Melanocytové aktivačné mechanizmy a racionálna terapeutická liečba solárnych lentigov

Abstrakt:Na charakterizáciu patobiológie solárnych lentigov (SL) analýzy semikvantitatívnou RT-PCR, Western blotting a imunohistochémia odhalili zvýšenú expresiu endotelínu (EDN)-1/endotelínových B receptorov (EDNBR), faktora kmeňových buniek (SCF )/c-KIT a tumor nekrotizujúci faktor (TNF) v epidermis lézie, čo kontrastuje so zníženou expresiou interleukínu (IL)1. Tieto zistenia silne podporujú hypotézu, že predchádzajúca opakovaná expozícia UVB spúšťa keratinocyty k nepretržitej produkcii TNF. TNF potom stimuluje sekréciu EDN a produkciu SCF autokrinným spôsobom, čo vedie k kontinuálnej melanogénnej aktivácii susedných melanocytov, čo spôsobuje SL. Klinická štúdia 36 pacientov s SL počas šiestich mesiacov liečených extraktom z M. Chamomilla so silnou schopnosťou zrušiť EDN1-indukované zvýšenie syntézy DNA a melanizácie ľudských melanocytov v kultúre odhalilo významné zlepšenie skóre pigmentu a farebné rozdiely vyjadrené ako L hodnoty. Ďalšia klinická štúdia s použitím atyrozinázainhibítor L-askorbát-2-fosfát 3 Na (ASP) preukázal, že hodnoty L na koži ošetrenej testovacím mliekom (6 percent APS) sa významne zvýšili v SL a na koži bez lézií s výrazne vyššou hodnotou ∆L v SL, keď v porovnaní s kožou bez lézií. Súčet týchto zistení silne naznačuje, že kombinovaná lokálna liečba s blokátormi signalizácie EDN atyrozinázainhibítory je žiaducou terapeutickou voľbou pre SL.

Kľúčové slová: solar lentigo; endotelín; faktor kmeňových buniek; keratinocytový rastový faktor; interleukín-1; faktor nekrózy nádorov; intracelulárna signalizácia; mobilizácia vápnika; blokátor signalizácie; M. chamomilla; askorbát-fosfát Na; bieliace činidlo; inhibítor tyrozinázy

Cistanche je inhibítor tyrozinázy.

Kliknutím zobrazíte cistanche účinky na inhibíciu tyrozinázy

1. Úvod

Najčastejšie sa vyskytujúcou epidermálnou hyperpigmentárnou poruchou v ázijskej koži sú slnečné lentigo (SLs), ktoré sa zvyčajne vyskytujú na tvári a na chrbte rúk. Na rozdiel od hyperpigmentácie vyvolanej UVB (UVB melanóza), ktorá v závislosti od veku subjektu vymizne v priebehu dvoch týždňov až niekoľkých mesiacov po prerušení expozície UVB, sa SL vyvinú na pokožke vystavenej slnku, najmä na tvári, a nikdy nezmizne v dôsledku možného poškodenia DNA v keratinocytoch vyvolaného opakovaným UVB ožiarením epidermis lézie. Vo všeobecnosti sú hyperpigmentárne poruchy všeobecne zamerané na antipigmentačné činidlá a zahŕňajú UVB-melanózu, SL a melazmu. Na základe frekvencie konečnej diagnózy u pacientov s rôznymi pigmentovými poruchami v Japonsku je najvyšší výskyt SL, ktorý sa vyskytuje približne u 60 percent všetkých pacientov s hyperpigmentárnymi poruchami, zatiaľ čo melazma a pozápalová hyperpigmentácia (vrátane UVB-melanózy) sa vyskytujú v len 5,2 percenta a 3,3 percenta pacientov [1]. To naznačuje, že SL sú prevládajúcim cieľom antipigmentačných činidiel pre ázijskú pokožku. Bolo však publikovaných málo prác o klinických účinkoch antipigmentačných činidiel na SL, pretože mnohé antipigmentačné činidlá slúžia akotyrozinázainhibítorov a nepredpokladá sa totyrozinázainhibícia by bola dostatočná na zlepšenie hyperpigmentácie SL. Okrem toho sa zdá ťažké racionálne navrhnúť účinnú terapeutickú lokálnu liečbu SL, pretože je málo známe o mechanizmoch aktivácie melanocytov v epidermis lézií. V tomto prehľadnom článku charakterizujeme patobiológiu SL podľa lokálnej liečby SL, pretože o mechanizmoch aktivácie melanocytov v epidermis lézií je známe len málo. V tomto prehľadovom článku charakterizujeme patobiológiu SL podľa známych melanogénnych parakrinných cytokínových sietí a na základe objavených mechanizmov aktivácie melanocytov v léziovej epiderme SL predstavujeme racionálne klinické prístupy pre lokálnu liečbu SL na zlepšenie hyperpigmentácie úrovni.

2. Klinické charakteristiky

SL sa klinicky vyvíjajú ako ploché, dobre ohraničené škvrny na koži rôznych farieb a veľkostí, ktoré sa často objavujú na tvári a na chrbte rúk (obrázok 1a) [2]. Histochémia SL lézií zafarbených Hemoxylínom a Eozínom odhalila miernu akantózu a pigmentáciu pozdĺž bazálnej bunkovej vrstvy (obrázok 1b) [2]. Pokiaľ ide o histopatologické znaky SL na tvári, existujú dva vzory: jeden vzor demonštroval sploštenú epidermis s bazálnou melanózou a druhý vzor ukázal epidermálnu hyperpláziu s predĺženými rete hrebeňmi zloženými z hlboko pigmentovaných bazaloidných buniek [3].

