Inhibítory melanogenézy z rizómu Ligusticum Sinense v bunkách melanómu B16-F10 in vitro a zebričke in vivo

Kontakt: ali.ma@wecistanche.com

Min-Chi Cheng 1,† , Tzong-Huei Lee 2,†, Yi-Tzu Chu 3, Li-Ling Syu 3, Su-Jung Hsu 4, Chia-Hsiung Cheng 5, Jender Wu 1,* a Ching-Kuo Lee 1,3,6,*

Abstrakt:Oddenok Ligusticum sinense, čínskej liečivej rastliny, sa už dlho používa ako kozmetický prostriedok nabieleniea hydratáciu pokožky v starovekej Číne. Za účelom skúmania antimelanogénnych zložiek rizómu L. sinense sme vykonali anantimelanogenézapurifikácia riadená testom s použitím semipreparatívnej HPLC spolu so spektroskopickou analýzou na stanovenie aktívnych zložiek. Na základe metódy riadenej biotestom sa izolovalo a identifikovalo 24 zlúčenín z etylacetátovej vrstvy metanolových extraktov L. sinense, medzi nimi 5-[3-(4-hydroxy{{ Kyselina 7}}metoxyfenyl)alyl]ferulová (1) a cis-4-pentylcyklohex-3-én-1,2-diol (2) boli nové zlúčeniny. Všetky čisté izoláty sa podrobili testu antimelanogenézy s použitím buniek myšieho melanómu B16-F10. Vyskytla sa zlúčenina 1 a (3S,3aR)-neoknidilid (8).antimelanogenézaaktivity s hodnotami IC50 78,9 a 31,1 uM, v danom poradí, bez zjavnej cytotoxicity. Ďalšie skúmanie ukázalo, že zlúčenina 8 preukázala významnú anti-pigmentačnú aktivitu na embryách zebárky (10-20 uM) v porovnaní s arbutínom (20 uM) a bez akejkoľvek cytotoxicity proti normálnym ľudským epidermálnym keratinocytom. Tieto zistenia naznačujú, že (3S,3aR)-neoknidilid (8) je účinná antimelanogénna a necytotoxická prírodná zlúčenina a môže sa potenciálne vyvinúť akobielenieprostriedok na kozmetické účely.

Kľúčové slová:Ligusticum sinense; rizóm;antimelanogenéza; melanómová bunka B16-F10; zebrafish;pigmentácia

Kliknite naPrášok Cistanche tubulosa na inhibíciu melanínu

Úvod

Melanín je hnedo-čierny pigment, ktorý je v zásade zodpovedný za farbu pokožky, vlasov a očí [1]. Melanín je biopolymér a zahŕňa dve hlavné triedy pigmentov v ľudskej koži, hnedo-čierny eumelanín a červeno-žltý feomelanín [1]. Biosyntéza melanínu je komplexný viacstupňový proces tzvmelanogenéza, čo je fyziologická reakcia ľudskej pokožky na zabránenie škodlivým účinkom ultrafialového (UV) žiarenia a látok znečisťujúcich životné prostredie. Nadmerná melanogenéza však môže viesť k stmavnutiu kože a abnormálna hyperpigmentácia spôsobuje rôzne dermatologické problémy, ako sú pehy, melazma, senilné lentigíny a dokonca rakovina kože [2].

Melanín je produkovaný v membránovo viazaných organelách označovaných ako melanozómy, ktoré sú prítomné v špecializovaných bunkách nazývaných melanocyty. Syntéza melanínu začína hydroxyláciou L-tyrozínu na L-dihydroxyfenylalanín (DOPA) a nasleduje oxidácia na dopachinón. Dve reakcie sú katalyzované enzýmom tyrozinázou, ktorý obmedzuje rýchlosť. V neprítomnosti tiolových látok sa dopachinón cyklizuje na leukodopachróm, po čom nasleduje séria oxidoredukčných reakcií, ktoré zahŕňajú proteín súvisiaci s tyrozinázou-2 (Tyrp-2) za vzniku medziproduktu dopachrómu a 5,{8}}dihydroxyindolu{ {9}}karboxylová kyselina (DHICA). DHICA podlieha následnej oxidácii katalyzovanej Tyrp{10}} a polymerizácii za vzniku eumelanínu. Dopachinón sa tiež konjuguje s cysteínom a glutatiónom za vzniku cysteinyldopy a glutationyldopy, ktoré sa progresívne transformujú na feomelanín [1].

Na regulácii sa podieľajú bunky obklopujúce melanocyty, ako sú keratinocyty a fibroblastymelanogenéza[3]. Nepretržité vystavenie UV žiareniu indukuje poškodenie DNA inkeratinocytov a vedie k p53-sprostredkovanej upregulácii proopiomelanokortínu (POMC). POMC podstupuje posttranslačné štiepenie za vzniku hormónu stimulujúceho melanocyty (-MSH) a -endorfínu. Na druhej strane sa -MSH viaže na receptor melanokortínu 1 (MC1R) na susedných melanocytoch, čo vedie k zvýšenej regulácii cAMP. Zvýšený cAMP stimuluje expresiu transkripčného faktora spojeného s mikroftalmiou (MITF). MITF potom reguluje transkripciu pigmentačných enzýmov vrátane tyrozinázy, Tyrp{10}} a Tyrp{11}}. Cesta spustená UV žiarením nakoniec vedie k syntéze melanínu a prenosu melanozómov do keratinocytov [4–6]. Okrem vonkajších stimulov je produkcia melanínu ovplyvnená aj vnútornými faktormi, ako sú hormonálna zmena, genetické poruchy, zápaly a vek [3].

