Mahanimbín zlepšil pamäťové deficity súvisiace so starnutím u myší prostredníctvom zvýšeného cholinergného prenosu a potlačeného oxidačného stresu, hladín amyloidu a neurozápalu, časť 2

2.6. Hodnotenie hladín malondialdehydu (MDA) a glutatiónu (GSH).

Pomocou komerčne dostupných súprav sa hladiny MDA a GSH analyzovali vo vzorkách mozgu (Cayman Chemical Company, Ann Arbor, MI, USA).

Keďže veda a technika neustále napredujú, vedci sa snažia odhaliť tajomstvá záhadných a dôležitých ľudských psychologických aktivít, akými sú pamäť, myslenie a vedomie. Spomedzi nich sa štúdium vzoriek mozgu považuje za oblasť veľkého záujmu, pretože nám môže pomôcť hlbšie pochopiť vzťah medzi pamäťou a mozgom.

Kliknite na vedieť doplnky na zlepšenie pamäte

Po prvé, čo je vzorka mozgu? Jednoducho povedané, ide o metódu zachytávania, uchovávania a analýzy neurónov (mozgových buniek) a ich spojení v mozgu. Laicky povedané, je to ako mapa mozgu, ktorá dokáže zobraziť prepojenia a funkcie medzi rôznymi oblasťami.

Ďalej si povieme niečo o vzťahu medzi vzorkami mozgu a pamäťou. Vedecký výskum ukázal, že naša pamäť úzko súvisí so štruktúrou mozgu. Keď sa učíme nové poznatky, v mozgu sa vytvárajú nové neurónové spojenia a tieto spojenia sa časom upevňujú. Prostredníctvom štúdia vzoriek mozgu vedci usilovne pracujú na štúdiu týchto mozgových spojení a snažia sa pochopiť, ako prostredníctvom nich zlepšiť učenie a pamäť.

Okrem toho môžu vedci pomocou rozboru vzoriek mozgu zistiť aj zaujímavé veci. Zistili napríklad, že hipokampus v ľudskom mozgu je oblasťou úzko súvisiacou s pamäťou. Je to preto, že hipokampus má v ľudskom mozgu dôležitú funkciu na premenu informácií z krátkodobej pamäte na dlhodobú.

Preto hodnota výskumu vzorky mozgu nespočíva len v tom, že nám pomôže lepšie pochopiť vzťah medzi mozgom a pamäťou, ale tiež nám pomôže odhaliť základné príčiny porúch pamäti alebo kognitívnych chorôb, a tým podporiť liečbu a prevenciu súvisiacich chorôb.

Nakoniec by sme mali pozitívne vnímať pomoc výskumu pamäte na vzorkách mozgu. Hoci je ešte stále veľa vedeckých problémov, ktoré treba vyriešiť, s neustálym zlepšovaním vedy a techniky veríme, že v budúcnosti dôjde k ďalším objavom. Tešme sa spolu do budúcnosti a tešme sa, že prostredníctvom vedeckého výskumu urobíme naše mozgy inteligentnejšie! Je vidieť, že musíme zlepšiť pamäť. Cistanche môže výrazne zlepšiť pamäť, pretože Cistanche má antioxidačné, protizápalové účinky a účinky proti starnutiu, ktoré môžu pomôcť znížiť oxidačné a zápalové reakcie v mozgu, a tým chrániť zdravie nervového systému. Okrem toho môže Cistanche tiež podporovať rast a opravu nervových buniek, čím zvyšuje konektivitu a funkciu neurónových sietí. Tieto účinky môžu pomôcť zlepšiť pamäť, schopnosť učenia a rýchlosť myslenia a môžu tiež zabrániť výskytu kognitívnej dysfunkcie a neurodegeneratívnych ochorení.

Hladiny MDA a GSH sa merali v nanomóloch/miligramoch proteínu a v mikromóloch/miligramoch proteínu. Na odhadnutie obsahu proteínov v mozgových tkanivách sa použila Bradfordova technika.