3. Mechanizmy aktivácie melanocytov v solárnom lentigu na základe melanogénnej parakrinnej cytokínovej siete

3.1. Počet melanocytov a expresia tyrozinázy

Hoci existujú určité argumenty o zvýšenom počte melanocytov v SL, imunohistochemická analýza s použitím melanocytovo špecifického markera MART-1 odhalila zvýšený počet melanocytov v solárnom lentigu [5–7]. Skutočná hustota melanocytov pozdĺž hranice medzi dermis a epidermis v SL je však podobná hustote v perilezionálnej kontrolnej koži v dôsledku zvýšenej proliferácie keratinocytov [7]. Imunohistochémia s použitím anti-tyrozinázaodhalil totyrozináza-pozitívne melanocyty boli významne 2-násobne zvýšené v epidermis lézií SL [4]. Génová analýza semikvantitatívnou RT-PCR odhalila, že hladina expresie mRNA tyrozinázy je v epidermis lézie významne 2,{5}}násobne zvýšená [4]. Vyššie uvedené zistenia podporujú možnosť, že v SL léziových melanocytoch existuje stimulácia proliferácie aj melanizácie. Preto sme predpokladali, že mierne proliferujúce keratinocyty v SL spúšťajú aktiváciu susedných melanocytov vylučovaním cytokínov stimulujúcich melanocyty.

3.2. Melanogénne parakrinné cytokínové siete

My a ďalšie skupiny sme objasnili, že medzi kožnými bunkami existuje niekoľko dôležitých melanogénnych parakrinných cytokínových sietí (obrázok 2). Ide najmä o endotelín (EDN)-1 [8–15], faktor membránových kmeňových buniek (mSCF) [16], proopiomelanokortín (POMC) [17–20], prostaglandín E2 [21], granulocytový makrofág faktor stimulujúci kolónie (GM-CSF) [22], základný fibroblastový rastový faktor [23], onkogén súvisiaci s rastom [24] a keratinocytový rastový faktor (KGF) [25,26] podieľajúci sa na interakciách keratinocyt/melanocyt a rozpustný SCF [27 ], hepatocytový rastový faktor (HGF) [8,10,27–29] a KGF [30] zapojené do interakcií fibroblast/melanocyt. Na základe objasnených melanogénnych parakrinocytokínových sietí vrátane ich zodpovedajúcich receptorov je dôležité určiť, ktoré melanogénne parakrinné cytokínové siete sú zahrnuté a sú špecificky aktivované in vivo v mechanizmoch hyperpigmentácie v epidermis lézií SL.

3.3. Hlavné parakrinné cytokíny a receptory zodpovedné za aktiváciu melanocytov v SL

Spomedzi vyššie uvedených melanogénnych cytokínov a ich zodpovedajúcich receptorov sme najprv určili úlohu základného fibroblastového rastového faktora (bFGF) a onkogénu súvisiaceho s rastom (GRO) v epidermis SL. Zistilo sa, že bázický FGF je nadmerne exprimovaný v ľudských keratinocytoch vystavených UVB, ktorých homogenáty mali zreteľný potenciál stimulovať melanogenézu a proliferáciu ľudských melanocytov v kultúre, hoci na melanogénnu stimuláciu sú v podstate potrebné kofaktory so schopnosťou zvyšovať hladiny cyklického AMP [23 ]. Našou výskumnou skupinou bol GRO identifikovaný ako melanogénny cytokín, ktorý hrá zásadnú úlohu pri hyperpigmentácii vyvolanej fenylazon-naftolom po jeho alergickej reakcii na hnedožltej koži morčiat [24,31]. Semikvantitatívna RT-PCR odhalila, že nedošlo k žiadnej zmene v hladinách génovej expresie bFGF a GRO v SL léziovej epidermis v porovnaní s nelézionovou epidermou [2]. V súlade s úrovňou expresie mRNA bFGF a GRO imunohistochémia odhalila, že neexistuje žiadny rozdiel v intenzite imunofarbenia s anti-bFGF (obrázok 1c, d) a anti-GRO (obrázok 1e, f) medzi léziami SL a bez lézií epidermis [2]. Tieto zistenia nenaznačovali žiadnu účasť bFGF alebo GRO ako vnútorných melanogénnych cytokínov pre mechanizmus aktivácie melanocytov v SL.

V biologickom mechanizme hyperpigmentácie indukovanej UVB žiarením je expresia EDN1, vazokonstrikčného peptidu pôvodne izolovaného z prasačích endotelových buniek [32], a mSCF [16] upregulovaná autokrinným spôsobom pôsobením UVB stimulovaného uvoľňovania interleukínu ( IL)-1 prostredníctvom tvorby reaktívnych foriem kyslíka (ROS) [15]. Tieto cytokíny spôsobujú, že susedné melanocyty zvyšujú svoju expresiu kritických enzýmov syntetizujúcich melanín, tyrozinázy [14,33], EDNBR [34] a melanozómového matrixového proteínu PMEL17 [34], ako aj enzýmov súvisiacich s proliferáciou, ako je cyklická závislá kináza (CDK)2 [34], ktoré vedú k hyperpigmentácii kože vystavenej UVB žiareniu. Na základe hlavných melanogénnych cytokínov, ktoré sa v podstate podieľajú na UVB-melanóze, sme ďalej určili úlohu EDN1 v mechanizme aktivácie melanocytov v epiderme SL. Charakterizácia úrovne expresie mRNA EDN1 v epiderme semikvantitatívnou RT-PCR analýzou ukázala, že došlo k výraznému zvýšeniu expresie v priemere o 3.{21}}-násobok v SL léziovej epiderme v porovnaní s neléznou epidermou [4]. V súlade so zvýšenou hladinou génovej expresie EDN1 došlo k zvýšenému imunofarbeniu anti-EDN1 v celej SL léziovej epidermis (obrázok 1g,h) [4].

