, Shanghai, Čína), 50 mmol/l 3H-[1,2,3]-triazolo[4, 5-b] pyridín-3-ol (HOAT, Aladdin, Shanghai, Čína) a 50 mg/ml 12C-dansylhydrazínu (12C-DnsHz, J&K, Peking, Čína) do 20 μl extrahovanej vzorky v sekvenciu s rovnakým objemom. EDC a HOAT boli pripravené s čerstvou 500 mmol/l 2-(N-morfolino)etánsulfónovej kyseliny (MES, Macklin, Shanghai, Čína). Po inkubácii pri 20 °C počas 90 minút sa do zmesi pridalo 20 ul 50 mmol/l CuCl2 (Macklin, Shanghai, Čína), aby sa uhasila derivatizačná reakcia pri 40 °C počas 30 minút (Zhao & Li, 2018). Na konci derivatizácie bola zmes 10-krát zriedená 25 % acetonitrilom. Pred analýzou sa 100 ul supernatantu zmiešalo so 100 ul roztoku vnútorného štandardu. Značka 13C-DnsHz sa použila ako vnútorné štandardy (ISTD1-8) v súlade s rovnakou derivatizačnou reakciou. Štandard SCFA: kyselina octová (AA, A116173), kyselina propánová (PA, P110446), kyselina izomaslová (IBA, I103524), kyselina maslová (BA, B110438), 2-kyselina metylmaslová (2- BA, M107377), kyselina izovalerová (IVA, 1108280), kyselina valérová (VA, V108271), kyselina hexánová (HA, H103632) boli dodané od spoločnosti Aladdin (Shanghai, Čína).

2.9. Štatistická analýza

Údaje každej skupiny boli vyjadrené ako priemer ± štandardná odchýlka (SD). Štatistická významnosť medzi skupinami sa uskutočnila jednosmernou ANOVA a post hoc analýzou pomocou Student-Newman-Keulsovho (SNK) testu alebo Dunnettovho T3 testu. Hodnota P < 0.05="" sa="" považovala="" za="" štatisticky="" významnú.="" všetky="" údaje="" boli="" uskutočnené="" pomocou="" štatistického="" softvéru="" spss="" (verzia="" 22.0,="" spss="" inc.,="" chicago,="" il,="">

3. Výsledky

3.1. JP zlepšil funkciu obličiek potkanov CKD

Monosacharid JP bol charakterizovaný pred liečbou na zvieratách. JP použitý v tejto štúdii pozostával zo siedmich monosacharidov, to znamená ramnózy (1,62 percenta), arabinózy (15,79 percenta), fukózy (0,21 percenta), xylózy (4,56 percenta), manózy (3. 00 percent), glukóza (73,44 percent) a galaktóza (4,99 percent) (obr. 1). Naša metóda analýzy bola overená linearitou, presnosťou, opakovateľnosťou, stabilitou a výťažnosťou (tabuľky S2 – S3). Potvrdilo sa, že analyty sú stabilné pri teplote miestnosti počas 24 hodín. Výťažok JP by mal byť vyšší ako 8,63 percenta a čistota by nemala byť nižšia ako 77,16 percenta. Vyššie uvedená chemická analýza JP slúžila ako prístup kontroly kvality na zabezpečenie reprodukovateľnosti nižšie uvedených štúdií na zvieratách.

Scr, BUN a močový proteín boli najreprezentatívnejšie funkcie obličiek. Hladiny Scr, BUN a proteínov v moči u potkanov s CKD boli významne vyššie ako v simulovanej skupine (P < {{0}}="" 0,01).="" po="" 90="" dňoch="" liečby="" jp="" boli="" hladiny="" scr,="" bun="" a="" močového="" proteínu="" znížené="" v="" porovnaní="" so="" skupinou="" s="" ckd="" (p="">< 0,01)="" (obr.="">

3.2. JP zlepšil patologické poškodenie obličiek u potkanov CKD

Hmotnosť celej pravej obličky pre simulovanú skupinu a zvyšná pravá oblička pre CKD a skupinu CKD plus JP sa použila na hodnotenie morfológie obličiek podľa hmotnosti obličiek (KW) a hmotnosti obličiek / telesnej hmotnosti (KW/BW). Na konci experimentov sa KW a KW/BW skupiny CKD zvýšili v porovnaní s falošnou skupinou (všetky P < {{0}}.05).="" v="" modeli="" ckd="" vyvolaného="" nefrektómiou="" 5/6="" spôsobilo="" zníženie="" aktivity="" renálnej="" proteinázy="" kompenzačný="" rast="" obličiek,="" spoločnosti="" s="" renálnou="" hypertrofiou="" (morton="" &="" griffiths,="" 1985),="" a="" toto="" tvrdenie="" sme="" potvrdili.="" po="" liečbe="" jp="" sa="" kw="" významne="" znížila="" (p="">< 0,05)="" a="" uzavrela="" sa="" do="" simulovanej="" skupiny="" (p="" ˃="" 0,05);="" zatiaľ="" čo="" kw/bw="" sa="" mierne="" znížila="" (p="" ˃="" 0,05).="" (obr.="">

Obr. 2. JP chránil funkciu obličiek u CKD potkanov. Hladina Scr (A), BUN (B) a proteínu v moči (C) v rôznych skupinách. (D) hmotnosť obličiek, (E) KW/BW. Údaje boli prezentované ako priemer ± SD, n=6 na skupinu (**P < 0.01="" v="" porovnaní="" s="" falošnou="" skupinou;="" #p="">< 0,05="" ,="" ##p="">< 0,01="" v="" porovnaní="" so="" skupinou="">

