Metaanalýzy identifikujú metyláciu DNA spojenú s funkciou a poškodením obličiek

edmund.chen@wecistanche.com

Chronickýochorenie obličiekje veľkou záťažou pre verejné zdravie. Meradlom je zvýšený pomer albumínu ku kreatinínu v močipoškodenie obličiek,a používa sa na diagnostiku a štádium chronickejochorenie obličiek. Rozšíriť poznatky o regulačných mechanizmoch súvisiacich sfunkcie obličieka ochorení, vykonali sme krvnú asociačnú štúdiu pre celý epigenóm pre odhadovanú rýchlosť glomerulárnej filtrácie (n=33, 605) a pomer albumínu ku kreatinínu v moči (n=15, 068) a zistili sme 69 a sedem miest CpG, kde bola metylácia DNA spojená s príslušným znakom. Väčšina týchto zistení ukázala priamo konzistentné asociácie s príslušnými klinickými výsledkami chronickej chorobyochorenie obličieka mierne zvýšená albuminúria. Asociácie metylácie DNA sfunkcie obličiek, ako sú CpG na JAZF1, PELI1 a CHD2 boli validované vobličkové tkanivo. Metylácia na PHRF1, LDB2, CSRNP1 a IRF5 naznačila kauzálne účinky nafunkcie obličiek. Analýzy obohatenia odhalili dráhy súvisiace s hemostázou a migráciou krvných buniek pre odhadovanú rýchlosť glomerulárnej filtrácie a aktiváciu a odpoveď imunitných buniek na CpG spojené s pomerom albumínu a kreatinínu v moči.

Kľúčové slová:ochorenie obličiek; poškodenie obličiek; funkcia obličiek; obličkové tkanivo; štruktúra obličiek

chronickýochorenie obličiek(CKD) predstavuje veľkú záťaž pre verejné zdravie. Postihuje viac ako 10 percent dospelých na celom svete a viac ako 40 percent osôb vo veku 70 rokov a starších1,2. CKD je hlavnou príčinou úmrtí na celom svete3 a je hlavným prispievateľom ku kardiovaskulárnej morbidite a úmrtnosti2,4,5. CKD je definovaná ako trvalá prítomnosť abnormalítobličkyštruktúru alebo funkciu. Thefunkcie obličieknajčastejšie používané merania sú rýchlosť glomerulárnej filtrácie, zvyčajne odhadovaná z koncentrácií kreatinínu v sére (eGFR) a pomer albumínu ku kreatinínu v moči (UACR)6. Zvýšené UACR je mieroupoškodenie obličiek, ktorý sa používa na diagnostiku a štádium CKD7 a je spojený s diabetom a hypertenziouochorenie obličiek8. Aj mierne zvýšená UACR je nezávisle od iných rizikovým faktorom kardiovaskulárnych ochorenífunkcie obličiek markers such as eGFR9. Familial aggregation studies of CKD and eGFR revealed a substantial heritable component of up to 54%9–11. Only a small part of this heritability is attributed to classical monogenic diseases. Rather, CKD susceptibility is influenced by DNA sequence variants in many genes, environmental factors, and their interactions. Genome-wide association studies (GWAS) have successfully identified common variants at >400 genetických lokusov, ktoré sú spojené sfunkcie obličiek10,12,13. Varianty indexu v známych lokusoch spojených s eGFR vysvetľujú odhadovaných 8,9 percent rozptylu eGFR12.Nedávna metaanalýza GWAS integrovaných otvorených chromatínových oblastí eGFR s malými súbormi jednonukleotidových polymorfizmov (SNP)10. Výsledky z tejto štúdie podporujú dôležitosť zmenenej transkripčnej regulácie ako mechanizmu prispievajúceho k CKD. Skúmať metyláciu DNA s ohľadom nafunkcie obličiekboli uskutočnené epigenómové asociačné štúdie (EWAS) eGFR a CKD. Ako kľúčový regulátor transkripcie, ktorý možno hodnotiť nákladovo efektívnym a vysoko výkonným spôsobom, bola metylácia DNA študovaná na miestach CpG (CpG) s rozlíšením jednej bázy. Predtým sme vykonali EWAS vrátane 4 859 dospelých z dvoch populačných štúdií a identifikovali sme 18 validovaných, rozdielne metylovaných miest v celej krvi spojených s eGFR14. Hoci táto štúdia odhalila poznatky o mechanizmoch regulácie génovobličkysúvisiace CpG vysvetlili iba 1,2 percenta rozptylu eGFR. Iné predchádzajúce štúdie boli zamerané na pacientov s CKD a/alebo pacientov s diabetom alebo pacientov s infekciou vírusom ľudskej imunodeficiencie, alebo boli obmedzené malou veľkosťou vzorky, nedostatočnou replikáciou, chýbajúcim prispôsobením pre potenciálne zmätočné faktory alebo ich kombináciou14–19. Ďalšie štúdie sa zamerali na vzorce metylácie DNA u diabetikovochorenie obličiek(DKD) pacienti20–22.