2.7. Odhad aktivity acetylcholínu (ACh) a acetylcholínesterázy (AChE).

Hladiny ACh a AChE v mozgovom homogenáte sa analyzovali pomocou komerčne dodávaných súprav (BioAssay System, Hayward, CA, USA), ktorými boli súprava EnzyChromTM AcetylcholineAssay kit a QuantiChromTM Acetylcholinesterase Assay kit, v danom poradí.

Intenzita tvorby farby bola detegovaná v čítačke mikrodoštičiek pri 570 a 412 nm. Hladina získanej ACh bola vyjadrená ako uM, zatiaľ čo aktivita AChE bola vyjadrená ako U/L.

2.8. Meranie hladín -amyloidu

Na vyhodnotenie hladín A 1-40 a A 1-42 v mozgových homogenátoch sa použili súpravy ELISA od Cloud Clone Corp (Katy, TX, USA). Na meranie tvorby farby sa použila čítačka mikrodoštičiek nastavená na 450 nm.

Koncentrácia A 1-40 a A 1-42 vo vzorke bola nepriamo úmerná intenzite farby. Výsledky boli vyjadrené v pg/ml celkového proteínu.

2.9. Hodnotenie aktivity -sekretázy (BACE-1) v mozgu myši

Aktivita BACE{0}} v homogenáte sa kvantifikovala pomocou komerčne dostupnej súpravy (SensoLyte® -Secretase Assay Kit od AnaSpec, Fremont, CA, USA). Detekcia súpravy je založená na peptide, ktorý je štiepený BACE-1 a signál je detekovaný pomocou aspektrofotometra s excitáciou/emisiou pri 490/520 nm.

2.10. Meranie celkovej aktivity cyklooxygenázy (COX).

Aktivita celkového COX v mozgovom homogenáte sa odhadla pomocou súpravy ELISA (Cayman Chemical Company, Ann Arbor, MI, USA). Tvorba farby bola priamo úmerná celkovej aktivite COX. Na odčítanie absorbancie pri 590 nm sa použila čítačka mikrodoštičiek.

2.11. Génová expresia BACE-1 a COX-2

Expresia BACE{0}} a COX{1}} v izolovanej mozgovej RNA sa analyzovala pomocou RT-PCR. Tri hlavné zahrnuté kroky boli: extrakcia RNA, konverzia RNA tocDNA a polymerázová reťazová reakcia v reálnom čase (RT-PCR).

Všetky kroky zahŕňali súpravy poskytnuté spoločnosťou Qiagen Valencia, CA, USA. Najprv bola RNA extrahovaná zo vzorky mozgu zachovanej v RNA. V tomto kroku sa približne 100 mg vzorky mozgového tkaniva washomogenizovalo pomocou TissueRuptor v 1 ml lyzačného činidla QIazol a inkubovalo sa 5 minút pri teplote miestnosti.

Zmes mozgového lyzátu a lyzačného činidla QIazol sa pridala s chloroformom a intenzívne sa pretrepávala 15 s, po čom nasledovala inkubácia pri izbovej teplote počas 2–3 minút.

Zmes sa centrifugovala pri 12, 000 x g počas 15 minút pri 4 °C a tri fázy vytvorili bezfarebnú fázu (horná fáza), ktorá pozostávala z RNA a zhromaždila sa s 1 objemom 70 % etanolu pridaného do to.

Ďalej sa 700 ul vzorky prenieslo do rotačnej kolóny a centrifugovalo sa pri teplote miestnosti pri 8000 x g počas 15 s; prietok bol vyradený. Po pridaní 700 ul pufra RW1 (dodávaného v súprave) a centrifugácii počas 15 s pri 8000 x g sa pretečený roztok zahodil. Krok pokračoval pridaním 500 ul pufra RPE (dodávaného v súprave). a centrifugácia počas 15 s pri 8000 x g.

Tento krok sa opakoval dvakrát, aby sa premyla akákoľvek organická kontaminácia v RNA. Nakoniec sa RNA eluovala pridaním 50 ul vody bez RNázy a centrifugovala sa 1 minútu pri 8000 x g.