Vo východnej Ázii väčšina žien očakáva, že sa vyhnú nerovnomernej pigmentácii pokožky a budú usilovať o zosvetlenie pokožky. Napríklad arbutín, kyselina kojová, kyselina azelaová, kyselina askorbová a extrakt z moruše bielej a koreňa sladkého drievkabieleniezložky v kozmetických prípravkoch [7]. Využitie účinnej a preventívnej pokožkybielenieo látky z prírodných zdrojov je v kozmetickej oblasti veľký záujem, predovšetkým kvôli relatívnej netoxicite a menšiemu počtu vedľajších účinkov [7,8]. Oddenok Ligusticum sinenseOliv. (Umbelliferae) sa ako tradičná čínska medicína používa už 2000 rokov a dodnes sú jeho korene vysoko odporúčaným bylinkovým čajom [9]. L. sinense, v čínštine "Gaoben", tiež známy ako čínsky lovage, sa používal na vypudenie chladu vetrom, zmiernenie bolesti a reumatickej artralgie a zmiernenie anemofrigidnej bolesti hlavy. Hlavné vonkajšie použitie L. sinense je na bielenie a hydratáciu pokožky [10]. Doteraz hlásené chemické zložky prítomné v L. sinense zahŕňajú terpenoidy, analógy ftalidu a fenylpropanoidové glykozidy [11–16]. Uvádza sa, že takéto zložky majú početné farmakologické účinky. Napríklad sa uvádza, že esenciálne oleje z koreňov a odnoží L. sinense majú analgetické, sedatívne a antimikrobiálne účinky [15,17]. Ligustilid, hlavný ftalid, ktorý sa bežne vyskytuje v rastline Umbelliferae, preukázal dilatačný účinok na myometrium a znížil zápalové a neurogénna bolesť [18]. Cnidilid, ďalší ftalid hojný v rastline Umbelliferae, má antispazmodické a zápalové účinky [19,20]. Predchádzajúce štúdie ukázali, že extrakt z L. sinense inhibovalmelanogenézana B16-F10 bunkách myšacieho melanómu [21]. Avšak aktívne zložky pre inhibičnú aktivitu melanogenézy neboli stále uvedené.

prírodné zložky

V našom predbežnom biologickom skríningu sa zistilo, že metanolové extrakty L. sinense boli vystavenéantimelanogenézaaktivita v B16-F10 bunkách s hodnotou IC50 50 µg/ml [22] a princípy antimetalnogenézy sú doteraz stále neobjasnené. Preto sme sa rozhodli preskúmať aktívny princíp rizómu L. sinense metódou zameranou na biotest, čo viedlo k izolácii a identifikácii dvoch nových zlúčenín 1 a 2 spolu s 22 známymi zlúčeninami 3–24. Tento článok sa tiež zameriaval na skúmanie účinkov zlúčenín 1 a 8 na bunky melanómu B16-F10 in vitro a zebričky in vivo, posúdenie bezpečnosti normálnym ľudským epidermálnym keratinocytovým MTT testom a kvantifikáciu 1 a 8 v rizóme L. sinense .

2. Výsledky a diskusie

2.1. Izolácia a štrukturálne objasnenie

V snahe izolovať a identifikovaťmelanogenézaÚčinne z aktívnych frakcií sme použili stratégiu frakcionácie riadenú biotestom. Metanolický extrakt z rizómu L. sinense sa rozdelil, čím sa získali etylacetát, n-butanol a vrstvy rozpustné vo vode. Získané tri vrstvy sa potom testovali na antimelanogenézu v bunkách myšacieho melanómu B16-F10. Myšia bunka melanómu B16 je citlivá, spoľahlivá a uskutočniteľná platforma na skríning veľkého počtu malých molekulárnychmelanogenézaregulátorov [23–25]. Pri koncentráciách 25 – 100 µg/ml vykazovala vrstva rozpustná v etylacetáte najsilnejšiu inhibičnú aktivitu, zatiaľ čo mierna inhibícia bola pozorovaná buď pre n-butanolové alebo vo vode rozpustné vrstvy (obrázok 1A), čo dokazuje obsah melanínu v lyzovanom Bunky melanómu B16-F10 (obrázok 1B). Separácia etylacetátovej vrstvy na silikagéli na otvorenej kolóne s následným čistením pomocou HPLC poskytla dve predtým neuvedené chemické entity 1 a 2 (obrázok 2A) spolu s 22 známymi zlúčeninami. Známe zlúčeniny boli charakterizované ako eugenol (3) [26], {{17} }hydroxy-4-metylacetofenón(4) [27], 3S*,3aR*,7aS*-3-butylhexahydroftalid (5) [28], karvakrol (6) [29], skvalén (7) [30 ],(3S,3aR)-neoknidilid (8) [31], koniferylalkohol 9-metylester (9) [32], bergapten (10) [33], metoxsalen (11) [34], metylvanilát 12) [35], 2,5-dihydroxy-4-metylacetofenón (13) [36],2-metoxy-4-nitrofenol (14) [37], 2,{{ 55}}dimetoxyfenol (15) [38], falkarindiol (16) [39], (9Z)-heptadecén-4,6-diín-1,8-diol (17 ) [40], kyselina 3-0-(p-kumaroyl)ursolová (18) [41], pregnenolón(19) [42], (9Z,11E,13R)-13-hydroxyoktadeka{{79 }},11-kyselina diénová (20) [43], kyselina ferulová (21) [44], koniferylferulát (22) [45], p-hydroxyfenetylferulát (23) [46] a vanilín kyselina lová (24) [47].