V skupine s CKD vykazovala renálna tubulárna masívnu atrofiu v porovnaní so simulovanou skupinou (P < {0}}.01)="" a="" oblasť="" glomerulov="" a="" renálna="" intersticiálna="" fibróza="" boli="" takmer="" dvakrát="" väčšie="" ako="" simulovanej="" skupiny="" v="" kvantitatívnej="" analýze="" (p="">< 0.01).="" po="" liečbe="" jp="" sa="" skóre="" tubulárnej="" atrofie="" takmer="" dvakrát="" znížilo="" (p="">< 0,01),="" oblasť="" glomerulov="" sa="" takmer="" obnovila="" na="" simulovanú="" skupinu="" (p="">< 0,01)="" a="" renálna="" intersticiálna="" fibróza="" sa="" znížila="" o="" jednu="" tretinu="" (p="">< 0,01).="" v="" porovnaní="" so="" skupinou="" ckd="" (obr.="">

Obr. 3. JP chránil obličkovú štruktúru u CKD potkanov. (A) Farbenie PAS. (B) Massonovo farbenie. (C) Skóre tubulárnej atrofie. (D) Glomerulárna oblasť (E) Fibrotická oblasť. Všetky obrázky sú zobrazené v rovnakom zväčšení, 200×, mierka=100 μm. Údaje boli prezentované ako priemer ± SD, n=6 na skupinu (**P < 0,01="" v="" porovnaní="" so="" simulovanou="" skupinou;="" #p="">< 0,05,="" ##p="">< 0,01="" v="" porovnaní="" so="" skupinou="" s="" ckd="">

3.3. JP moduloval hematologické parametre u CKD potkanov

Pre hematologické parametre biochemickej analýzy boli merané RBC, Hb, HCT a PLT. U potkanov s CKD sa hladina červených krviniek znížila z 9.{16}}6 na 7,20 × 1012/l, Hb z 15,28 na 13,22 g/dl, HCT zo 47,1 na 40,4 percenta a PLT sa zvýšila od 1012 do 1526 x 109 /l v porovnaní s falošnou skupinou (P < 0,01),="" čo="" naznačuje,="" že="" príznaky="" anémie="" boli="" pozorované="" u="" potkanov="" ckd.="" znížené="" hladiny="" rbc,="" hb,="" hct="" a="" plt="" u="" potkanov="" ckd="" liečených="" jps="" boli="" obnovené="" (p="">< 0,01)="" (obr.="">

Obr. 4. JP rehabilitoval hematologické parametre u CKD potkanov. Hladina PLT (A), RBC (B), Hb (C), HCT (D). Údaje boli prezentované ako priemer ± SD, n=6 na skupinu (**P < 0.01="" v="" porovnaní="" s="" falošnou="" skupinou;="" #p="">< 0,05="" ,="" ##p="">< 0,01="" v="" porovnaní="" so="" skupinou="">

3.4. JP stimuloval expresiu EPO

V porovnaní so simulovanou skupinou bola hladina EPO v sére a množstvo obličkovej EPO mRNA významne znížené u potkanov s CKD anémiou (P < 0.01).="" analýza="" western="" blotting="" odhalila,="" že="" hladina="" proteínu="" epo="" vykazovala="" mierne="" zníženie="" v="" skupine="" s="" ckd="" bez="" významného="" rozdielu.="" po="" liečbe="" jp="" sa="" hladina="" epo="" v="" sére,="" obličková="" epo="" mrna="" a="" proteín="" významne="" zvýšili="" v="" porovnaní="" so="" skupinou="" s="" ckd="" (p="">< 0="" 0,01="" alebo="" p="">< 0,05)="" (obr.="">

V obličkovej kôre bol HIF-1 produkovaný hlavne renálnymi tubulárnymi epitelovými bunkami, HIF-2 bol exprimovaný hlavne v endotelových bunkách a renálnych intersticiálnych fibroblastoch (Sch¨ odel & Ratcliffe, 2019). Imunohistochemická analýza ukázala, že rovnako ako v prípade HIF-1 u potkanov s CKD boli tubuly silnejšie zafarbené ako v simulovanej skupine. Po liečbe JP mali obličkové tubuly silnejšie a väčšie zafarbenie v porovnaní so skupinou s CKD, ako je znázornené červenou šípkou na obr. 5E. HIF-2 vykázala relatívne slabú imunohistochémiu pozitívnu v intersticiálnej obličke v skupine Sham. V skupine s CKD HIF-2 vykázala imunohistochémiu pozitívnu. Po liečbe JP vykazoval HIF-2 silnejšiu imunohistochémiu v porovnaní so skupinou s CKD (obr. 5F).

Obr. 5. JP stimuloval expresiu EPO. (A) Obsah EPO v sére. (B)ObličkyEPO relatívna mRNA. GAPDH bol považovaný za housekeeping gén. (C) Reprezentatívne obrazy Western blot expresie proteínu EPO. (D) Denzitometrická analýza EPO. (E) Imunohistochémia HIF{{0}} . (F) Imunohistochémia HIF- 2 normalizovaná na obsah -aktínu. Imunohistochemické snímky sú prezentované v rovnakom zväčšení, 400×, mierka=20 μm. Jadro bolo sfarbené domodra hematoxylínom a imunopozitivita DAB bola hnedá, hlbšie zafarbenie DAB znamená silnejšie imunohistochemicky pozitívne. Červená šípka ukazuje na imunohistochémiu pozitívnu. Údaje boli prezentované ako priemer ± SD, n=6 na skupinu (*P < 0,05="" v="" porovnaní="" s="" falošnou="" skupinou;="" #="" p="">< 0,05,="" #="" #="" p="">< 0,01="" v="" porovnaní="" so="" skupinou="">