CISTANCHE ZLEPŠÍ OCHORENIE OBLIČIEK/OBLIVÍN

Tu sme vykonali EWAS zfunkcie obličiekvlastnosti na identifikáciu ďalších CpG súvisiacich s génovými regulačnými mechanizmami, ktoré sú potenciálne dôležité pre CKD. Rozšírili sme bývalý EWAS pre eGFR a CKD podstatným zvýšením veľkosti vzorky na 33 605 jedincov. Okrem toho sme ako ďalšie znaky zahrnuli UACR a mierne zvýšenú albuminúriu (mikroalbuminúriu). EWAS sa uskutočňovali v prevažne populačných štúdiách prispôsobených pohlaviu, veku, cukrovke, hypertenzii, indexu telesnej hmotnosti (BMI), fajčeniu a najpočetnejším podielom bielych krviniek. Replikovali sme naše výsledky EWAS v samostatných vzorkách, priradili sme miesta CpG k úrovniam génovej expresie v rôznych tkanivách, aplikovali sme zistenia na klinické výsledky a hodnotili kauzalitu medzi metyláciou DNA afunkcie obličiek(Doplnkový obr. 1).

Výsledky

Charakteristiky študijnej vzorky. V tomto vyšetrovaní prispelo 36 štúdií s celkovým počtom 33 605 účastníkov k EWAS eGFR a 15 068 k EWAS UACR. Ich súhrnné charakteristiky sú uvedené v tabuľke 1 a popisy jednotlivých štúdií sú uvedené v doplnkových údajoch 1 a 2.

EWAS eGFR a UACR.Skúmali sme asociáciuobličkyvlastnosti s metyláciou DNA v krvi až do 441 870 CpG, prekrytie CpG pokrytých čipom Illumina MethylationnEPIC BeadChip a poľom Illumina HumanMethylation450 BeadChip, ktoré sa použili na meranie vo všetkých štúdiách okrem jednej (doplnkové údaje 3). Všetky štúdie vykonali čistenie údajov poľa a použili centrálne vyvinuté skripty na prípravu súboruobličkyhodnoty vlastností, ktoré následne súviseli s metyláciou DNA pomocou lineárnych regresných modelov upravených pre kovariát s hodnotami metylácie ako závislou premennou podľa vopred špecifikovaných protokolov štúdie (pozri Metódy). V EWAS špecifických pre štúdiu sme nezaznamenali žiadnu alebo len malú infláciu (priemerná inflácia eGFR=1.00, priemerná inflácia UACR=1.00, doplnkové údaje 1 a 2). V trans-etnickom EWAS upravenom na viacero premenných bolo 69 CpG významne asociovaných s eGFR a replikovaných (obr. 1A, doplnkové údaje 4, pozri metódy), vrátane predtým hlásených14. Replikované miesta vykazovali jasný vzor nižšej metylácie (60 CpG, Pbinom=2.2E-10; Obr. 1A).