Okrem EDN1 sme ďalej určili úlohu receptorov EDN v mechanizme aktivácie melanocytov, ktorý je základom SL. Väzba EDN na jej receptor je prvým krokom v hlavnej parakrinnej línii medzi keratinocytmi a melanocytmi, ktorá upreguluje pigmentáciu kože [11,14,35,36]. EDN receptory sú sedem-transmembránové receptory spojené s G-proteínom s dvoma izoformami (A a B), ktoré interagujú špecificky s EDN1 a so všetkými formami EDN (EDN1, EDN2 a EDN3), v tomto poradí [37]. Pokiaľ ide o inhibičné účinky antagonistov receptora EDN na proliferáciu ľudských melanocytov v kultúre stimulovanú EDN, významný inhibičný účinok sa vyskytol iba v prítomnosti BQ 788, antagonistu receptora anendotelínu B (EDNBR), ale nie BQ123 alebo BQ610, endotelínu Antagonista receptora (EDNAR) [9], ktorý naznačuje, že signalizácia receptora EDN1/EDN je sprostredkovaná prostredníctvom EDNBR. Semikvantitatívna RT-PCR analýza expresie mRNA EDNBR odhalila, že spomedzi rôznych typov kožných buniek sú melanocyty jediným podstatným typom buniek exprimujúcich EDNBR. Keďže sme už dokázali, že EDN1 vylučovaný keratinocytmi spúšťa aktiváciu intracelulárnej proteínkinázy C (PKC) prostredníctvom EDNBR [35], určili sme, či úroveň expresie EDNBR bola zvýraznená aj v melanocytoch v SL epidermis lézie. Semikvantitatívna RT-PCR analýza EDNBRmRNA v epidermis SL preukázala výrazne zvýšenú expresiu v priemere 6,{23}}násobne v SL epidermis lézií [4]. V súlade so zvýšenou expresiou EDNBR mRNA došlo k zvýšenému imunofarbeniu anti-EDNBR lokalizovaným v melanocytoch v léziovej SL epidermis (obrázok 1i,j) [4]. Súčet týchto zistení silne naznačuje koordinované zvýšenie expresie EDN1 a jeho receptorovej väzby v epidermis lézií SL.

Na základe hlavných melanogénnych cytokínov zapojených do UVB-melanózy sme ďalej určili úlohu SCF v mechanizme aktivácie melanocytov v léziovej SL epidermis. Už sme uviedli, že UVB expozícia kultivovaných ľudských keratinocytov, ako aj ľudskej epidermy významne stimuluje expresiu SCF na úrovni génu aj proteínu [15,16]. Semikvantitatívna RT-PCR analýza SCF mRNA v epidermis SL preukázala výrazne zvýšenú expresiu v priemere o 3,5{5}}-násobok v SL epidermis s léziami v porovnaní s epidermis bez lézií [2]. Western blotting na SCF na koži šiestich pacientov s SL preukázal, že došlo k významnému zvýšeniu priemeru 1,{9}}násobne v proteíne SCF v epidermis SL lézie v porovnaní s epidermou bez lézie [2].

V súlade so zvýšenou hladinou génovej a proteínovej expresie SCF došlo k zvýšenému imunofarbeniu s anti-SCF v celej SL epidermis lézie (obrázok 1k,l) [2]. Bol tu argument o tom, či je SCF upregulovaný na úrovni proteínu v lezionálnej epidermis rozpustným typom alebo typom viazaným na membránu. Ak je v epidermis upregulovaný SCF prepúšťajúci bazálnu membránu, žírne bunky prítomné v derme by sa mali aktivovať, aby proliferovali a zvýšili ich počet. Keďže farbenie toluidínovou modrou v SL nepreukázalo žiadne zvýšenie počtu žírnych buniek v dermis SL lézie [2], je pravdepodobné, že typ SCF upregulovaný v SL je typ viazaný na membránu.

Okrem SCF sme ďalej určili úlohu receptora SCF c-KIT v mechanizme aktivácie melanocytov, ktorý je základom SL. Už sme uviedli, že UVB expozícia kultivovaných ľudských melanocytov, ako aj ľudskej epidermy významne stimuluje expresiu c-KIT na úrovni génu aj proteínu [15,38]. Okrem toho pri UVB stimulovanej pigmentácii hnedožltej kože morčiat blokujúca protilátka proti c-KIT významne zrušila zvýšený počet dopa-pozitívnych melanocytov, ako aj hyperpigmentáciu v skorej fáze procesu pigmentácie vyvolanej UVB [16]. , čo silne naznačuje, že väzba SCF na c-KIT hrá dôležitú úlohu pri UVB-indukovanej aktivácii melanocytov, čo vedie k hyperpigmentácii. Súčasne so zvýšenou expresiou SCF na úrovni génu a proteínu sa úroveň génovej expresie jeho c-KIT receptora tiež zvýšila v priemere 2.14-krát v SL epidermis lézie [2]. V súlade so zvýšenou expresiou c-KIT mRNA došlo k zvýšenému imunofarbeniu s c-KIT protilátkou lokalizovanou v melanocytoch v léziovej SL epidermis (obrázok 1m,n) [2]. To naznačuje, že existuje koordinované zvýšenie expresie SCF a jeho receptora c-KIT v léziovej SL epidermis.