3.5. JP indukoval uvoľňovanie SCFA

Na kvantifikáciu uvoľňovania ôsmich SCFA vo vzorkách stolice bol vyvinutý cielený metabolomický prístup založený na LC-MS. Zavedená metóda bola overená hodnotením linearity, citlivosti, presnosti, matricového efektu, presnosti a stability. Vzorky kontroly kvality s nízkou, strednou a vysokou koncentráciou (LQC, QMC, HQC) na overenie citlivosti, presnosti, presnosti a stability sa vybrali podľa bodov s najnižšou, strednou a najvyššou koncentráciou štandardnej krivky matrice a výsledkov boli uvedené v tabuľkách S4–S6. Potvrdilo sa, že analyty sú stabilné pri 4 °C počas 48 hodín. LC-MS/MS chromatogram SCFA je znázornený na obr.

Obr. 6. UHPLC-MS/MS chromatografia SCFA. (A) Horná časť bola derivatizačná chemická rovnica SCFA; pod bol štruktúrny vzorec SCFA po derivatizácii dansylhydrazínu; (B) Chromatogram UHPLC/MRM-MS štandardov zmesi a vzorky stolice, chromatografické píky v (B) zodpovedali chemickému markeru uvedenému v (A):1. kyselina 12C-octová; 2. kyselina 13C-octová (ISTD1); 3. kyselina 12C-propánová; 4. kyselina 13C-propánová (ISTD2); 5. kyselina 12C-izomaslová; 6. kyselina 12C-maslová; 7. kyselina 13C-izomaslová (ISTD3); 8. kyselina 13C-maslová (ISTD4); 9. kyselina 12C-2-metylmaslová; 10. kyselina 12C-izovalerová; 11. 12C kyselina valérová; 12. kyselina 13C-2-metylmaslová (ISTD5); 13. kyselina 13C-izovalerová (ISTD6); 14. kyselina 13C-valerová (ISTD7); 15. kyselina 12C-hexánová; 16. Kyselina 13C-hexánová (ISTD8).

Pokiaľ ide o vzorku stolice, v skupine s CKD boli hladiny AA a PA výrazne znížené takmer 4-krát a 5-krát v porovnaní s falošnou skupinou (P < 0.01);="" zatiaľ="" čo="" po="" liečbe="" jp="" boli="" množstvá="" aa="" a="" pa="" obnovené="" späť="" na="" 4/5="" simulovanej="" skupiny="" (p="">< {{10}}.01).="" podobne="" aj="" hladiny="" ba="" a="" va="" boli="" výrazne="" znížené="" takmer="" 30-krát="" a="" 4-krát="" v="" skupine="" s="" ckd="" v="" porovnaní="" s="" falošnou="" skupinou="" (p="">< 0,01).="" liečba="" jp="" vykazovala="" stúpajúci="" trend,="" ale="" nie="" výrazné="" zlepšenie.="" obsah="" iba,="" iva="" a="" 2-ba="" nepreukázal="" výraznú="" zmenu="" medzi="" ckd="" a="" falošnou="" skupinou.="" po="" liečbe="" jp="" sa="" hladina="" iba,="" iva="" a="" 2-ba="" zvýšila="" (p="">< 0,01).="" avšak="" ha="" nevykazovala="" zjavnú="" zmenu="" medzi="" tromi="" skupinami="" (obr.="" 7a).="" okrem="" toho,="" čo="" sa="" týka="" tkaniva="" obličiek,="" v="" skupine="" s="" ckd="" boli="" všetky="" množstvá="" ôsmich="" scfa="" významne="" znížené="" (p="">< 0,01),="" zatiaľ="" čo="" po="" liečbe="" jp="" boli="" hladiny="" scfa="" zvýšené="" okrem="" ba="" a="" ha="" (p="">< 0,01="" alebo="" p="">< 0,5).="" ba="" bola="" mierne="" zvýšená="" bez="" signifikantne="" a="" ha="" nevykazovala="" zmenu="" po="" liečbe="" jp="" (obr.="">

Obr. 7. Obsah SCFA v inej skupine. (A) Fekálne SCFA. (B) obličkové SCFA. Údaje boli prezentované ako priemer ± SD, n=6 na skupinu (**P < 0.01="" v="" porovnaní="" s="" falošnou="" skupinou;="" ##p="">< 0.="" 01,="" #p="">< 0,05="" v="" porovnaní="" so="" skupinou="">