Obr. 1 Výsledky EWAS eGFR a UACR. Chicago grafy výsledkov epigenómovej celospoločenskej štúdie (EWAS) pre odhadovanú rýchlosť glomerulárnej filtrácie (eGFR) (A) a pomer albumínu ku kreatinínu v moči (UACR) (B) pomocou kombinovanej vzorky na objavenie a replikáciu. Miesta sú zoradené podľa ich chromozomálnej polohy na osi x, pričom na osi y je uvedená ich –log10 P-hodnota asociácie Wald-test. CpG pozitívne korelujúce so znakom sú vynesené v hornej časti, miesta s negatívnou koreláciou v dolnej časti. Bodkované vodorovné čiary predstavujú hladinu významnosti (P-hodnota < 1,1e−7).="" miesta="" nových="" replikácií="" sú="" zafarbené="" oranžovo,="" známe="" replikované="" miesta="" sú="" zafarbené="" tyrkysovo="" a="" miesta,="" ktoré="" boli="" dodatočne="" spojené="" s="" príslušným="" binárnym="" znakom="">ochorenie obličiek[CKD]/ mikroalbuminúria [MA]) sú označené krížikom.

V metaanalýze boli najnižšie P-hodnoty pozorované pre známe asociácie eGFR vrátane cg17944885 (ZNF788,=−1.75E−04, P-hodnota=8.7E−41), cg23597162 (JAZF1 ,=−1.48E−04, P-hodnota=3.2E−24) a cg06158227 (ZSCAN29,=−1.08E−04, P-hodnota=8 .7E−20)14, po ktorom nasleduje nové zistenie na cg20777437 (CDCP2,=−8.28E−05, hodnota P=1.1E−17). Len 69 replikovaných CpG spojených s eGFR vysvetlilo 15,7 percent variácií eGFR v samostatnej vzorke štúdie 1888 účastníkov (pozri Metódy). Po pridaní všetkých premenných (pohlavie, vek, cukrovka, hypertenzia, BMI, fajčenie a proporcie bielych krviniek) do asociačného modelu sa celkový podiel vysvetleného rozptylu v eGFR zvýšil na 36,3 percenta, pričom 2,4 percentá variácia sa pripisuje 69 CpG. nezávisle od ostatných kovariantov.

V transetnickej analýze UACR bolo sedem CpG významne asociovaných a replikovaných (obr. 1B, doplnkové údaje 5, pozri metódy). Zo zistení cg18181703 (SOCS3,=−2.58E−03, P-hodnota=2.6E−13) a cg02711608 (SLC1A5,=−1.63 E−03, P-hodnota=9.9E−13) mala najmenšie P-hodnoty asociácie metaanalýzy. Pri šiestich zo siedmich CpG bola nižšia metylácia spojená s vyšším UACR. Kvôli počtu replikovaných miest bola sila binomického testu obmedzená (6 CpG, pbinom=0.13; obr. 1B). Replikované CpG vysvetlili 3,9 percenta a úplný model 14,6 percenta variácií v úrovniach UACR, pričom 0,07 percenta sa pripisuje CpG nezávisle od ostatných kovariát.

Medzi replikovanými EWAS a predtým hlásenými lokusmi GWAS bolo nízke prekrytie pre eGFR (prekrytie=10 zo 69; doplnkové údaje 4) a UACR (prekrytie=1 zo 7; doplnkové údaje 5). Nedošlo k žiadnemu prekrývaniu replikovaných CpG medzi eGFR a UACR, čo naznačuje profily metylácie DNA v krvi špecifické pre danú vlastnosť. Dokonca aj medzi 967 a 270 sugestívnymi asociáciami (P-hodnota < 1e-05)="" kombinovanej="" metaanalýzy="" vzorky="" objavu="" a="" replikácie="" pre="" egfr="" a="" uacr,="" v="" uvedenom="" poradí,="" sa="" medzi="" oboma="" znakmi="" prekrývalo="" iba="" 10="" miest.="" podrobné="" výsledky="" z="" týchto="" metaanalýz="" pre="" všetky="" sugestívne="" asociácie="" sú="" uvedené="" v="" doplnkových="" údajoch="" 6="" (egfr)="" a="" 7="">Heterogenita predkov a robustnosť nálezov. Aby sme posúdili, či výsledky asociácie na eGFR a UACR môžu byť poháňané špecifickým pôvodom, vykonali sme metaanalýzu EWAS s predkov stratifikovaných vzoriek európskeho pôvodu (EA) a afroamerického pôvodu (AA) s výsledkami z viacerých štúdií, ktoré prispeli k týmto dvom etniká. Porovnanie výsledkov asociácie replikovaných CpG vo vzorkách EA (Negar=23,671; nUACR=9806) so vzorkami AA (neGFR =