Na druhej strane iné skupiny predpokladali, že keratinocytový rastový faktor (KGF)/receptor KGF (KGFR) hrá dôležitú úlohu pri iniciácii tvorby SL a pri zvýšenej pigmentácii iba v epidermis skorších štádií SL [25]. V epidermis lézií [30] a/alebo derme [25] SL je expresia KGF upregulovaná iba na úrovni imunitného zafarbenia, hoci sú potrebné ďalšie štúdie o expresii jeho génov a proteínov, aby bolo možné urobiť konečné závery o tom, že ide o vnútorný cytokín spôsobujúci SL. Hoci je známe, že IL-1 spôsobuje, že keratinocyty stimulujú produkciu KGF, zostáva nejasné, ako je expresia KGF upregulovaná v epidermis lézií, kde je expresia IL-1 skôr regulovaná smerom nadol [2]. Samozrejme, malo by sa určiť, či má TNF (ktorý je v epidermis lézie upregulovaný) schopnosť stimulovať produkciu KGF. Pretože expresia KGF v koži je primárne obmedzená na dermálne fibroblasty, je pravdepodobné, že zvýšená expresia KGF dermálnymi fibroblastmi v derme lézií SL [25] je spojená so zvýšenou proliferáciou keratinocytov a stimulovanou melanogenézou. Je teda pravdepodobné, že dermálne fibroblasty sú trvalo aktivované vystavením UV žiareniu, aby sa uvoľnil KGF, ktorý pôsobí priamo alebo nepriamo na keratinocyty na moduláciu expresie SCF, čo prispieva k hyperpigmentácii SL [25].

Ďalej sme určili biologické mechanizmy, ktorými je sekrécia EDN1 upregulovaná v epidermis lézií SL. Je dobre známe, že biologické faktory spojené so stimuláciou sekrécie EDN ľudskými keratinocytmi zahŕňajú IL-1, tumor nekrotizujúci faktor (TNF) a endotelín konvertujúci enzým (ECE)-1. Naše zistenia o stimulácii autokrinných cytokínov spojenej s UVB melanózou ukázali, že upregulácia IL-1 je zodpovedná hlavne za stimuláciu produkcie EDN1 a SCF v ľudských keratinocytoch vystavených UVB [12,16]. Zistilo sa teda, že IL-1 a sú silnými stimulátormi sekrécie EDN s oneskoreným vrcholom v ľudských keratinocytoch v kultúre, ktorý sa podobá vzoru sekrécie EDN indukovanej UVB [11]. Je tiež dobre známe, že UVB ožarovanie významne stimuluje uvoľňovanie IL{11}}, ale nie IL{12}} v kultivovaných ľudských keratinocytoch, a že blokujúca protilátka proti IL-1 významne ruší zvýšenú sekréciu EDN1 [11], čo naznačuje, že hyperpigmentácia vyvolaná UVB je sprostredkovaná aktiváciou epidermálnych melanocytov v dôsledku zvýšenej sekrécie EDN1 keratinocytmi vystavenými UVB žiareniu. Okrem toho sa zistilo, že expresia proteínu mSCF je významne stimulovaná pôsobením IL-1 v ľudských keratinocytoch v kultúre [16]. Preto sme ďalej určili, či IL-1 bol tiež upregulovaný, aby stimuloval expresiu EDN1 a / alebo SCF v epidermis lézií SL. Je zaujímavé, že semikvantitatívna analýza RT-PCR odhalila, že expresia IL-1 mRNA je v epidermis lézií skôr regulovaná smerom nadol [16]. V súlade s touto RT-PCR analýzou imunohistochémia s IL-1 protilátkou odhalila slabšie imunofarbenie v epidermis lézie ako v epidermis bez lézie (obrázok 1o,p) [2], čo naznačuje, že IL{ {33}} nie je zodpovedný za zvýšenú expresiu EDN1 a SCF v epidermis lézií SL.

Čo sa týka mechanizmov, ktoré sú základom zvýšenej expresie EDN1 v SL, okrem IL-1 TNF v 10 ng/ml opísali Tsuboiet al. byť silným stimulátorom (10--krát) sekrécie EDN kultivovanými ľudskými keratinocytmi [39]. Pokiaľ ide o mechanizmus, ktorý je základom zvýšenej expresie SCF v SL, ďalej sme skúmali účinky TNF na expresiu SCF v kultivovaných ľudských keratinocytoch. Western blotting s použitím anti-SCF protilátky preukázal, že TNF významne stimuluje produkciu mSCF [15]. Preto sme ďalej určili, či je alebo nie je TNF upregulovaný na stimuláciu expresie EDN1 a / alebo SCF v epidermis lézií SL. Je zaujímavé, že semikvantitatívna RT-PCR analýza odhalila, že expresia TNF mRNA je významne zvýšená v SL epidermis lézií [2]. V súlade s analýzou RT-PCR imunohistochémia s anti-TNF protilátkou odhalila silnejšie imunofarbenie v SL epidermis s léziami ako v epidermis bez lézií (obrázok 1q,r) [2]. Bolo teda možné, že upregulovaná expresia TNF je zodpovedná hlavne za zvýšenú expresiu EDN1 a SCF v epidermis lézií SL.