Zlúčenina 1, získaná ako bezfarebný olej, mala vzorec C20H20O6, ako sa odvodilo z 13C NMR a pozitívneho iónu HRESI-MS, ktorý vykazoval fragmentový ión pri pozitívnom HRESI-MS m/z 357,1331[M plus H] plus (vypočítané pre C20H21O6, 357,1333). Jeho IR absorpcie pri 3444, 1633 a 1509 cm-1 indikovali prítomnosť hydroxylových, olefínových a aromatických funkčných skupín. V1H NMR 1,a 1,3,4,5-tetrasubstituovanej aromatickej časti [8H 7,07 (d, J=1,8 Hz, H-6) a 7,22 (d, J=1,8 Hz, H-2)], aromatická funkcia typu ABX [δH 6,69 (dd, J=7,9, 1,8 Hz, H-60) , 6,74 (d, J=7,9 Hz, H-50) a 6,87 (d, J=1,8 Hz, H-20)], dve trans- vzájomne spojené olefínové protóny [δH 6,33 (d, J=15,9 Hz, H-8) a 7,56 (d, J=15,9 Hz, H-7) ], koncová alylová skupina [δH 4,99 (ddd, J=17,1, 1,8, 1,8 Hz, H-90a), 5,10, (br d,J=7,6 Hz , H-70), 5,15 (ddd, J=10,1, 1,8, 1,8 Hz, H-90b) a 6,40 (ddd, J=17,1, 10,1 7,6 Hz, H-80)] a boli pozorované dve metoxylové rezonancie [5H 3,77 (s, 30-OCH3) a 3,92 (s, 3-OCH3)]. Dvadsať uhlíkových rezonancií, ktoré možno pripísať siedmim neprotónovaným aromatickým uhlíkom [δC 126,7 (C-1), 131,2 (C-5), 135,3(C-10), 146,1 (C{116} }), 148,6 (C-3), 147,2 (C-4) a 148,2 (C-30)], jeden kyslý karbonyl (δC 168,4, C-9), onemetín (δC 48,2, C-70), osem olefínových metínov [δC 108,9 (C-2), 113,2 (C-20), 115,6 (C-50), 116,1 (C -8), 121,8 (C-60), 123,8 (C-6), 141,5 (C-80) a 146,2 (C-7)], jeden exometylén (δC 115,9, C-90) a dva metoxyly [δC 56,4 (30-OCH3) a 56,6 (3-OCH3)], boli pozorované v 13C NMR spektre spojenom s DEPT spektrom 1 ( Stôl 1). Konektivita 1 bola ďalej odvodená krížovými píkmi δH5,10 (H-70)/δC 113,2 (H-20), 115,9 (H-90), 121,8 (H{{ 183}}), 123,8 (C-6), 131,2 (C-5), 135,3 (C-10), 141,5 (C-80) a 147,2 (C{{ 198}}), 5H 7,56 (H{201}})/5C 108,9 (C{204}}), 116,1 (C{207}}), 123,8 (C{210}}), 126,7 (C -1) a 168,4 (C-9), 5H 3,77 (30-OCH3)/δC 148,2 (C-30) a 5H 3,92 (3-OCH3)/ δC 148,6 (C-3) v HMBC spektre (obrázok 2B), ktoré boli ďalej potvrdené vzájomne korelovanými signálmi δH 3,77 (30-OCH3)/δH 6,87(H-20 ) a 5H 3,92 (3-OCH3)/5H 7,22 (H-2) v NOESY spektre (obrázok 2B). V súlade s tým bol 1 charakterizovaný, ako je uvedené, a bol pomenovaný ako kyselina 5-[3-(4-hydroxy-3-metoxyfenyl)alyl]ferulová. Pokiaľ je nám známe, 1 s dvoma sadami jednotiek C6–C3 pripojených na C-70 bol nový kostrový typ lignanu.

Zlúčenina 2 sa izolovala ako bezfarebný olej s molekulovým vzorcom C11H2{{20}}}02, ako sa odvodilo pomocou pozitívneho iónu HR-ESIMS, vykazujúceho [M plus H] plus ión pri m/z 185,1501 (vypočítané pre C11H21O2, 185,1541). Nápadné absorpcie pri 3445 a 1660 cm-1 v IČ spektre 2 indikovali prítomnosť hydroxy a olefínových funkčných skupín. 1H NMR (tabuľka 2) spojená s COSYspektrom 2 ukázala dva alifatické reťazce pri 5H 0,85–1,97 (–H2-7–H3-11) a δH 1,66–5,44(–H-3 –H-2–H-1–H2-6–H2-5–). Vyššie uvedené priradenia sa odrážajú aj v 13C NMR 2 podporovanom DEPT spektrách, v ktorých jeden metyl (5C 14,2, C-11), šesť metylénov [δC 22,7 (C-10), 26,3 (C{{ 45}}), 27,2 (C-5), 27,4 (C-8), 31,8 (C-9) a 37,4 (C-7)], tri metíny [δC Pozorovali sa 67,1 (C-2), 69,2 (C-1) a 121,0 (C-3)] a jeden kvartérny uhlík (δC 144,1, C-4). V HMBC spektre 2 (obrázok 2C), krížové píky δH 5,44 (H-3)/δC 27,2 (C-5) a 37,4 (C-7), δH 1,92– 2,01 a 2,04–2,10 (H2-5)/δC144,1 (C-4) a 5H 1,97 (H2-7)/δC 144,1 (C-4) indikované C{ {100}}–C-6 bola cyklohexénová skupina s dvojitou väzbou na ∆3 a C-7-C-11, nasýtený lineárny alifatický reťazec, bol pripojený na C{105 }}. Relatívnym konfiguráciám chirálnych C{107}} a C{108}} nesúcich hydroxyskupinu sa priblížili hodnoty J karbinoylprotónov H-1 (9,1, 4,2 Hz) a H{114}} (4,2 Hz ), čo naznačuje, že H-1 a H-2 boli pseudoaxiálne a pseudorovníkové (obrázok 2C). Relatívna konfigurácia 1,2-dihydroxy v 2 sa teda odvodila od cis. Presvedčivo bola štruktúra 2 objasnená, ako je znázornené, a bola pomenovaná cis-4-pentylcyklohex-3-én{130}},{131}}diol.