4. Diskusia

V súčasnom modeli potkanov CKD s 5/6 nefrektómiou,obličkyfunkciusa signifikantne zvýšili ukazovatele (Scr, BUN a bielkovina v moči), objavila sa zvyšková renálna hypertrofia a renálne patologické poškodenie sprevádzané zmenami hematologických parametrov. Tieto údaje boli v súlade s predchádzajúcimi štúdiami (Garrido et al., 2015, Morton & Griffiths, 1985). Vyššie uvedené indikátory ukázali, že CKD-anémia potkanov indukovaná 5/6 nefrektómiou bola úspešne preukázaná a bolo možné overiť priaznivý účinok JP pri liečbe CKD-anémie potkanov. Sobličkyfunkciusa ďalej zhoršovala anémia ako známa oportúnna komplikácia CKD, ktorá negatívne ovplyvnila kvalitu života pacientov (Locatelli, Fishbane, Block, & Macdougall, 2017). Pochopenie rizikových faktorov súvisiacich s progresiou renálnej anémie pomôže vyvinúť terapeutické prístupy. Spojenie medzi ochorením a metabolizmom črevnej mikroflóry v súčasnosti priťahuje čoraz väčšiu pozornosť, zatiaľ čo vzťah medzi SCFA a renálnou anémiou je stále menej známy. SCFA, metabolizované hlavne Clostridium, Coprococcus a Bacteroides (Koh et al., 2016), sa zameriavajú na špecifické receptory viazané na membránu, ktoré hrajú dôležitú úlohu pri udržiavaní rovnováhy prostredia v čreve a zdravia celého tela. Už sa dokázalo, že SCFA majú neoddeliteľný vzťah s CKD a hladiny kyseliny octovej, kyseliny propiónovej a kyseliny maslovej sa pri CKD znížili (Wang et al., 2019). U potkanov CKD vyvolaných adenínom sa výrazne zmenila abundancia a diverzita črevnej mikrobioty, spoločnosti znížili hladinu kyseliny propánovej, kyseliny maslovej a kyseliny valérovej (Lakshmanan, Al, Ali a Terranegra, 2021). Na základe našej predchádzajúcej štúdie sekvenovanie 16S rDNA ukázalo, že dysbióza črevnej mikrobioty sa prejavila u 5/6 potkanov CKD vyvolaných nefrektómiou v porovnaní s falošnou skupinou. Niektoré z SCFA produkujúcich rody, najmä kyselinu maslovú z Clostridium, Coprococcus, vykazovali rozdiely u potkanov CKD (Zheng et al., 2020). V súlade s tým naše výsledky ukázali, že množstvá kyseliny octovej, kyseliny propiónovej, kyseliny maslovej a kyseliny valérovej sa u potkanov CKD znížili o približne 60 percent, 80 percent, 85 percent a 60 percent, čo naznačuje, že pokles SCFA zodpovedal s nerovnováhou črevného prostredia. Je potrebné poznamenať, že porucha črevného prostredia vyvolaná CKD spustila abnormálny metabolizmus črevnej mikrobioty (Feng et al., 2019). Okrem toho sme zistili, že u potkanov s CKD anémiou sa znížilo osem druhov hladín SCFA. Napríklad abnormalita konečných metabolických produktov, tj SCFA, môže byť výsledkom progresie CKD.

Polysacharidy, jedna z účinných látok, boli nájdené v rôznych bylinách, ako sú Dioscoreae Rhizoma, Schisandra Chinensis, Astragali Radix a Jujubae Fructus. Polysacharidy môžu byť fermentované a degradované črevnou mikroflórou. Výsledkom je, že polysacharidy sú prezentované ako substrát pre črevnú mikroflóru na metabolizáciu na SCFA alebo sa predpokladá, že majú prebiotický účinok na zlepšenie zloženia črevnej mikroflóry, aby sa uľahčila produkcia SCFA (Cai et al., 2019). V tejto štúdii naše zistenia odhalili, že polysacharidy z jujuby stimulovali uvoľňovanie SCFA v črevnej mikroflóre, ako je kyselina octová, kyselina propánová, kyselina izomaslová, kyselina 2-metylmaslová u potkanov s CKD. Okrem toho sa po liečbe JP zlepšila hladina SCFA v obličkách potkanov s CKD anémiou a tendencia zmeny bola konzistentná so vzorkou výkalov. Na základe existujúceho výskumu sa vzťah medzi SCFA a CKD postupne vyjasnil. Napríklad sa uvádza, že kyselina octová moduluje imunitný systém a zmierňuje akútne stavyobličkyzranenieinhibíciou signalizácie NADPH oxidázy v T bunkách (Al-Harbi et al., 2018). Ukázalo sa, že kyselina propánová zabraňuje progresii CKD vyvolanej adenínom prostredníctvom receptora voľných mastných kyselín 2 (FFA2) a FFA3 (Mikami et al., 2020). Preto sme usúdili, že znovuzískanie hladiny SCFA v obličkách bolo prospešné pre chorú obličku. Uvádza sa, že JP zvýšil diverzitu črevnej mikrobioty a zvýšil relatívnu abundanciu aktívnej mikrobioty SCFA (Bacteroides) u myší s kolorektálnym karcinómom (Ji et al., 2020). Okrem toho JP zvýšil koncentráciu celkových SCFA vo vzorkách stolice (Ji et al., 2019). Preto sme usúdili, že JP by mohol stimulovať produkciu SCFA, aby sa dosiahol účel spomalenia progresie CKD. JP môže byť tiež metabolickým substrátom pre dominantnú mikroflóru SCFA na stimuláciu produkcie SCFA pri CKD alebo prebiotickou zložkou na obnovenie črevného prostredia, najmä rozmanitosti dominantnej mikroflóry SCFA, a ďalej podporovať uvoľňovanie SCFA, aby sa zabrániť progresii CKD.

Vo všeobecnosti je ťažké analyzovať SCFA (bez uhlíka ako 6) s nízkou molekulovou hmotnosťou a vysokou chemickou polaritou priamo chromatografickými prístupmi. Izotopovo značená chemická derivatizácia stratégie SCFA by mohla zlepšiť citlivosť prístroja a znížiť chyby analýzy, čo poskytlo užitočnú stratégiu na určovanie SCFA v analýze LC-MS/MS (Higashi & Ogawa, 2016). V poslednej dobe sa prístupy značené dansylhydrazínom uspokojivo používajú pri detekcii cieľových metabolitov ľudskej plazmy obsahujúcich karboxylovú kyselinu (Chen & Zhang, 2020). Na podporu tohto sme v tejto štúdii ďalej vyvinuli chemickú derivatizáciu založenú na prístupe LC-MS/MS na stanovenie 8 SCFA vo výkaloch potkanov. SCFA sú produkované črevnou mikrobiotou a takmer 10 percent SCFA sa vylučuje stolicou (Boets et al., 2015). Preto analýza fekálnych vzoriek SCFA môže priamo odrážať zmeny v črevnom prostredí a má väčšiu referenciu v multi-omickej spoločnej analýze medzi SCFA a črevnou mikrobiotou. Najmä pri validácii nestability sme zistili, že SCFA značené dansylhydrazínom boli nestabilné pri izbovej teplote a ich intenzita na hmotnostnom spektre vykazovala klesajúcu tendenciu s časom, ale mohla zostať stabilná 48 hodín pri 4 °C. Po derivatizácii SCFA by sa teda analyty mali pred analýzou uchovávať pri 4 °C.