5019; nUACR = 1921) showed similar effect sizes (reGFR = 0.87, rUACR = 0.74). The effect directions of almost all replicated CpGs were concordant between the ancestries (Fig. 2, Supplementary Data 4 and 5). The only exception was the UACR association cg22304262 in SLC1A5 which, however, was not significant in AA (P-value = 0.39, Supplementary Fig. 2). This association, as well as the CpGs at JAZF1 and RPS10P7 for eGFR, showed significant heterogeneity (eGFR: P-value < 0.05/69, UACR: P-value < 0.05/7) between EA and AA association results (Fig. 2, Supplementary Data 4 and 5). The presence of common SNPs (minor allele frequency >{{0}}.05) v alebo v rámci 50 bp od 69 replikovaných CpG sa hodnotilo, aby sa vyhodnotilo, či prítomnosť SNP môže ovplyvniť väzbu sondy. Štyri sondy boli umiestnené v blízkosti spoločného SNP (doplnkové údaje 4; cg10960375-rs113564504; cg11544657-rs2083577; cg{9}}rs142643977; cg06930757-rs112223111), ktoré však neboli spojené so žiadnou črtou GWAS podľa zdroja PhenoScanner V2 (prístup 02/12/2021, pGWAS < 5e−8,="" vrátane="" proxy="" snp="" s="" eur="" r²=""> 0,8)23. To naznačuje, že je nepravdepodobné, že by výsledky EWAS boli skreslené spoločnou črtou, o ktorej je známe, že sa jej týkafunkcie obličiekblízkou variáciou sekvencie DNA. Vo všeobecnosti sa zistilo, že interné SNP sondy, ktoré boli viac ako päť báz od 3'-konca sondy, majú zanedbateľné dôsledky24.

Vzťah k CKD a mikroalbuminúrii.Zo 69 CpG spojených s eGFR bolo 53 tiež spojených s prevládajúcou CKD v metaanalýze 25,609 jedincov vrátane 2376 prípadov s konzistentným smerom účinku (hodnota P < 0.="" 05/69;="" doplnkové="" údaje="" 4,="" doplnkový="" obrázok="" 3a).="" korelácia="" medzi="" účinkami="" egfr="" a="" ckd="" bola="" vysoká="" (r="-0,93;" obr.="" 3a).="" v="" nezávislej="" kohorte="" 551="" pacientov="" s="" ckd="" bolo="" 65="" cpg="" priamo="" konzistentných="" s="" metaanalýzou="" egfr="" a="" päť="" replikovaných="" (p-hodnota="">< 0,05/69,="" r="0,77;" doplnkový="" obrázok="" 4,="" doplnkové="" údaje="" 4,="" pozri="" metódy).="" v="" tej="" istej="" kohorte="" boli="" cpg="" spojené="" s="" egfr="" cg18194850="" (p-hodnota="1.6E−5)" a="" cg07242931="" (p-hodnota="2.3E−5)" tiež="" spojené="" s="" časom="">zlyhanie obličiekalebo akútnepoškodenie obličiek(Doplnkové údaje 8, pozri Metódy). Všetkých sedem CpG spojených s UACR bolo tiež významne asociovaných s mikroalbuminúriou na vzorke 7279 jedincov vrátane 1186 prípadov s rovnakým smerom účinku ako pri UACR (hodnota P < 0,05/7,="" r="" {{7}="" 3b,="" doplnkové="" dáta="" 5,="" doplnkový="" obrázok="">