Pokiaľ ide o mechanizmus zapojený do zvýšenej expresie EDN1, ďalej sme určili, či je ECE-1 upregulovaná v SL epidermis lézií. Keďže v súčasnosti žiadna štúdia nepopisuje expresiu ECE-1 v ľudských keratinocytoch, charakterizovali sme ECE-1 v kultivovaných ľudských keratinocytoch v porovnaní s endotelovými bunkami. Analýza aktivity ECE-1 v rôznych typoch kožných buniek odhalila, že ľudské keratinocyty a nie ľudské melanocyty majú aktivitu ECE-1, ktorá sa vyskytuje v menšom rozsahu ako v endotelových bunkách [40]. Western blotting s použitím protilátok, ktoré sme pripravili proti ECE-1, preukázal, že proteín ECE-1 existuje v ľudských endotelových bunkách, ľudských fibroblastoch a ľudských keratinocytoch, ale nie v ľudských melanocytoch [40]. Testy aktivity ECE{10}} v supernatantoch po imunoprecipitácii s protilátkou ECE{11}} preukázali, že endotelové bunky a ľudské keratinocyty majú zistiteľné aktivity ECE{12}} pri pH 6,8, čo dobre koreluje s ECE{ {15}} imunoprecipitovaný s našou protilátkou proti ECE-1 [40]. Semikvantitatívna RT-PCR analýza hladín mRNA ECE-1 odhalila, že IL-1, ale nie TNF, mal mierny stimulačný účinok na expresiu génu ECE{21}} v kultivovaných ľudských keratinocytoch [40]. V súlade s analýzou RT-PCR Western blotting odhalil, že IL-1, ale nie TNF, stimuloval expresiu ECE-1 proteínu v kultivovaných ľudských keratinocytoch [40]. Nakoniec sme určili, či je ECE-1 tiež upregulovaná na stimuláciu expresie EDN1 v epidermis lézií SL. V súlade s chýbajúcim stimulačným účinkom TNF , ktorý je upregulovaný v SL, nebol žiadny rozdiel v hladine expresie mRNA ECE-1 medzi léziou a epidermou bez lézií SL [2], čo naznačuje, že ECE-1 nie je zodpovedná za zvýšenú sekréciu EDN1 v SL.

Obrázok 3 ukazuje súhrn autokrinnej stimulácie v ľudských keratinocytoch v kultúre. Pokiaľ ide o biologické mechanizmy vedúce k aktivácii signalizačných kaskád EDN a SCF [9], naše štúdie in vitro naznačujú zaujímavý kontrast, že zatiaľ čo upregulácia IL-1 je zodpovedná hlavne za stimuláciu produkcie EDN1 a SCF v UVB- melanóze je zvýšená regulácia TNF spojená hlavne so stimulovanou produkciou tých istých dvoch cytokínov v SL.

3.4. Synergické stimulačné účinky kombinácie EDN1 a SCF

Už sme uviedli, že existuje synergia v stimulovanej syntéze DNA v kultivovaných ľudských melanocytoch, ako bolo merané inkorporáciou 14C-tymidínu v spoločnej prítomnosti SCF a EDN1 [41]. Podobná synergia bola aj pri stimulácii syntézy melanínu meranej inkorporáciou 14C-tiouracilu do kultivovaných ľudských melanocytov v spoločnej prítomnosti SCF a EDN1 [41]. Naopak medzi EDN1 a faktorom stimulujúcim kolónie granulocytových makrofágov (GM-CSF) alebo HGF nebola žiadna takáto synergia [13,42]. Pokiaľ ide o signalizačné mechanizmy zapojené do týchto synergických účinkov, zistili sme, že krížová komunikácia medzi signalizáciou SCF a EDN1 sa začala prostredníctvom tyrozínfosforylácie c-KIT, ktorá je stimulovaná nepriamo aktivovanou PKC, čo zvyšuje tvorbu Shc-Grb{ {18}}Komplex SOS, ktorý zase vedie k synergickej aktivácii Ras/Raf{19}}/MEK/MAP kinázovej slučky [41].

3.5. Vzájomné interakcie medzi EDN/EDNBR a SCF/c-KIT

Ďalej sme určili, či zvýšená produkcia SCF okrem stimulačného účinku na ich proliferáciu spúšťa expresiu EDNBR alebo jeho afinitu k ligandu EDN v ľudských melanocytoch. Analýza Western blotting odhalila, že SCF môže stimulovať expresiu EDNBR proteínu v kultivovaných ľudských melanocytoch [43]. Keď sa afinita EDNBR k jeho ligandu hodnotila v kultivovaných ľudských melanocytoch pomocou testu viazania ligandu, zistilo sa, že väzba 125I-značeného EDN1 na EDNBR sa výrazne zvýšila dva dni po inkubácii s SCF [43]. Celkovo tieto zistenia naznačujú, že SCF exprimovaný v skorej fáze môže zvýšiť expresiu EDNBR, čo spôsobuje, že melanocyty sa stanú citlivejšími na neskoršiu sekréciu EDN1. Na druhej strane, keď boli kultivované ľudské melanocyty ošetrené počas 48 hodín EDN1 v koncentrácii 10 nM, test viazania ligandu pomocou 125I-SCF odhalil, že EDN1 výrazne zvýšil väzbovú afinitu SCF k c-KITreceptoru [43].

4. Zhrnutie patobiológie SL

Tabuľka 1 ukazuje súhrn parakrinných cytokínových sietí, ktoré sa vyskytujú pri rôznych epidermálnych hyperpigmentárnych poruchách. Pokiaľ ide o tieto siete, SL sú veľmi podobné UVB-melanóze, s výnimkou kauzálnych cytokínov, ako je TNF pre zvýšenú produkciu EDN1 a SCF.