V pokročilých štádiách CKD 4–5 obmedzuje nedostatok produkcie EPO erytropoézu, čo prispieva k najkritickejšiemu faktoru rozvoja renálnej anémie (Sakashita, Tanaka a Nangaku, 2019). Rutinná liečba anémie s látkami stimulujúcimi erytropoézu (ESA) je navrhnutá v usmerneniach klinickej praxe. Treba však brať ohľad na bezpečnosť ESA, ktorá je spojená so zvýšeným rizikom úmrtia a kardiovaskulárnych príhod (Thavarajah & Choi, 2019). U pacientov s renálnou anémiou mala byť expresia EPO konzistentná alebo zrakovo zvýšená v porovnaní so zdravými telami (Babitt & Lin, 2012). V počiatočnom štádiu úroveň EPO predstavovala trend upgradu, zatiaľ čo v neskoršom štádiu úroveň EPO vykazovala klesajúci trend v porovnaní s počiatočným štádiom, dokonca nižší ako normálne (Panjeta, Tahirovi´c, Sofi´s, ´ Cori´s a Derviˇsevi ´c, 2017). V súlade s predchádzajúcimi experimentmi (Chen a kol., 2019; Wang a kol., 2020) naše výsledky ukázali, že hladina EPO v sére bola znížená u potkanov s CKD anémiou. V tomto poradí sme detegovali obličkovú EPO mRNA a hladinu proteínu u CKD potkanov a hladina obličkového EPO proteínu bola mierne znížená v porovnaní so simulovanou skupinou, zatiaľ čo množstvo obličkovej EPO mRNA bolo degradované a jeho stupeň bol vyšší ako hladina EPO v sére. Obličky sú primárnym zdrojom syntézy EPO u dospelých a pacientov s ERSDobličkysi stále zachováva schopnosť produkovať erytropoetín (Bernhardt et al., 2010). Na korekciu endogénnych hladín EPO v sére a prispôsobenie sa renálnej anémii sa však aktivovala produkcia EPO v obličkáchobličkyzranenieznížená expresia EPO mRNA (Sch¨ odel & Ratcliffe, 2019). Po ošetrení JP sa zvýšila hladina EPO v sére, ako aj hladiny mRNA EPO a proteínov v obličkách sa zvýšili. V našej predchádzajúcej štúdii mohol JP stimulovať transkripčnú aktivitu HRE a zosilniť gén EPO (Chen et al., 2014). Preto sme špekulovali, že JP by mohol obnoviť hladinu EPO v sére potkanov CKD na regulovanú renálnu anémiu, ku ktorej môže prispieť stimulovaná expresia génu EPO v obličkách na úrovni mRNA.

V kôre bol HIF-1 zistený hlavne v tubulárnom a HIF{1}} v renálnom interstíciu. Pretože EPO je produkovaný hlavne fibroblastmi, v ktorých je spoločne umiestnený HIF-2, podporuje to, že HIF-2 môže byť zodpovedný za reguláciu produkcie EPO (Maxwell, 2003). V našej štúdii sme zistili, že HIF-1 a HIF{7}} môžu byť aktivované CKD a liečba JP by mohla stimulovať aktivitu HIF-1 a HIF-2 v porovnaní s CKD potkanmi . Bolo dokázané, že HIF{10}} má hlavnú úlohu v regulácii produkcie EPO (Kapitsinou et al., 2010), zatiaľ čo zvýšená regulácia HIF{12}} môže mať účinok ochrany obličiek v obličkách (Jiang et al. al., 2020), čo nepriamo zlepšuje produkciu EPO. Produkcia EPO v obličkách bola najskôr regulovaná na úrovni mRNA, pri anémii alebo hypoxii sa expresia EPO mRNA mohla zvýšiť stimuláciou proteínu HIF. Predtým farmakologický výskum ukázal, že jujuba stimulovala expresiu EPO prostredníctvom regulácie hladiny proteínu HIF v bunkovom modeli (Chen a kol., 2014, Lam a kol., 2016). Preto sme usúdili, že JP môže upregulovať expresiu EPO mRNA prostredníctvom HIF- proteínu, aby sa dosiahol účel zmiernenia renálnej anémie.

Okrem toho na základe súčasných výsledkov predpokladáme, že zníženie SCFA môže mať rozhodujúcu úlohu pri expresii EPO sprostredkovanej HIF, ktorá prispieva k anémii CKD. V rozpore s tým sa ukázalo, že zvýšená hladina kyseliny octovej bola prospešná pre acetyláciu HIF{2}} a tvorbu komplexu proteín-HIF 2 viažuci CREB a ďalej indukovala expresiu EPO (Xu et al., 2014). Kyselina propiónová zmiernila narušenie mitochondrií, hipokampálnu apoptózu a neurologické deficity prostredníctvom dráhy HIF-1/ERK (Cheng et al., 2019). Okrem toho sa zistilo, že kyselina maslová stabilizuje HIF-1, aktívne cieľové gény HIF na bunkách hrubého čreva a zmierňuje zápalovú reakciu hrubého čreva (Kelly et al., 2015). V našej štúdii sme zistili, že hladiny kyseliny octovej, kyseliny propánovej a kyseliny maslovej boli významne znížené spolu s abnormálnou expresiou proteínu HIF- CKD potkanov, čo naznačuje, že stabilita HIF- môže súvisieť s poklesom SCFA a SCFA môžu mať účinok stabilizácie HIF na reguláciu expresie EPO.