Korelácia s génovou expresiou. Aby sme získali prehľad o možných funkčných mechanizmoch CpG spojených s eGFR a UACR, testovali sme koreláciu ich hladín metylácie DNA s hladinami mRNA génov kódovaných v cis v celej krvi, ako aj v krvných monocytoch (pozri metódy, doplnkové údaje 9 ). Známy cg17944885 spojený s eGFR na chromozóme 19 blízko ZNF788 bol spojený s transkriptom kódovaným 240 kb vzdialeným proteínom so zinkovým prstom 439 (ZNF439, tabuľka 2). Okrem toho bola metylácia cg04864179 na interferónovom regulačnom faktore 5 (IRF5) spojená s transkriptmi mRNA kódovanými IRF5 a blízkym transportínom 3 (TNPO3) (doplnkový obrázok 5A). Z asociácií UACR dva replikované CpG cg02711608 a cg22304262 v rodine nosičov rozpustených látok 1 člen 5 (SLC1A5) odhalili významné asociácie s hladinami mRNA SLC1A5 a cg23570810 s jeho interferónom indukovaným transmembránovým proteínom (infrakripčným proteínom T1) 2). Všetky výsledky analýzy génovej expresie sú uvedené v doplnkových údajoch 9.

Účinky na obličkové tkanivo.Na posúdenie, či sa pozorované metylačné účinky v krvi premietnu doobličkové tkanivo,aplikovali sme regresný model na testovanie asociácií replikovaných CpG na signifikantné (miera falošného objavenia (FDR) < 0.05) a smerovo konzistentnú asociáciu s eGFR aobličkyfibróza, v tomto poradí, v 506 mikrodisekovanýchobličkové tkanivovzorky. V týchto vzorkáchobličky- metylácia DNA na báze tkaniva replikovaných CpG spojených s eGFR cg23597162 na JAZF1, cg26099045 v blízkosti PELI1 a cg12644285 na CHD2 bola významne spojená s eGFR s rovnakým smerom účinku ako v krvi (doplnkové údaje 6, doplnková tabuľka 20). . Okrem toho rovnaký CpG na PELI1 a šesť ďalších

miesta (cg20146909 pri LRRC8D, cg25767870 pri FAM46C, cg16618493 pri ZBTB7B, cg10632966 pri RPEL1, cg01068906 pri NOD2 a cg032937731 boli spojené s GDPD fibrózouobličkyvzorky tkaniva s konzistentnými (tj inverznými) smermi účinku (doplnkový obrázok 6B, tabuľka 2). Z replikovaných miest UACR sú hladiny metylácie DNA vobličkytkaniva cg00008629 na PTBP3 a cg24859433 blízko IER3 boli spojené s fibrózou a vykazovali rovnaký smer účinku (doplnkový obrázok 6D, tabuľka 2). V súlade so zisteniami EWAS sa nezistila žiadna významná asociácia CpG spojených s UACR s eGFR u darcov vzorky obličiek (doplnkový obrázok 6C, doplnkové údaje 10).

Kauzálne účinky medzi metyláciou DNA afunkcie obličiekvlastnosti. Na posúdenie, čifunkcie obličiekvlastnosti kauzálne ovplyvňujú metyláciu DNA alebo naopak, vykonali sme obojsmernú dvojvzorkovú analýzu Mendelovej randomizácie (MR) významne asociovaných CpG. Dopredná MR analýza naznačila, že CpGs cg02304370 (PHRF1), cg04460609 (LDB2), cg00501876 (CSRNP1) a cg04864179 (IRF5) kauzálne ovplyvňujú hladiny eGFR (tabuľka 3). Odhady dedičnosti týchto štyroch CpG sa líšili medzi tromi súbormi údajov z populácií európskeho pôvodu, ale boli konzistentne vyššie ako priemerná dedičnosť vo všetkých CpG hodnotených v každej z troch štúdií: 0,34 (kauzálne eGFR CpG) vs. 0,16 (matica HM450K) na základe Hannona a spol. 25, 0,55 vs. 0,19 pre Dongen et al.26 a 0,51 vs. 0,19 pre McRae et al.27. Neboli identifikované žiadne významné kauzálne asociácie pre žiadne CpG spojené s UACR. Pre reverznú MR bol jediný významný účinok eGFR na cg23597162 (JAZF1) pri použití metódy primárnej inverznej variancie. Vo viacerých reverzných analýzach citlivosti na MR sa však nezistili/nepozorovali žiadne významné účinky. Analýzy vynechania 1 neukázali žiadny náznak, že výsledky MR by mohli byť poháňané jediným SNP. Okrem toho, s výnimkou SNP, ktoré boli spojené s diabetes mellitus 2. typu, ktorý je hlavným rizikovým faktoromochorenie obličiekneviedli k rozdielnym zisteniam. Výsledky pre všetky primárne analýzy a analýzy citlivosti MR sú uvedené v doplnkových údajoch 11 a 12 a doplnkovom obrázku 7. Analýzy citlivosti podporujú primárne zistenia významných predčasných výsledkov MR (FDR < 0.05,="" pozri="" metódy)="" s="" odhady="" konzistentného="" účinku,="" čo="" naznačuje="" potenciálne="" kauzálne="" vzťahy="" od="" metylácie="" dna="" k="" egfr,="" ale="" nie="">