2.2. Účinky zlúčenín 1 a 8 na obsah melanínu v bunkách B16-F10 stimulovaných MSH

Na zistenie depigmentačných zložiek v rizóme L. sinense sa všetky čisté izoláty podrobiliantimelanogenézatest na bunkách melanómu B16-F10. Bunky myšacieho melanómu B16-F10 sú dobre zavedeným modelom na objavovanie antimelanogénnych princípov a boli široko prijaté v predchádzajúcich štúdiách [48]. Hormón stimulujúci melanocyty (-MSH) je peptidový hormón zodpovedný za produkciu melanínu melanocytmi prostredníctvom aktivácie melanokortínového 1 receptora [49]. V tomto výskume boli bunky B16-F10 stimulované pomocou -MSH (100 nM) a súčasne ošetrené každou zlúčeninou v koncentráciách 25, 50 alebo 100 uM. Obsah melanínu v bunkách melanómu B16-F10 bez ošetrenia zlúčeninou bol označený ako 100 percent. Arbutín, obyčajná kožabieleniečinidlo v kozmetických výrobkoch, bol použitý ako pozitívna kontrola. Z týchto zlúčenín 1 a 8 inhibujú -MSH-indukovanú produkciu melanínu spôsobom závislým od dávky. Hodnoty IC50 zlúčenín 1 a 8 boli 78,9 a 31,1 uM, v danom poradí (obrázok 3B). Zlúčeniny 1 a 8 v účinných koncentráciách nevykazovali zjavné účinky na MTT test (obrázok 3A). Výsledky MTT môžu vyplývať z kombinovaných účinkov zníženia bunkovej proliferácie a inhibície bunkovej životaschopnosti podľa experimentálnych podmienok. Tieto výsledky naznačujú, že antimelanogénne účinky zlúčenín 1 a 8 sa nepripisujú bunkovej smrti alebo inhibícii rastu.

Pomocou metódy HPLC-DAD boli hlavné účinné zložky (1 a 8) charakterizované zo surového extraktu (obrázok 4) porovnaním s retenčným časom čistého 1 (z laboratórnej syntézy, údaje zatiaľ nepublikované) a 8 (zo Sigmy). ako štandardy. Boli použité zásobné roztoky 1, 10, 20, 40, 60, 80 a 100 ug/ml. Každá koncentrácia bola injikovaná trojmo. Obsahové pomery 1 a 8 v extrakte vysušeného materiálu boli kvantifikované na 0,009 percent a 0,15 percent (hmotn./hmotn.) lineárnou regresiou príslušných plôch píkov.

2.3. In vivo test pigmentácie zebrafish

Okrem hodnotenia účinku zlúčeniny 8 na in vitroantimelanogenézabola ďalej skúmaná jeho in vivo antipigmentačná schopnosť prostredníctvom testu pigmentácie zebrafish. Zebrafish bola považovaná za výhodný modelový organizmus stavovcov kvôli svojej malej veľkosti, vysokej plodnosti a podobným génovým sekvenciám a orgánovým systémom ako ľudské bytosti. Okrem toho proces pigmentácie melanínu na jeho povrchu, ktorý umožňuje ľahké pozorovanie, robí zebričku obzvlášť užitočným modelom na skúmanie vivomelanogénnych inhibítorov alebo stimulátorov [50]. V tejto štúdii sa ako pozitívna kontrola použil arbutín v koncentrácii 20 mM a na porovnanie so zlúčeninou 8 s rovnakou hladinou koncentrácie bol zahrnutý arbutín 20 uM. Po inkubácii embryí zebrafish od 7 hpf do 72 hpf, zlúčenina 8 vykazovala vyššiu aktivitu inhibície pigmentácie pri koncentráciách 10 a 20 uM v porovnaní s arbutínom (20 uM) (obrázok 5). Po ošetrení 20 uM zlúčeniny 8 sa hladina pigmentácie u zebričiek výrazne zníži o približne 31 percent; zatiaľ čo zlúčenina 8 pri 10 uM znižuje úroveň pigmentácie o 26,2 percent.

2.4. Test životaschopnosti ekvivalentov ľudskej epidermálnej kože

Bezpečnosť kozmetických výrobkov je vážnym problémom. Napríklad hydrochinón, účinný prostriedok na zosvetľovanie pokožky, bol zakázaný z trhu kvôli početným nežiaducim reakciám a sporom o potenciálnom karcinogénnom riziku [7]. Kyselina kojová, silný inhibítor tyrozinázy, môže vyvolať kontaktnú dermatitídu a potenciálnu genotoxicitu [51,52]. Aby sa vyhodnotila bezpečnosť zlúčenín 1 a 8 na ľudskej koži, uskutočnili sme test životaschopnosti buniek na modeli ekvivalentov ľudskej kože (HSE). HSE sú trojrozmerné kultivačné systémy, ktoré sa vytvárajú nasadením ľudských keratinocytov na vhodný dermálny substrát vopred naočkovaný ľudskými fibroblastmi. HSE sú fyziologicky porovnateľné s prirodzenou kožou a poskytujú vhodné alternatívy pre testovanie na zvieratách. V podmienkach kontrolovanej kultivácie vykazujú HSE vysokú podobnosť s prirodzeným tkanivom, z ktorého boli odvodené [53]. V tejto štúdii sa uskutočnili testy životaschopnosti na normálnych ľudských epidermálnych keratinocytoch (NHEK) v Leidenských epidermálnych modeloch (LEM). Zlúčeniny 1 a 8 neovplyvnili životaschopnosť buniek pri koncentráciách 10-100 uM. Životaschopnosť buniek zlúčeniny 1 je 98 percent a 106 percent pri koncentráciách 10 a 100 uM, v danom poradí. Životaschopnosť buniek zlúčeniny 8 je 97 percent a 92 percent pri koncentráciách 10 a 100 uM, v danom poradí. V súlade s tým zlúčeniny 1 a 8 nevykazovali cytotoxicitu proti NHEK v Leidenských epidermálnych modeloch pri koncentráciách pod 100 uM (obrázok 6). Pretože účinná koncentrácia 8 je pod 100 µM, čo naznačuje, že 8 by mohla byť bezpečná pre pokožkubieleniepod testovanými koncentráciami. V praxi však môžu byť kozmetické výrobky aplikované na ľudskú pokožku po dlhú dobu, a preto je potrebné ďalej vykonávať predĺžené experimentálne obdobie testovaných zlúčenín na HSE.