5. Závery

Na záver sme dokázali, že JP zlepšil CKD as ním spojenú anémiu, ktorej mechanizmus sa podieľal na regulácii uvoľňovania SCFA a produkcie EPO. A JP môže byť bioaktívnou zložkou jujuby na liečbu anémie. Tieto zistenia môžu poskytnúť dôkaz pre ďalší vývoj JP ako potravinových doplnkov na liečbu anémie spojenej s CKD.

Etické vyhlásenie

Všetky pokusy na zvieratách v našom výskume boli vykonané s protokolmi schválenými etickou komisiou Guangzhou University of Chinese Medicine av súlade s pokynmi Národného inštitútu zdravia pre starostlivosť a používanie laboratórnych zvierat (publikácia NIH č. 80-23, revidovaný v roku 1996). V našom výskume nedošlo k porušeniu vyššie uvedených pokynov.

Poďakovanie

Táto práca je podporovaná Natural Science Foundation of Guangdong Province (2018A030313305), Natural Science Foundation of China (81804052, 81973577 a 82004248), Shenzhen Science and Technology Plan Project (JSGG2019112910vin a 50191129102216eau čínskej medicíny)8012216eau China 20201320).

Referencie

Al-Harbi, NO, Nadeem, A., Ahmad, SF, Alotaibi, MR, AlAsmari, AF, Alanazi, WA, … Ibrahim, KE (2018). Mastná kyselina s krátkym reťazcom, acetát, zlepšuje akútnu sepsuobličkyzranenieinhibíciou signalizácie NADPH oxidázy v T bunkách. International Immunopharmacology, 58, 24–31.
Babitt, JL a Lin, HY (2012). Mechanizmy anémie pri CKD. Journal of the American Society of Nephrology, 23(10), 1631–1634.
Bernhardt, WM, Wiesener, MS, Scigalla, P., Chou, J., Schmieder, RE, Günzler, V., …Eckardt, KU (2010). Inhibícia prolylhydroxyláz zvyšuje produkciu erytropoetínu pri ESRD. Journal of the American Society of Nephrology, 21(12),
2151–2156.
Boets, E., Deroover, L., Houben, E., Vermeulen, K., Gomand, SV, Delcour, JA, … Verbeke, K. (2015). Kvantifikácia in vivo produkcie mastných kyselín s krátkym reťazcom v hrubom čreve z inulínu. Živiny, 7(11), 8916–8929.

Cai, Y., Liu, W., Lin, Y., Zhang, S., Zou, B., Xiao, D., … Xie, Z. (2019). Zložené polysacharidy zlepšujú experimentálnu kolitídu moduláciou zloženia a funkcie črevnej mikroflóry. Journal of Gastroenterology and Hepatology, 34(9),1554–1562.

Chen, G. a Zhang, Q. (2020). Simultánna kvantifikácia voľných mastných kyselín a acylkarnitínov vo vzorkách plazmy pomocou dansylhydrazínového značenia a kvapalinovej chromatografie – trojitá kvadrupólová hmotnostná spektrometria. Analytické a bioanalytickéChémia, 412 (12), 2841–2849.

Chen, J., Lam, CT, Kong, AY, Zhang, WL, Zhan, JY, Bi, CW, … Tsim, KW (2014). Extrakt z plodu Ziziphus jujuba (jujuba) indukuje expresiu erytropoetínu prostredníctvom hypoxiou indukovateľného faktora-1 v kultivovaných Hep3B bunkách. PlantaMedica, 80 (17), 1622–1627.

Chen, J., Wang, F., Huang, S., Liu, X., Li, Z., Qi, A., … Li, S. (2019). Odvar z Jian-Pi-Yi-Shen zmierňuje renálnu anémiu u 5/6 nefrektomizovaných potkanov: Produkcia erytropoetínu prostredníctvom signalizácie hypoxiou indukovateľného faktora. Doplnková a alternatívna medicína založená na dôkazoch, 2019, 1–8.
Cheng, Y., Mai, Q., Zeng, X., Wang, H., Xiao, Y., Tang, L., ... Ding, H. (2019). Propionát zmierňuje záchvaty vyvolané pentyléntetrazolom, následné narušenie mitochondrií, nekrózu neurónov a neurologické deficity u myší. Biochemická farmakológia, 169, článok 113607.
Feng, YL, Cao, G., Chen, DQ, Vaziri, ND, Chen, L., Zhang, J., … Zhao, YY (2019). Mikrobióm-metabolomika odhaľuje črevnú mikroflóru spojenú s metabolitmi konjugovanými s glycínom a metabolizmom polyamínov pri chronickom ochorení obličiek. Cellular and Molecular Life Sciences, 76 (24), 4961–4978.
Garrido, P., Ribeiro, S., Fernandes, J., Vala, H., Bronze-da-Rocha, E., Rocha-Pereira, P., … Reis, F. (2015). Dysmetabolizmus železa a hepcidínu, anémia a renálna hypoxia, zápal a fibróza v modeli zvyškových obličiek potkana. PLoS ONE, 10(4), článok e124048.
Higashi, T. a Ogawa, S. (2016). Izotopovo kódované ESI zosilňujúce derivatizačné činidlá pre diferenciálnu analýzu, kvantifikáciu a profilovanie metabolitov v biologických vzorkách pomocou LC/MS: Prehľad. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 130, 181–193.
Ji, X., Hou, C., Gao, Y., Xue, Y., Yan, Y., & Guo, X. (2020). Metagenomická analýza modulačných účinkov jujuby (Ziziphus jujuba Mill.) polysacharidov na črevnú mikrobiotu na myšom modeli kolorektálneho karcinómu. Food & Function, 11 (1), 163–173.
Ji, X., Hou, C., Yan, Y., Shi, M., & Liu, Y. (2020). Porovnanie štruktúrnej charakterizácie a antioxidačnej aktivity polysacharidov z ovocia jujuba (Ziziphus jujuba Mill.). International Journal of Biological Macromolecules, 149, 1008–1018.