Koncentrácia RNA bola meraná pomocou ananodropu (nanodrop 2000c, Thermofisher Scientific, Waltham, MA, USA). Extrahovaná RNA sa potom premenila na cDNA, ktorá sa použila na uskutočnenie RT-PCR.

Najprv sa pridalo 14 ul templátovej RNA so 6 ul master mixu reverznej transkripcie (1 ul reverznej transkriptázy Quantiscript, 4 ul tlmivého roztoku Quantiscript RT, 1 ul zmesi primérov RT). Po zmiešaní sa inkuboval 15 minút pri 42 °C, nasledovala inkubácia pri 95 °C počas 3 minút, aby sa inaktivovala reverzná transkriptáza Quantiscript.

Vytvoreným produktom bola cDNA a nakoniec sa uskutočnila RT-PCR. Podmienky RT-PCR boli fixované na 95 °C počas 5 minút, po ktorých nasledovalo 40 cyklov pri 95 °C počas 10 minút a 60 °C počas 30 minút.

Expresia génov BACE-1 a COX-2 bola kvantifikovaná a normalizovaná voči dvom génom pre domácnosť (-aktin a GAPDH). Priméry nukleotidových sekvencií boli založené na myšacom BACE-1 (predné50-GCATGATCATTGGTGGTATC-30: reverzné 50-CCATCTTGAGATCTTGAC-CA-30) ​​a COX-2 (dopredu 50-GTGTGCGACATACTCAAGCAGGA) cDNA sekvencie. -30: spätné 50-TGAAGTGGTAACCGCTCAGGTG-30), GAPDH (dopredu 50-TGACAGGATGCAGAAGGAGA-30: spätné 50-GCTGGAAGGTGGACAGTGAG-30) a -aktín (dopredu 50-TGACAGGATGCAGAAGGAGA-30: spätne 50-GCTGGAAGGTGGACAGTGAG-30).

Boli získané fluorescenčné merania a na ich vyhodnotenie sa použil softvér Rotor-Gene 6000 (Qiagen, Hilden, Nemecko).

Výsledky boli prezentované ako hladiny expresie po normalizácii na housekeeping gén, ktorým boli B-aktín a GAPDH pomocou komparatívneho CT (prahového cyklu). Na výpočet génovej expresie vzorky sa použila rovnica (1).

Hodnota CT každej vzorky bola získaná na základe štandardnej krivky, ktorá bola vytvorená pre každý gén (cieľový gén a referenčný gén).

∆∆CT=∆CT vzorka − ∆CT kontrola (1)

kde

∆CT vzorka: CT hodnota cieľového génu − CT hodnota referenčného génu

∆CT kontrola: CT hodnota cieľového génu − CT hodnota referenčného génu

2.12. Štatistická analýza

Experimentálne údaje boli prezentované ako priemer ± SEM. Na kategorizáciu štatistických variácií sa použili jednosmerný postup ANOVA (Graph Pad verzia 9, GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, USA) a Tukey-Kramerpost hoc test. Významné bolo definované ako hodnota pravdepodobnosti 0,05.

3. Výsledky

3.1. Pamäť vylepšená mahanimbínom u starých myší

Priestorové učenie a pamäťová schopnosť mahanimbínu v myšom modeli sa skúmala pomocou testu MWM. Merala sa úniková latencia (EL), úniková vzdialenosť (ED) a čas strávený v cieľovom kvadrante.

Okrem toho sa lokomotorická aktivita posudzovala aj na základe priemernej rýchlosti plávania myší. Obrázok 2A ukazuje, že staršia kontrolná skupina mala výrazne dlhšiu EL odo dňa 1 dnes 3 (22.05 ± 1,70 s, 21,35 ± 1,85 s, 19,96 ± 2,34 s p < 0,001 v porovnaní s mladou kontrolou (12,75 ± 1,30, 10,12 ± 0,98, 7,60 ± 1,31; v uvedenom poradí).

Zistilo sa, že staré myši preukázali v MWMteste značný deficit funkcie učenia a pamäte. Avšak perorálna liečba rôznymi dávkami (1 a 2 mg/kg) mahanimbínu ukázala zvrátenie vyššie uvedených zmien v EL u starých myší.