2.5. Štúdia molekulárneho dokovania B16-musculus tyrozinázy

Tyrozinázová katalýza je krokom limitujúcim rýchlosť biosyntézy melanínu. Inhibícia tyrozinázy je teda najbežnejším prístupom na dosiahnutie belosti kože [54,55]. Aby sa zistilo, či L. sinense potlačenémelanogenézav bunkách B16-F10 prostredníctvom inhibície tyrozinázy sa uskutočnili 3D modely tyčiniek (obrázok 7A) a 2D diagram (obrázok 7B) molekulárneho dokovania pomocou softvéru DS, ktoré odhalili možný inhibičný mechanizmus zlúčeniny 8 na myši (Mus musculus) tyrozináza. Ukázalo sa, že aktívne miesto myšej tyrozinázy sa nachádzalo v doméne obklopenej aminokyselinami His377, Asn378, His381, Gly389, Thr391, Ser394 spolu s dvoma iónmi medi. Interakčná energia CDOCKER medzi enzýmom a inhibítorom bola -46,0067 kcal/mol. Výsledky simulácie ukázali, že hydrofóbne aminokyseliny vrátane Gly389, Asn 378, Thr391 Ser394, His 404 a His192 okolo katalytického miesta vytvorili van der Waalsove sily so zlúčeninou 8. Navyše, oxygenatóm -laktónovej skupiny 8 tvorí vodíkové väzby s His21577 a His. , pričom jeho karbonylová skupina tvorí koordinačné väzby s dvoma iónmi medi. Tiež sa pozorovalo, že cyklohexénový kruh a bután vykazovali slabú n-alkylovú interakciu s His381 a His215. Predchádzajúce štúdie preukázali, že extrakt z L. sinense vykazoval inhibíciu tyrozinázy húb a down-reguláciu expresie tyrozinázovej mRNA v bunkách B16-F10 [21,56]. Pretože molekulárne dokovanie ilustrovalo silnú interakciu medzi aktívnou doménou myšej tyrozinázy a zlúčeninou 8, bolo navrhnuté, že (3S,3aR)-neoknidilid (8) vykazoval antimelanogenéznu aktivitu v dôsledku zoslabenia aktivity tyrozinázy a ďalšieho znižovania produkcie melanínu. Okrem inhibície tyrozinázy však existujú aj ďalšie základné mechanizmyantimelanogenézaaktivitu (3S,3aR)-neoknidilidu (8) je potrebné ďalej skúmať.

3. Materiály a metódy

3.1. generál

Rozpúšťadlá pre HPLC, n-hexán, etylacetát, metanol a acetonitril, boli zakúpené od JT Baker (Phillipsburg, NJ, USA). Etanol bol zakúpený od spoločnosti Merck (Darmstadt, Nemecko). -Melanocyty stimulujúci hormón (-MSH), dimetylsulfoxid (DMSO), fyziologický roztok pufrovaný fosfátom (PBS), 3-(4,5-dimetyltiazol-2-yl)-2 ,5-difenyltetrazoliumbromid (MTT) boli zakúpené od Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA). Chromatografia na otvorenej kolóne sa uskutočnila na silikagéli (70–230 mesh, Merck, Darmstadt, Nemecko). Vopred potiahnuté silikagélové platne 60 F254 a hliníkové dosky RP-18 F254S pre TLC boli zakúpené od spoločnosti Merck (Darmstadt, Nemecko). Optické rotácie sa merali na polarimetri JASCO P-1020 (Jasco, Tokio, Japonsko). 1H a13C NMR boli získané pomocou spektrometra Bruker Avance DRX-500 (Bruker, Rheinstetten, Nemecko). Hmotnostné spektrá s nízkym rozlíšením a vysokým rozlíšením sa získali pomocou ABI API 4000 Q-TRAP ESI-MS (Applied Biosystem, Foster City, CA, USA) a Q-Exactive Plus HR-ESI-MS (Thermo Fisher Scientific, MA, USA ), resp. IR spektrá boli zaznamenané na spektrometri JASCO FT/IR 4100 (Jasco, Tokio, Japonsko).

3.2. Rastlinné materiály

Sušený podzemok L. sinense Oliv. bol zakúpený od Sheng Chang Pharmaceutical Co., Ltd., Taoyuan, Taiwan.