Ji, X., Hou, C., Zhang, X., Han, L., Yin, S., Peng, Q., … Wang, M. (2019). Mikrobiometabolomická analýza vplyvu Zizyphus jujuba cv. Spotreba polysacharidov Muzao u myší s kolorektálnym karcinómom fekálnej mikrobioty a metabolitov.International Journal of Biological Macromolecules, 131, 1067–1076.

Ji, X., Peng, Q., Yuan, Y., Shen, J., Xie, X., & Wang, M. (2017). Izolácia, štruktúry a bioaktivity polysacharidov z ovocia jujuba (Ziziphus jujuba Mill.): Prehľad. Chémia potravín, 227, 349–357.
Jiang, N., Zhao, H., Han, Y., Li, L., Xiong, S., Zeng, L., … Sun, L. (2020). HIF-1 zlepšuje tubulárne poškodenie pri diabetickej nefropatii prostredníctvom HO-1-sprostredkovanej kontroly mitochondriálnej dynamiky. Bunková proliferácia, 53(11), článok e12909.
Kapitsinou, PP, Liu, Q., Unger, TL, Rha, J., Davidoff, O., Keith, B., … Haase, VH (2010). Hepatálny HIF-2 reguluje erytropoetické odpovede na hypoxiu pri renálnej anémii. Krv, 116 (16), 3039–3048.
Kelly, CJ, Zheng, L., Campbell, EL, Saeedi, B., Scholz, CC, Bayless, AJ, … Colgan, SP (2015). Presluchy medzi mastnými kyselinami s krátkym reťazcom odvodeným od mikrobioty a črevným epitelom HIF zosilňujú funkciu tkanivovej bariéry. Cell Host & Microbe, 17 (5), 662-671.
Koh, A., De Vadder, F., Kovatcheva-Datchary, P., & B¨ ackhed, F. (2016). Od vlákniny k fyziológii hostiteľa: Mastné kyseliny s krátkym reťazcom ako kľúčové bakteriálne metabolity. Cela, 165(6), 1332–1345.
Lakshmanan, AP, Al, ZM, Ali, BH a Terranegra, A. (2021). Vplyv prebiotickej akáciovej gumy na zloženie črevného mikrobiómu u potkanov s experimentálnym chronickým ochorením obličiek. Biomedicína & farmakoterapia, 133, článok
110992.
Lam, C., Chan, PH, Lee, P., Lau, KM, Kong, A., Gong, A., … Tsim, K. (2016). Chemické a biologické hodnotenie bylinných odvarov obsahujúcich jujubu (Ziziphus jujuba): Indukcia expresie erytropoetínu v kultúrach. Journal of Chromatography BAnalytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences, 1026, 254–262.
Lappin, TR a Lee, FS (2019). Aktualizácia mutácií v dráhe HIF: EPO a ich úloha pri erytrocytóze. Krvné recenzie, 37, článok 100590.
LeBlanc, JG, Chain, F., Martín, R., Bermúdez-Humaran, ´ LG, Courau, S., & Langella, P. (2017). Priaznivé účinky na energetický metabolizmus hostiteľa mastných kyselín a vitamínov s krátkym reťazcom produkovaných komenzálnymi a probiotickými baktériami. Microbial Cell Factories, 16 (1), 79.
Li, L., Ma, L., & Fu, P. (2017). Mastné kyseliny s krátkym reťazcom pochádzajúce z črevnej mikrobioty a ochorenia obličiek. Drug Design Development and Therapy, 11, 3531-3542.
Li, L. a Shi, JY (2013). Analýza polysacharidových a lipidových zložiek kôry cinnamomi pomocou GC-MS. Zhong Yao Cai, 36 (4), 578–580.
Liu, G., Liu, X., Zhang, Y., Zhang, F., Wei, T., Yang, M., … Zhao, Z. (2015). Hepatoprotektívne účinky polysacharidov extrahovaných zo Zizyphus jujube cv. Huanghetanzao. International Journal of Biological Macromolecules, 76, 169–175.

Locatelli, F., Fishbane, S., Block, GA a Macdougall, IC (2017). Zameranie na hypoxiu indukovateľné faktory na liečbu anémie u pacientov s chronickým ochorením obličiek. American Journal of Nephrology, 45 (3), 187–199.