Čo sa týka biologických mechanizmov vedúcich k zvýšeným aktivitám signalizačných kaskád EDN a SCF, naše štúdie in vitro naznačujú, že zatiaľ čo upregulácia IL-1 je zodpovedná hlavne za stimuláciu produkcie EDN1 a SCF pri UVB-melanóze, upregulácia TNF je spojený so stimulovanou produkciou tých istých dvoch cytokínov v SL. Obrázok 4 ukazuje súhrn komplexných vzťahov medzi väzbami SCF a EDN1 v epiderme SL. To zahŕňa synergizmus medzi SCF a EDN1, ako aj aktiváciu EDNBR a c-KIT pomocou SCF a EDN1. Uvoľňovanie TNF keratinocytmi simuluje produkciu SCF a EDN autokrinným spôsobom, pričom obe vykazujú synergický účinok na aktiváciu melanocytov, ako aj stimulačný účinok na expresiu ich zodpovedajúcich receptorov, c-KIT a EDNBR. Tieto synergické a medzibunkové interakcie uľahčujú aktiváciu melanocytov vo väčšej miere v epidermis lézií SL ako v epidermis vystavenej UVB, čo vedie k intenzívnejšej hyperpigmentácii SL.

Súhrnne naše výsledky naznačujú, že dve signálne kaskády, EDN1 / EDNBR a mSCF / c-KIT, hrajú vnútornú a koordinovanú úlohu pri zdôrazňovaní mitogenézy a melanogenézy melanocytov v hyperpigmentovanej epiderme SL. Obrázok 5 ukazuje biologickú sekvenciu pre hyperpigmentačné mechanizmy zapojené do SL, kde neznáme tumorigénne faktory v dôsledku kumulatívneho poškodenia DNA v dávnej minulosti spôsobujú, že keratinocyty produkujú a vylučujú TNF. TNF teda spôsobuje, že keratinocyty nadprodukujú melanogénne cytokíny, ako sú SCF a EDN1, autokrinným spôsobom, čím spúšťa susedné melanocyty na stimuláciu syntézy melanínu, čo vedie k epidermálnej hyperpigmentácii.

5. Terapeutické prístupy k lokálnej liečbe

Na základe koordinovanej melanogénnej parakrinnej siete a aktivovaných signalizačných mechanizmov vedúcich k aktivácii melanocytov v epidermis lézií SL je blokovanie základnej melanogénnej intracelulárnej signalizácie žiaducim terapeutickým prístupom na dosiahnutie antipigmentačných účinkov na SL. Takýto prístup môže spôsobiť hypopigmentáciu, ale nemal by byť účinný v koži bez lézií, kde takéto signálne kaskády nie sú aktivované v melanocytoch. Na druhej strane inhibícia aktivity tyrozinázy je ďalším prístupom na zlepšenie hyperpigmentácie v SL, hoci môže spôsobiť hypopigmentáciu a môže byť účinná aj na koži bez lézií.

5.1. Blokovanie základnej melanogénnej intracelulárnej signalizácie

Keďže takmer všetky mutácie vedúce ku genetickým hypopigmentárnym poruchám sa vyskytujú na osi EDN1/EDNBR a SCF/c-KIT [44] a keďže existuje synergický stimulačný účinok EDN1/SCF na bunkovú proliferáciu a melanizáciu v kultivovaných ľudských melanocytoch, je možné, že blokuje buď signalizácia EDN1/EDNBR alebo SCF/c-KIT by mohla zabrániť hyperpigmentácii v dôsledku koordinovane zvýšenej expresie EDN1 a SCF, pretože nedochádza k synergickému stimulačnému účinku. Preto sme sa pokúsili dosiahnuť anti-pigmentačné účinky na SL blokovaním signalizačnej línie EDN / EDNBR.

EDN-aktivovaná intracelulárna signálna dráha pozostáva z väzby na EDNBR, aktivácie PKC, MAP kinázovej kaskády a cAMP/PKA kaskády [34,35,41]. Tieto bunkové akcie sú teda iniciované väzbou EDN1 na EDNBR spojený s G-proteínom, po ktorom nasledujú sekvenčné signalizačné procesy pozostávajúce hlavne z PKC a MAPK. Po naviazaní na svoj receptor EDN1 spúšťa hydrolýzu polyfosfoinozitidu aktiváciou fosfolipázy C, ktorá vytvára inozitol-trifosfáty (IP3) a diacylglycerol, mobilizujúci intracelulárny Ca plus plus a aktiváciu PKC. Aktivácia PKC sa dosiahne jej translokáciou z cytosolu do plazmatickej membrány a aktivuje Raf{10}} prostredníctvom fosforylácie. Zdá sa teda, že Raf{11}} je konvergentným bodom medzi cestami PKC a MAPK. Aktivácia Raf{12}} vedie k aktivácii série medziproduktov dráhy MAPK pozostávajúcej z MEK, ERK a RSK. Fosforylovaný Raf{13}} aktivuje MEK fosforyláciou a aktivovaná MEK fosforyluje ERK. Aktivovaný ERK potom fosforyluje transkripčný faktor spojený s mikroftalmiou (MITF) na seríne 75, čo vedie k náboru koaktivátora na reguláciu génovej expresie niekoľkých melanogénnych faktorov [41]. Súčasne aktivovaná MAPK vedie k aktivácii RSK, ktorá fosforyluje CREB, čo vedie k transkripcii MITF. Na druhej strane, aktivovaná PKC má krížovú komunikáciu s adenylcyklázovou kaskádou za vzniku cAMP[8], čo vedie k aktivácii PKA, ktorá tiež aktivuje CREB fosforyláciou, čo vedie k zvýšenej expresii MITF. Zvýšená hladina proteínu MITF stimuluje expresiu génov špecifických pre melanocyty vrátane tyrozinázy, PMEL17, EDNBR, c-KIT a CDK2.