Väzba transkripčného faktora, histónová značka a analýza obohatenia dráhy. Vykonali sme analýzy väzbového miesta transkripčného faktora, histónovej značky a analýzy obohatenia dráhy na základe 967 CpG, ktoré vykazovali sugestívnu asociáciu s eGFR (Pvalue < 1e-05;="" doplnkové="" údaje="" 6)="" a="" 270="" cpg,="" ktoré="" vykazovali="" sugestívne="" asociácie="" s="" uacr="" (p-hodnota="">< 1e-5;="" doplnkové="" údaje="" 7)="" v="" metaanalýze="" s="" cieľom="" maximalizovať="" štatistickú="" silu="" analýz="" obohatenia="" (pozri="" metódy)="" 14="" najprv="" sme="" vyhodnotili,="" či="" sú="" cpg="" spojené="" s="" egfr="" prednostne="" mapované="" na="" väzbové="" miesta="" 169="" transkripčných="" faktorov="" (tf)="" na="" základe="" chromatínu="" imunoprecipitačné="" údaje="" o="" sekvenovaní="" dna="" (chip-seq)="" z="" projektu="" encode,="" ktoré="" boli="" agregované="" konsenzom="" pre="" 91="" typov="" ľudských="" buniek="" (161="" tf="" stôp)="" a="" doplnené="" o="">obličkytkanivové stopy (pozri Metódy). Po viacnásobnej testovacej korekcii pre 169 TF vykazovalo osem TF významné obohatenie o CpG spojené s eGFR (FDR < 0,05;="" obr.="" 4a,="" doplnkové="" údaje="" 13),="" vrátane="" cebpb="" (p-hodnota="1)." 75e−06,="" dráha="" krížového="" tkaniva)="" a="" ep300="" (hodnota="" p="7.49E−09," dráha="" krížového="" tkaniva).="" to="" je="" v="" súlade="" so="" zistením="" chu="" a="" kol.14="" v="" menšej="" podskupine="" 4859="" účastníkov="" z="" 33="" 605="" účastníkov,="" ktorí="" sú="" tu="" analyzovaní.="" cpg="" spojené="" s="" uacr="" boli="" obohatené="" o="" väzbové="" miesta="" 56="" tf="" (obr.="" 4b,="" doplnkové="" údaje="" 14)="" s="" najsilnejšou="" asociáciou="" pre="" polr2a="" (p-hodnota="6.93E−19)," fos="" (p-hodnota="" {{32="" }}.28e−12)="" a="" ep300="" (p-hodnota="">

Obličky-funkčne spojené CpG boli široko obohatené o niekoľko histónových značiek, pričom 82 zo 195 kombinácií typov buniek histónových značiek bolo významných (FDR q < 0.05)="" pre="" egfr="" (obr.="" 4c,="" doplnkové="" údaje="" 15)="" a="" 79="" zo="" 195="" pre="" uacr="" (obr.="" 4d,="" doplnkové="" údaje="" 16).="" modifikácia="" histónu="" h3k4me1,="" značka="" sústredená="" na="" aktívne="" a="" primárne="" aktivované="" zosilňovače,="" bola="" obohatená="" o="" všetky="" typy="" buniek="" pre="" cpg="" spojené="" s="" uacr="" a="" takmer="" všetky="" typy="" buniek="" pre="" cpg="" spojené="" s="" egfr.="" zatiaľ="" čo="" cpg="" spojené="" s="" uacr="" vykazovali="" obohatenie="" o="" promótorovú="" značku="" h3k4me3="" v="" 34="" typoch="" buniek,="" iba="" štyri="">