3.3. Izolácia a štrukturálne objasnenie

Vysušený podzemok (9,9 kg) L. sinense sa rozdrvil a extrahoval metanolom (4 0 1 x trikrát), ktorý sa prefiltroval a odparil, čím sa získal čierny zvyšok (1758 g). Tento zvyšok sa potom suspendoval v H20 (3 {48}} 1) a rozdelil s rovnakým objemom etylacetátu a n-BuOH trikrát postupne. Každá vrstva sa skoncentrovala za zníženého tlaku, čím sa získali vrstvy EtOAc (415 g), n-BuOH (147 g) a H20 (896 g). Následne bola vysušená etylacetátová vrstva (25{{100}} g) zmiešaná s 375 g silikagélu a bola nanesená na kondicionovanú otvorenú kolónu naplnenú 3550 g silikagélu a eluovaná v kroku gradientová metóda zmesami n-hexánu, etylacetátu a metanolu. Každých 500 ml sa odoberie pre jednu frakciu a analyzuje sa TLC. Potom sa všetky frakcie spojili do ôsmich častí I–VIII podľa výsledkov TLC analýz, ktoré sa znovu rozpustili v minimálnom objeme zmesí n-hexán-etylacetát použitých v nasledujúcom systéme HPLC. Časť II eluovaná zmesou n-hexán-etylacetát (95:5) sa čistila semipreparatívnou HPLC (Hibar®Fertigäute, 10 x 250 mm) s použitím zmesi n-hexán-etylacetát (96:4) ako elučného činidla pri prietokovej rýchlosti 3 ml/min, čím sa získa 6 (4,2 mg, tR=19,8 min), 3 (6,1 mg, tR=21,2 min), 5 (32 mg, tR=23 0,5 minúty) a 7 (79 mg, tR=28,0 min). :1) ako eluent pri prietokovej rýchlosti 3 ml/min, čím sa získa 4 (36 mg, tR=32,5 min). Časť III eluovaná zmesou n-hexán-etylacetát (90:10) sa prečistí semi-preparatívna HPLC (Phenomenex®Luna, 10 x 250 mm) s použitím n-hexán-acetón (95:5) ako eluenta pri prietokovej rýchlosti 3 ml/min, čím sa získa zlúčenina 8 (1,7 g, tR=19). 3 minúty). Časť IV eluovaná zmesou n-hexán-etylacetát (80:20) sa čistila semipreparatívnou HPLC (Phenomenex®Luna, 10 x 250 mm) s použitím zmesi n-hexán-etylacetát (85:15) ako elučného činidla pri prietokovej rýchlosti 3 ml/min, čím sa získa 15 (19 mg, tR=24,4 min), 12 (11 mg, tR=26,9 min),9 (25 mg, tR=33 0,8 min), 10 (31 mg, tR=37,0 min), 11 (24 mg, tR=42,5 min). Rovnaká časť sa čistila na tej istej kolóne s použitím n-hexán-etylacetátu (78:22) ako eluentu pri prietokovej rýchlosti 3 ml/min, čím sa získali 14 (10 mg, tR=20,1 min) a 13 ( 22 mg, tR=24,6 min). Rovnaký podiel sa čistil na tej istej kolóne s použitím zmesi n-hexán-etylacetát-acetón (80:10:10) ako elučného činidla pri prietokovej rýchlosti 3 ml/min, čím sa získala zlúčenina 20 (25 mg, tR=13,2 min. ), 17 (15 mg, tR=16,3 min), 18 (28 mg, tR=18,5 min), 16 (132 mg, tR=21,8 min) a 19 (39 mg, tR=25,6 min). Časť V eluovaná zmesou n-hexán-etylacetát (60:40) sa čistila semipreparatívnou HPLC (Hibar®Fertigäute, 10 x 250 mm) s použitím zmesi n-hexán-etylacetát-acetón (68:27:5) ako elučného činidla. pri prietokovej rýchlosti 3 ml/min, čím sa získa 21 (5,3 g, tR=10,2 min), 23 (63 mg, tR=20,0 min), 22 (84 mg, tR { {164}},0 min) a 24 (33 mg, tR=26,5 min). Rovnaká časť sa čistila semipreparatívnou HPLC (Hibar®Fertigäute, 10 x 250 mm) s použitím n-hexán-etylacetátu (72:28) ako eluentu pri prietokovej rýchlosti 3 ml/min, čím sa získala zlúčenina 2 (24 mg, tR=24.3 min). Časť VI eluovaná zmesou n-hexán-etylacetát (40:60) sa čistila semipreparatívnou HPLC (Hibar®Fertigäute, 10 x 250 mm) s použitím zmesi n-hexán-etylacetát (53:47) ako elučného činidla pri prietokovej rýchlosti 3 ml/min, čím sa získa zlúčenina 1 (47 mg, tR=13,2 min).

3.4. Spektroskopické údaje

Kyselina {{0}}[3-(4-hydroxy-3-metoxyfenyl)alyl]ferulová (1): bezfarebný olej; []25D plus 5,6◦(c 0,12, CH30H);IR (čistý) vmax 3444, 2935, 1633, 1509, 1434, 1376, 1267, 1153; pozitívny ESI-MS m/z 357,2 [M plus H] plus; pozitívny HRESI-MS m/z 357,1331 [M plus H] plus (vypočítané pre C20H2106, 357,1333); Údaje 1H a 13C NMR pozri tabuľku 1. Cis-4-pentylcyklohex-3-én-1,2-diol (2): bezfarebný olej; [ ]22D-20,3◦(c 0,20, CH3OH); IR (čistý) vmax 3445, 2919, 1660, 1455, 1371, 1225, 1084; ESIMS m/z 185,2 [M plus H] plus; HRESI-MS m/z 185,1501 [M plus H] plus (vypočítané pre C11H2102, 185,1541); Údaje 1H a 13C NMR pozri tabuľku 2.

3.5. HPLC-DAD analýza

Chromatografické analýzy sa uskutočňovali na systéme Hitachi HPLC, ktorý pozostával z L{{0}}čerpadla, L-7200 autosamplera, L-7455 detektora a D-7000 systému manažéra softvéru na zber údajov na kolóne XBridgeTM C18 (dĺžka 25 0 mm, vnútorný priemer 4,6 mm, veľkosť častíc 5 um; Waters). Mobilná fáza pozostávala z H20 (rozpúšťadlo A) a CH3CN (rozpúšťadlo B). Prietok bol 1,0 ml/min. Elučný program bol nasledovný: izokratický s 2 percentami B (0 – 5 min), 2 – 20 percentami B (5 – 25 min), 20 – 90 percentami B (25 – 30 min. ) a izokratické s 90 percentami B (30–35 minút). Objem nástreku bol 10 1. UV-viditeľné spektrá sa zaznamenávali pri 240 nm.