Locatelli, F., Hannedouche, T., Fishbane, S., Morgan, Z., Oguey, D., & White, WB (2019). Kardiovaskulárna bezpečnosť a úmrtnosť všetkých príčin metoxypolyetylénu

Glykol-epoetín beta a iné látky stimulujúce erytropoézu pri anémii CKD: Randomizovaná štúdia noninferiority. Klinický časopis Americkej nefrologickej spoločnosti: CJASN, 14(12), 1701–1710.
Maxwell, P. (2003). HIF-1: Systém odozvy kyslíka s osobitným významom pre obličky. Journal of the American Society of Nephrology, 14(11), 2712–2722.
Meijers, BK, & Evenepoel, P. (2011). Os črevo-obličky: indoxylsulfát, p-krezylsulfát a progresia CKD. Nefrologická dialyzačná transplantácia, 26 (3), 759–761.
Mikami, D., Kobayashi, M., Uwada, J., Yazawa, T., Kamiyama, K., Nishimori, K., … Iwano, M. (2020). Mastné kyseliny s krátkym reťazcom zmierňujú adenínom indukované chronické ochorenie obličiek prostredníctvom dráh FFA2 a FFA3. Biochimica Biophysica Acta-Molecular and Cell Biology Lipids, 1865(6), článok 158666.
Morton, DB a Griffiths, PH (1985). Pokyny na rozpoznávanie bolesti, strachu a nepohodlia u pokusných zvierat a hypotéza na posúdenie. Veterinárny záznam, 116(16), 431–436.
Panjeta, M., Tahirovi´c, I., Sofi´c, E., Cori´´c, J., & Derviˇsevi´c, A. (2017). Interpretácia hladín erytropoetínu a hemoglobínu u pacientov s rôznymi štádiami chronického ochorenia obličiek. Journal of Medical Biochemistry, 36(2), 145–152.
Pappa, M., Dounousi, E., Duni, A., & Katopodis, K. (2015). Menej známe patofyziologické mechanizmy anémie u pacientov s diabetickou nefropatiou. Medzinárodná urológia a nefrológia, 47(8), 1365–1372.
Sakashita, M., Tanaka, T. a Nangaku, M. (2019). Inhibítory hypoxiou indukovateľného faktora-prolylhydroxylázovej domény na liečbu anémie pri chronickom ochorení obličiek. Príspevky k nefrológii, 198, 112–123. https://doi.org/10.1159/000496531.
Schodel, ¨ J. a Ratcliffe, PJ (2019). Mechanizmy signalizácie hypoxie: Nové implikácie pre nefrológiu. Nature Reviews Nephrology, 15(10), 641–659.
Tako, E., Glahn, RP, Knez, M., & Stangoulis, JC (2014). Účinok pšeničných prebiotík na črevnú bakteriálnu populáciu a stav železa u brojlerových kurčiat s nedostatkom železa. Výživový časopis, 13, 58.
Tang, WH, Wang, Z., Kennedy, DJ, Wu, Y., Buffa, JA, Agatisa-Boyle, B., … Hazen, SL (2015). Dráha trimetylamín-N-oxidu závislá od črevnej mikrobioty (TMAO) prispieva k rozvoju renálnej insuficiencie a riziku úmrtnosti pri chronickom ochorení obličiek. Výskum cirkulácie, 116 (3), 448–455.
Thavarajah, S. a Choi, MJ (2019). Použitie činidiel stimulujúcich erytropoézu u pacientov s CKD a rakovinou: klinický prístup. American Journal of Kidney Diseases, 74 (5), 667–674.
Wang, F., Yu, H., Huang, S., Zheng, L., Zheng, P., Zhang, S., … Chen, J. (2020). Jian-PiYi-Shen reguluje expresiu EPO a proteínu recyklujúceho železo u anemických potkanov s chronickým ochorením obličiek: Akumulácia hypoxiou indukovateľného faktora-2 prostredníctvom signalizácie ERK. Doplnková a alternatívna medicína založená na dôkazoch, 2020, 8894257.
Wang, S., Lv, D., Jiang, S., Jiang, J., Liang, M., Hou, F., … Chen, Y. (2019). Kvantitatívne zníženie mastných kyselín s krátkym reťazcom, najmä butyrátu, prispieva k progresii chronického ochorenia obličiek. Klinická veda, 133 (17), 1857–1870.
Webster, AC, Nagler, EV, Morton, RL, & Masson, P. (2017). Chronické ochorenie obličiek. Lancet (Londýn, Anglicko), 389 (10075), 1238–1252.
Xie, X., Yang, X., Wu, J., Ma, J., Wei, W., Fei, X., … Wang, M. (2020). Trib1 prispieva k zotaveniu z akútneho poškodenia obličiek vyvolaného ischémiou/reperfúziou reguláciou polarizácie renálnych makrofágov. Frontiers in Immunology, 11, 473.
Xu, M., Nagati, JS, Xie, J., Li, J., Walters, H., Moon, YA, … Garcia, JA (2014). Acetátový spínač reguluje stresovú erytropoézu. Nature Medicine, 20(9), 1018–1026.
Yue, Y., Wu, S., Li, Z., Li, J., Li, X., Xiang, J., … Ding, H. (2015). Divoké polysacharidy z jujuby chránia pred experimentálnym zápalovým ochorením čriev tým, že umožňujú zvýšenú funkciu črevnej bariéry. Food & Function, 6 (8), 2568–2577.

Zhao, S., & Li, L. (2018). Značenie izotopov dansylhydrazínu LC-MS pre komplexné profilovanie submetabolómov karboxylových kyselín. Analytical Chemistry, 90(22), 13514-13522.

Zheng, L., Chen, S., Wang, F., Huang, S., Liu, X., Yang, X., … Chen, J. (2020). Výrazné reakcie črevnej mikroflóry na odvar z Jian-Pi-Yi-Shen sú spojené so zlepšenými klinickými výsledkami u 5/6 nefrektomizovaných potkanov. Hranice farmakológie, 11, 604.