Pretože niekoľko intracelulárnych signálnych dráh vedie k stimulovanej melanogenéze v melanocytoch a signálna kaskáda EDN je špecificky spojená s dráhou PKC, ktorá zahŕňa mobilizáciu vápnika z endoplazmatického retikula [13], použili sme test mobilizácie vápnika na skríning antagonistov EDNBR z rôznych z bylinných extraktov. K mobilizácii vápnika z endoplazmatického retikula dochádza po vytvorení IP3 a diacylglycerolu v dôsledku hydrolýzy polyfosfoinozitidu prostredníctvom aktivovanej fosfolipázy C. Keď sa ľudské melanocyty ošetria v kultúre s EDN1, mobilizácia vápnika detegovateľná činidlom fura-2AM produkuje fluorescenciu po naviazaní na uvoľnený vápnik, ako je vidieť z rýchleho objavenia sa žltej farby, ktorú možno merať v reálnom čase pomocou digitálna zobrazovacia mikroskopia. Zo skríningu mnohých rastlinných extraktov sme zistili, že predinkubácia s extraktom z Matricaria chamomilla prerušila mobilizáciu vápnika indukovanú EDN1 [1], čo naznačuje, že môže slúžiť ako účinný antagonista proti EDNBR. M. chamomilla, bežne známy ako harmanček, je jednoročná rastlina z čeľade Asteraceae. M. chamomilla je najobľúbenejším zdrojom rastlinného produktu harmančeka, hoci sa ako harmanček používajú aj iné druhy.

Na základe inhibičného účinku vzoriek frakcionovaných z extraktu M. chamomilla na EDN{{0}}indukovanú mobilizáciu vápnika v kultivovaných ľudských melanocytoch sme identifikovali spiroéter ako jeho aktívnu zlúčeninu so silnou schopnosťou prerušiť mobilizáciu vápnika (obrázok 6 ) [1]. Existujú dva izoméry spiroéteru (E a ​​Z) a spiroéterový E-izomér môže úplne zrušiť mobilizáciu vápnika pri koncentráciách vyšších ako 1 uM. Ošetrenie spiroéterovým E-izomérom v koncentráciách 0,2 a 1,0 percenta významne znížilo UVB-indukovanú pigmentáciu v hnedožltej koži morčiat, ako bolo hodnotené hodnotou ∆L, ktorá indikovala, že blokovanie EDN-sprostredkovanej signálnej kaskády je účinný pri prevencii hyperpigmentácie vyvolanej UVB žiarením. Toto je dôležitý dôkaz in vivo, ktorý ukazuje vnútorné zapojenie kaskády EDN do UVB-melanózy. Na druhej strane, ako sa očakávalo, pri predinkubácii alebo spoločnej inkubácii v kultúre melanocytov mal extrakt z M. chamomilla silnú schopnosť eliminovať EDN1-indukované zvýšenie syntézy DNA (merané inkorporáciou 14C-tymidínu), ako aj syntézy melanínu (merané inkorporáciou 14C-tiouracilu) kultivovanými ľudskými melanocytmi. V paralelnej štúdii s použitím kultivovaných ľudských keratinocytov sme overili, že extrakt z M. chamomilla nemal žiadny inhibičný účinok na IL{21}}indukovanú sekréciu EDN1 [1]. Okrem toho sme použitím tyrozináz odvodených z ľudských melanocytov potvrdili, že extrakt z M. chamomilla nemal in vitro žiadny inhibičný účinok na aktivitu tyrozinázy na rozdiel od zreteľných inhibičných účinkov známych bieliacich činidiel, kyseliny kojovej a arbutínu [1]. Keď bol extrakt z M. chamomilla topicky aplikovaný denne na hnedožltú kožu morčiat po dobu dvoch týždňov bezprostredne po UVB ožiarení, intenzita UVB-indukovanej pigmentácie bola výrazne znížená v porovnaní s liečbou iba 10 percentným arbutínom alebo vehikulom [1].

V klinickej štúdii na ľuďoch sa zistilo, že lokálna aplikácia výťažkov z M. chamomilla na kožu predlaktia človeka vystavenú UVB počas šiestich týždňov bezprostredne po ožiarení významne zabraňuje hyperpigmentácii vyvolanej UVB, merané meracím prístrojom farebných rozdielov a vyjadrené ako ∆ hodnota L.

Pomocou vosku tyčinkového typu obsahujúceho extrakt z M. chamomilla sme skúmali klinické účinky na pigmentáciu inSL. V tejto klinickej štúdii bola každá pigmentovaná škvrna skúmaná na farebné zmeny a boli hodnotené stupne klinického zlepšenia a validita. Klinické hodnotenie vykonané na Tokijskej ženskej lekárskej univerzite odhalilo, že dvojmesačná liečba extraktom z M. chamomilla viedla k výraznému zlepšeniu u 48 percent subjektov a u 40 percent k miernemu zlepšeniu [1]. V zmenách úrovne pigmentácie meranej hodnotami ∆L mali všetci pacienti s SL zreteľné zvýšenie hodnoty ∆L nad dva, čo je viditeľne rozpoznateľná hladina, po liečbe počas 2 až 3 mesiacov. Medzi 0, 1 a 2 mesiacmi po liečbe došlo k významnému zníženiu úrovne pigmentácie meranej hodnotami ∆L (obrázok 7). Celkovo klinické hodnotenie počas troch mesiacov ukázalo, že liečba extraktom z M. chamomilla viedla k výraznému zlepšeniu u 42 percent subjektov, u 12 percent k miernemu zlepšeniu a u 25 percent k miernemu zlepšeniu. Ďalšia klinická štúdia vykonaná v dvoch príbuzných dermatologických nemocniciach v Tokiu preukázala, že liečba extraktom z M. chamomilla postupne redukovala pigmentáciu a po šiestich mesiacoch viedla k tomu, že približne 70 percent subjektov vykazovalo viac ako mierne zlepšenie vrátane 10 percent zmiznutia a 15 percent s výrazným zlepšením . Vyskytli sa dva prípady, kedy SL úplne vymizli po približne šiestich mesiacoch liečby, pričom hodnoty ∆L sa zvýšili na 8,4 a 6,9 po šiestich mesiacoch liečby (obrázok 8) [1].