3.6. Bunková kultúra

Bunky myšacieho melanómu B16-F10 (CRL6475) boli zakúpené od Výskumného a vývojového inštitútu potravinárskeho priemyslu (FIRDI, Hsinchu, Taiwan). Bunky sa kultivovali v 90 percentnom Dulbeccovom modifikovanom Eagleovom médiu (DMEM, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) doplnenom 10 percentami fetálneho bovinného séra (FBS, Sigma, St. Louis, MO, USA) a 1 percentom kultivačné banky s roztokom penicilínu a streptomycínu v CO2 inkubátore so zvlhčenou atmosférou obsahujúcou 5 percent CO2 vo vzduchu pri 37 ◦C. Kultivačné médium sa menilo každé dva dni. Bunky boli zozbierané trypsinizáciou, keď boli približne na 85 percent konfluentné, spočítané pomocou hemocytometra (Neubauer Improved., Marienfeld, Nemecko) a naočkované vo vhodných počtoch do jamiek doštičiek na kultiváciu buniek pre ďalšie experimenty.

3.7. Test bunkovej životaschopnosti

Aby sa určila bezpečnosť rôznych extraktov, životaschopnosť buniek po ošetrení extraktmi bola stanovená MTT testom. Táto metóda je založená na redukcii 3-(4,5-dimetyltiazol-2-yl)-2,5-difenyltetrazoliumbromidu (MTT) na formazan mitochondriálnymi enzýmami v životaschopných bunkách [57]. Množstvo vytvoreného formazanu je úmerné počtu prítomných životaschopných buniek a možno ho merať spektrofotometricky. Stručne povedané, bunky vopred ošetrené 100 nM hormónom stimulujúcim melanocyty (-MSH) nasadené v hustote 1 x 104 buniek/jamku v 12-jamkovej doštičke sa nechali priľnúť cez noc. Do každej jamky sa potom pridali čisté izoláty alebo arbutín a inkubovali sa ďalších 72 hodín. Potom boli ošetrené bunky označené MTT farbivom (Applichem, Dánsko) v PBS (2 mg/ml) počas 3 hodín. Precipitáty formazánu sa rozpustili v DMSO a koncentrácie sa merali pri 570 nm v čítačke mikrodoštičiek. Životaschopnosť buniek sa vypočítala pomocou nasledujúceho vzorca: životaschopnosť buniek ( percentá )=(vzorka/kontrola A) × 100, kde A vzorka a kontrola A sú absorbancie zo zmesi s alebo bez pridania testovanej vzorky, resp.

3.8. Test obsahu melanínu

Obsah melanínu sa meral tak, ako bolo opísané vyššie, s miernymi modifikáciami [58]. Bunky melanómu B16-F10 sa naočkovali 1 x 104 buniek/jamka v 3 ml média v 6-jamkových kultivačných platniach a inkubovali sa cez noc, aby sa bunkám umožnilo priľnúť. Bunky boli vystavené rôznym koncentráciám (25, 50 a 100 uM) čistých izolátov alebo arbutínu počas 72 hodín v prítomnosti 100 nM -MSH. Na konci ošetrenia boli bunky premyté PBS a lyzované 150 ul 1 N NaOH (Merck, Nemecko) s obsahom 10 percent DMSO počas 1 hodiny pri 80 °C. Absorbancia pri 405 nm sa merala pomocou čítačky mikrodoštičiek. Obsah melanínu v bunkách melanómu B16-F10 bez ošetrenia zlúčeninou sa určil ako 100 percent a obsah melanínu v bunkách ošetrených zlúčeninou sa vypočítal vzhľadom na kontrolnú skupinu.

3.9. In vivo test pigmentácie zebrafish

Protokol používania zvierat bol preskúmaný a schválený Inštitucionálnym výborom alebo panelom pre starostlivosť o zvieratá (IACUC/IACUP) Taipei Medical University (č. LAC-2017-0311). Metódy boli vykonané v súlade s príslušnými zákonmi a schválených smerníc. Embryá zebričiek divokého typu boli odobraté z jadrového zariadenia Zebrafish na lekárskej univerzite v Taipei. Hodnotenie embryí zebričky na základe fenotypu sa uskutočnilo podľa predchádzajúcej štúdie s miernou úpravou [50]. Embryá sa inkubovali pri 28 °C s 1 percentom etanolu ako kontrolou a odlišnou koncentráciou zlúčenín od 7 hpf (po oplodnení) do 72 hpf. Na vyhodnotenieanti-melanogenézaúčinky melanogénnych modulátorov na vývojový proces zebričiek, pigmentácia zebričiek sa analyzovala pri 72 hpf. Embryá sa umiestnili do 1-percentnej agarózy s nízkou teplotou topenia (Bioshop Canada, Burlington, ON, Kanada) a zachytili sa snímky pomocou stereomikroskopu ZEISS Stemi508 (ZEISS, Oberkochen, Nemecko). Analýza merania obrazových pixelov bola vykonaná balíkom Fiji od ImageJ. Kvantifikácia údajov o pigmentácii bola analyzovaná (oblasť pod očami zebričky) a porovnaná s kontrolnou skupinou.