Hodnoty EL pre skupinu s 1 mg/kg mahanimbínu boli 22.01 ± 1,60 s, 15,88 ± 1,54 s (p < 0.01) a8 0,26 ± 0,93 s (p < 0.001) pre 1., 2. a 3. deň v porovnaní s kontrolou veku, zatiaľ čo EL hodnoty pre skupinu mahanimbínu 2 mg/kg boli 16.09 ± 0,33 s (p < 0,05), 17,14 ± 0,57 s (p < 0,05), 10,57 ± 0.86 s (p < 0,01), v tomto poradí, keď je paralelný s kontrolou starnutia. V deň 3 sa EL oboch skupín (1 a 2 mg/kg) mahanimbínu významne nelíšili od mladej kontroly.

Obrázok 2. Vplyv mahanimbínu na (A) únikovú latenciu, čas potrebný na nájdenie skrytej plošiny. (B) Úniková vzdialenosť, vzdialenosť prejdená od východiskového bodu do nájdenia skrytej plošiny; (C) priemerná rýchlosť, rýchlosť plávania zvieraťa na nájdenie skrytej plošiny; (D) test sondy, percento času starých myší strávených v cieľovom kvadrante pomocou Morrisovho testu vo vodnom bludisku. Pri mahanimbíne u starších myší došlo k významnému zlepšeniu únikovej latencie a únikovej vzdialenosti.

Okrem toho liečba zvýšila čas strávený v cieľovom kvadrante starých myší. Všetky údaje boli vyjadrené ako priemer ± SEM (n {{0}}). Jednosmerná ANOVA (deň 1: F(3,20)=11,74, p < 0.001, deň 2: F(3,20)=17.38,p < 0.001 a deň 3: F(3,2{{69 }})=14.88, p < 0.001 pre únikovú latenciu 1. deň: F(3,20) {{; 26}},22, p < 0,001,deň 2: F(3,20)=28,62, p < 0,001 a deň 3: F(3,20) {{40 }},15, p < 0,001 pre 1. deň: F(3,20)=1,939, p > 0,05, 2. deň: F(3,20)=3,467, p > 0,05 a deň 3: F(3,20)=2,497, p > 0,05 pre priemernú rýchlosť F(3,20)=7,185, p < 0,01 pre test sondy, po ktorom nasleduje; Tukey-Kramerov test viacnásobného porovnania.** p < 0,01 a *** p < 0,001 v porovnaní s mladou kontrolou, # p < 0,05, ## p < 0,01 a ### p < 0,001 v porovnaní s vekovou kontrolou.

Obrázok 2B predstavuje účinok mahanimbínu na vzdialenosť prejdenú od východiskového bodu do nájdenia skrytej plošiny. Veková kontrolná skupina prešla najdlhšiu vzdialenosť, kým našla skrytú plošinu v dňoch 1, 2 a 3 (4,79 ± 0,73 m, 4,34 ± {{10}},11 m a 4,38 ± 0,59 m; p < {{20}}.001, keď súvisí s mladou kontrolou (1,36 ± 0,31 m, 1,35 ±); 0,24 m a 0,78 ± 0,14 m;

Staršie myši, ktorým bol podávaný 1 mg/kg mahanimbínu, významne znížili ED (2,17 ± 0,11 m (p < 0.01), 2,10 ± { {13}},24 m (p < 0.001), 0,89 ± 0,18 (p < 0,001 v uvedenom poradí) pre deň 1 až deň 3 v súlade s vekovou kontrolou.

Významný paralelný pokles ED bol pozorovaný u myší, ktorým sa podávalo 2 mg/kg mahanimbínu počas 1., 2. a 3. dňa (2,43 ± 0,28 (p < 0.01) , 2,78 ± 0,32 (p < 0.001), 1,47 ± 0,30 (p < 0,001);

Pokiaľ ide o priemerné rýchlosti plávania počas úlohy, medzi skupinami neboli pozorované žiadne rozdiely (obrázok 2C). To naznačuje, že mahanimbín nezmenil žiadnu lokomotorickú aktivitu súvisiacu s motorickou funkciou u starých myší.