Na záver, pokiaľ ide o terapeutické prístupy k SL blokovaním esenciálnej melanogénnej intracelulárnej signalizácie, vyššie uvedené klinické štúdie naznačujú, že blokovanie signalizácie spojenej s EDN1/EDNBR je účinnou terapeutickou liečbou SL bez akýchkoľvek hypopigmentačných účinkov.

5.2. Inhibícia aktivity tyrozinázy

Inhibícia aktivity tyrozinázy je ďalším prístupom na zlepšenie hyperpigmentácie v SL, ktorý má možné nevýhody hypopigmentácie, ale potenciálny prínos je účinný aj na koži bez lézií. Keďže bieliace činidlá sú vo všeobecnosti určené na liečbu UVB-melanózy, neuskutočnila sa klinická dvojito zaslepená štúdia o potenciálnych antipigmentačných účinkoch bieliacich činidiel na SL. Uskutočnili sme dvojito zaslepenú štúdiu polovice tváre na 27 japonských dobrovoľníčkach s SL. V tejto klinickej štúdii sa pleťové vody s alebo bez 6 percent L-askorbát-2-fosfátu 3 Na (APS) (testovacie mlieko/placebo lotion) lokálne aplikovali dvakrát denne na tvár počas 24 týždňov [45]. Reprezentatívne fotografie tvárí subjektov č. 012 a č. 016 pred a po ošetrení ukázali, že úroveň pigmentácie SL ošetrených testovacím mliekom sa mierne znížila v súlade s miernym poklesom pokožky bez lézií ošetrenej testovacím mliekom [ 45]. Na rozdiel od toho sa zdá, že úroveň pigmentácie SL ošetrených placebom a koža bez lézií zostala nezmenená. Zatiaľ čo hodnoty L v testovaných SL ošetrených lotionom sa po 24 týždňoch liečby výrazne zvýšili, hodnoty L v SL ošetrených placebom lotionom zostali nezmenené (obrázok 9) [45]. Porovnanie hodnôt oL pred a po ošetrení odhalilo výrazne vyššiu Hodnota oL v testovaných SL ošetrených lotionom ako v SL ošetrených placebom lotion (obrázok 9). Tieto zistenia naznačujú, že testovacie mlieko obsahujúce APS malo výrazne silnejší antipigmentačný účinok na SL ako placebo. Zatiaľ čo hodnoty L v testovanej koži bez lézií ošetrenej mliekom sa výrazne zvýšili po liečbe počas 24 týždňov, hodnoty L v koži bez lézií ošetrenej mliekom s placebom zostali nezmenené. Porovnanie hodnôt oL pred a po ošetrení odhalilo signifikantne vyššiu hodnotu oL v testovanej koži bez lézií ošetrenej mliekom ako v koži bez lézií ošetrenej mliekom s placebom [45]. Tieto zistenia naznačujú, že testované mlieko malo výrazne silnejší bieliaci účinok na pokožku bez lézií ako mlieko s placebom. Porovnanie antipigmentačných účinkov medzi SL a kožou bez lézií odhalilo, že zatiaľ čo hodnoty oL medzi pred a po liečbe testovaným mliekom boli u SL výrazne vyššie ako v prípade pokožky bez lézií, hodnoty oL sa vyskytli na podobnej úrovni v SL a koži bez lézií bez akéhokoľvek významného rozdielu medzi nimi [45].

Cistanche inhibuje aktivitu tyrozinázy.

Vzťah medzi hodnotami L a melanínovými indexmi pre všetky merania počas tejto klinickej štúdie odhalil významnú koreláciu medzi oboma. Tento výsledok ukázal, že hodnota 2.{1}} ∆L bola približne ekvivalentná 20 ∆ melanínovému indexu s 10-krát vyššou citlivosťou v melanínovom indexe ako hodnota L. Porovnanie medzi hodnotami L a melanínovými indexmi pre každé meranie v týždňoch 0 a 24 na SL odhalilo významné korelácie. Tieto porovnania medzi hodnotami L a melanínovými indexmi ukázali, že došlo k výraznému posunu distribúcie smerom k svetlejšej farbe, ako je vyššia hodnota L a menší melanínový index v SL ošetrených testovacím mliekom, zatiaľ čo v lotione s placebom nedošlo k takému výraznému posunu distribúcie. -liečených SL [45].

Na záver, pokiaľ ide o terapeutický prístup pre SL s použitím inhibítora tyrozinázy, súčet vyššie uvedených zistení silne naznačuje, že APS má slabý, ale významný antipigmentačný účinok na SL a významný bieliaci účinok aj na normálne sfarbenú zdravú pokožku, bez akéhokoľvek hypopigmentačného účinku.

6. Závery

Na záver, pokiaľ ide o mechanizmy aktivácie melanocytov a terapeutickú lokálnu liečbu SL, na základe vyššie uvedených zistení mechanizmu aktivácie melanocytov v SL, ako aj klinickej účinnosti získanej pomocou blokátora signalizácie EDN a inhibítora tyrozinázy, sa dôrazne odporúča, aby kombinovaná liečba blokátor signalizácie EDN a inhibítor tyrozinázy je žiaducou terapeutickou liečbou SL.

cistanche tablety

Pre viac informácií kliknite prosím na obrázok.