3.10. Test životaschopnosti na normálnych ľudských epidermálnych keratinocytoch

Všetky primárne ľudské kožné bunky od zdravých darcov, ktoré používa Dermatologické oddelenie Lekárskeho centra Leidenskej univerzity, sa izolujú z nadbytočného tkaniva odobraného podľa článku 467 holandského zákona o dohode o lekárskej liečbe a Kódexu pre správne používanie ľudského tkaniva Holandskej federácie biomedicíny vedecké spoločnosti. Podľa článku 467 je možné použiť nadbytočné tkanivá, ak pacient nevznesie námietky. To znamená, že pacient, ktorý podstúpi plastickú operáciu, je o výskume dobre informovaný. Žiadny z autorov sa nepodieľal na odbere vzoriek tkaniva. Pri práci s ľudskými tkanivami boli dodržané princípy Helsinskej deklarácie.

Na izoláciu normálnych ľudských epidermálnych keratinocytov (NHEK) sa použila čerstvá nadbytočná koža jednej samice, ako už bolo opísané [59]. NHEK v Leidenepidermálnych modeloch (LEM) sa inkubovali cez noc za ponorených podmienok v keratinocytédiu. Do štyroch dní sa postupne vynechalo fetálne hovädzie sérum a NHEK v LEM sa kultivovali bez séra na rozhraní vzduch-kvapalina počas siedmich dní, zatiaľ čo kultivačné médium sa obnovovalo dvakrát týždenne. Testy životaschopnosti sa uskutočnili pridaním 0,5 ml 1 mg/ml MTT do každého z NHEK v LEM na 3 hodiny, po 24 hodinách vystavenia testovaným zlúčeninám 1, 8 a DMSO (negatívna kontrola). vyzrážaný modrý formazanový produkt sa extrahoval z buniek v priebehu 2 hodín pomocou 0,5 ml izopropanolperovej jamky. Koncentrácia formazanu sa merala stanovením OD pri 570 nm s použitím čítačky mikrodoštičiek aTecan Infinite F50.

3.11. Štatistická analýza

Všetky údaje v našej štúdii boli získané ako priemery experimentov, ktoré sa uskutočnili aspoň trikrát a vyjadrené ako priemer ± SD (štandardná odchýlka). Štatistická analýza sa uskutočnila študentským t-testom. Štatistická významnosť výsledkov bola stanovená na p < 0.05="" (*)="" a="" p="">< 0,01="">

3.12. Štúdia molekulárneho dokovania B16-musculus tyrozinázy

3.12.1. Homologické modelovanie

Keďže v súčasnosti nie sú k dispozícii žiadne trojrozmerné štruktúry pre tyrozinázu Mus musculus, Homologymodeling je najspoľahlivejšou metódou na predpovedanie trojrozmerných štruktúr neznámeho proteínu na základe predpokladu, že štruktúra neznámeho proteínu je podobná známym štruktúram nejakého homologického odkazu. bielkoviny. Získali sme aminokyselinovú sekvenciu tyrozinázy Mus musculus z Národného centra pre biotechnologické informácie. databáza proteínových sekvencií. Homológny proteínový templát dopytovaného proteínu Mus musculustyrozinase bol identifikovaný pomocou Phyre2 (Protein Homology/analog Y Recognition Engine V 2.0) [60]. 446 zvyškov (81 percent Mus musculus sekvencie ) boli modelované so 100,0-percentnou spoľahlivosťou pomocou jedinej šablóny s najvyšším skóre ako PDB kód: c5m8pA bol vybraný ako receptor pre štúdie dokovacích výpočtov.

3.12.2. Analýza interakcie ligand-proteín

Väzbové miesto tyrozinázy Mus musculus sa určilo na základe referenčnej humantyrozinázy (PDB 5M8M) so šiestimi aminokyselinovými zvyškami a väzobné vrecko má dve meď. Preto bola definovaná sféra väzbového miesta. Následne sa pripravila 3D štruktúra zlúčeniny 8 a optimalizovala sa minimalizáciou energie ukotvením do väzbového vrecka Mus musculus tyrozinázy pomocou programu CDOCKER a počet dokovacích cyklov bol nastavený na 50 pre inhibítor. Všetky ostatné parametre boli nastavené ako predvolené pre analýzu interakcie ligand-proteín pomocou BioviaDiscovery Studio v.4.0 (Accelrys Software Inc., San Diego, CA, USA). Nakoniec sa z 50 dokovacích konformácií vybrala horná s najvyšším energetickým skóre CDOCKER, aby sa preskúmal režim viazania dokovanej zlúčeniny v aktívnom mieste tyrozinázy Mus musculus.

4. Závery

V tejto štúdii sme prijali metódu riadenú biologickým testom s použitím buniek B16-F10 na izoláciu zložiek antimelanogenézy z extraktov rhizoma L. sinense. Aktívnymi zložkami boli kyselina 5-[3-(4-hydroxy-3-metoxyfenyl)alyl]ferulová (1) a (3S,3aR)-neoknidilid (8). Podľa HPLC analýzy obsah zlúčeniny 8 predstavuje 0,15 percenta surového extraktu. Theantimelanogenézaaktivita 8 bola overená tak in vitro B16-bunkami F10, ako aj in vivo testami na zebrafish. Všetky tieto zistenia naznačujú, že 8 môže prinajmenšom poskytnúť zdôvodnenie potenciálu L. sinense pre jeho vysokú potenciu a množstvo . Údaje o životaschopnosti buniek B16-F10 buniek a NHEK jednoducho, že 8 by sa mohol potenciálne vyvinúť ako antimelanogenéza. Predpokladá sa, že spôsob účinku 8 na antimelanogenézu je inhibícia tyrozinázovej aktivity na základe výsledkov molekulárneho dokovania; to však ešte treba potvrdiť. Naše zistenie odhalilo, že zlúčenina 8 vykazovalaanti-melanogenézaúčinky a bezpečnosť prostredníctvom štúdií in vitro, in vivo a ex vivostu, avšak depigmentačná účinnosť a biologická bezpečnosť na ľudskej koži sa musia v budúcnosti vyhodnotiť a overiť klinickými skúškami.