Po 24 hodinách skutočnej úlohy sa uskutočnila testovacia relácia sondy (deň 30), aby sa vyhodnotilo zachovanie pamäti zvierat. Veková kontrolná skupina (obrázok 2D) strávila menej času v cieľovom kvadrante (10.10 ± 1,14 % (p < 0,001)) a vykazovala výrazne skrátený čas strávený v cieľovom kvadrante v porovnaní s mladá kontrola (19,53 ± 2,56 %), zatiaľ čo u starých myší liečených 1 mg/kg (20,27 ± 4,84 %, p < 0,01) a 2 mg/kg (17,85 ± 1,56 %, p < 0,05) mahanimbínu perorálnou sondou dlhší čas strávený v cieľovom kvadrante v porovnaní s vekovou kontrolou.

3.2. Účinok mahanimbínu na hladiny MDA a GSH v mozgu staršej myši

Hladiny MDA vo vekovej kontrole (obrázok 3A) boli podstatne vyššie (11,54 ± 0,88 µM;p < 0.001) vo vzťahu k mladej kontrole (4,37 ± 0,09 uM). Zvýšenie hladiny MDA v mozgovom homogenáte starých myší odrážalo vyššiu aktivitu LPO, čo naznačovalo zvýšenie oxidačného stresu v mozgovom tkanive.

Naopak, podávanie mahanimbínu (1 mg/kg, po) významne znížilo hladiny MDA v mozgu u starých myší (7,56 ± 0,35 µM;p < 0.001) v porovnaní do staršej kontroly. Pri 2 mg/kg mahanimbínu (9,65 ± 0,51 uM) neboli zaznamenané žiadne významné zmeny.

Množstvo glutatiónu (GSH) v mozgovom homogenáte naznačovalo antioxidačný potenciál mahanimbínu. Štatistická analýza GSH (obrázok 3B) ukázala významný útlm medzi starou kontrolnou skupinou (0.0028 ± 0.0004 µmol/ mg; p < 0,001), keď sú spojené s mladou kontrolou (0,0447 ± 0,0029 umol/mg).

Táto štúdia tiež zistila, že liečba mahanimbínom (1 a 2 mg/kg, po) zvrátila hladinu GSH, ktorá bola výrazne vyššia (0.0372 ± 0.{{8} }{{10}}38 umol/mg, p < 0,001 a 0,0282 ± 0,0041 umol/mg, p < 0,001, v uvedenom poradí) v súlade s vekovou kontrolou.

3.3. Mahanimbín zlepšil cholinergnú aktivitu v mozgu staršej myši

Obrázok 4A ukazuje hladiny ACh v mozgu myši. ACh bol porovnateľne znížený (p < 0.001) u staršej kontroly (17,79 ± 1,54 µM) ako v prípade mladej kontroly (34,82 ± 0). 31 uM). Podávanie mahanimbínu (1 a 2 mg/kg) sa však významne zvýšilo (35,61 ± 0,85 uM, (p < 0,001); 39,42 ± 0,88 uM (p < 0,001); v uvedenom poradí) hladina ACh v mozgu spojená s vekovou kontrolou.

Obrázok 4B predstavuje účinok mahanimbínu proti aktivite ACHE v mozgu. Aktivita AChE vo vekovej kontrolnej skupine (204,80 ± 1,55 U/L) bola značne zvýšená (p < 0,001) v porovnaní s mladou kontrolou (51,06 ± 1,36 U/L).

Napriek tomu bola hladina AChE sugestívne inhibovaná liečbou 1 mg/kg (62.03 ± 4,64 U/l; p < 0,001) a 2 mg/kg (43,73 ± 4,76 U /L p < 0,001) mahanimbín, keď je spojený s kontrolou veku. Celkovo podávanie vysokej dávky mahanimbínu (2 mg/kg, po) prinieslo lepšie výsledky pre cholinergnú aktivitu, pretože zvýšilo hladinu ACh a potlačilo aktivitu AChE.

For more information:1950477648nn@gmail.com