typy vykazovali obohatenie o miesta spojené s eGFR. Naopak, značka H3K36me3 spojená s génovým telom vykazovala oveľa širšie obohatenie pre CpG spojené s eGFR (30 bunkových typov) ako CpG spojené s UACR (päť typov buniek). Na rozdiel od H3K3me1/3 a H3K36me3, ktoré boli všetky spojené s aktívnymi génmi (zosilňovače, aktívne promótory, aktívna transkripcia), H3K9me3 a H3K27me3, ktoré sú vo všeobecnosti spojené s konštitutívnym a fakultatívnym heterochromatínom28–31, neboli významne obohatené o UACR- asociované CpG v akomkoľvek testovanom type bunky (obr. 4D, doplnkové údaje 16). Obohatenie génov implikovanýchfunkcie obličiek-asociované CpG boli hodnotené v databázach Gene Ontology (GO), Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) a Reactome (pozri Metódy)32–35. Významné obohatenie bolo pozorované pre 27 termínov (25 GO, jeden KEGG, jeden reaktóm; doplnkové údaje 17, obr. 5A) pre eGFR a 91 termínov (87 GO, štyri reaktómy; doplnkové údaje 18, obr. 5B) pre UACR (obr. 5B). Dráhy súvisiace s migráciou špecifickou pre typ bielych krviniek, transláciou mRNA, hemostázou a koaguláciou, ako aj inzulínovou odpoveďou, ukázali významné obohatenie o CpG spojené s eGFR (FDR < 0="" 0,05;="" obr.="" 5a).="" v="" dráhach="" s="" najnižším="" obohatením="" p-hodnoty="" pre="" miesta="" spojené="" s="" uacr="" dominovala="" aktivácia="" a="" odpoveď="" imunitných="" buniek="" a="" dráhy="" súvisiace="" s="" interferónom="" (obr.="" 5b).="" ďalšie="" cesty,="" ktoré="" boli="" obohatené,="" zahŕňali="" migráciu="" bielych="" krviniek,="" ako="" v="" prípade="" výsledkov="" egfr="" (doplnkové="" údaje="">

Vzťah k známym asociáciám EWAS s inými vlastnosťami. Vzhľadom na pozorované obohatenie dráh súvisiacich s imunitnou odpoveďou, výsledky metylácie DNA vrátane CpG v blízkosti génov interferónovej dráhy a skutočnosť, že stav metylácie DNA bol hodnotený prevažne v leukocytoch, sme zhodnotili, či naše zistenia môžu byť ovplyvnené mätúcimi účinkami imunitnú odpoveď alebo stav zápalu. Vykonali sme teda vyhľadávanie replikovaných CpG vo veľkom EWAS na vysoko citlivých hladinách sérového C-reaktívneho proteínu (CRP)36. Iba dva CpG, ktoré boli tiež spojené s metyláciou DNA a eGFR vobličkové tkanivo,cg09610644 na BDH1 a cg12644285 na CHD2 patrili medzi miesta spojené s CRP. Zdá sa teda, že všeobecné skreslenie našich výsledkov prostredníctvom zápalového stavu odhadnutého pomocou CRP je nepravdepodobné.

Niektoré zfunkcie obličiek-spojené CpG identifikované v tejto štúdii sú spojené s niekoľkými ďalšími znakmi na základe publikovaných EWAS. Dvadsaťjeden miest eGFR bolo spojených s krvným tlakom, konzumáciou alkoholu, BMI, pohlavím, receptorom rozpustného tumor nekrotizujúceho faktora 2 a/alebo stavom fajčenia a päť miest UACR bolo predtým spojených s konzumáciou alkoholu, fajčením, BMI, dosiahnutým vzdelaním, -glutamyltransferáza, receptor rozpustného tumor nekrotizujúceho faktora 2, diabetes mellitus typu 2 a/alebo niekoľko sérových metabolitov (tabuľka 2, doplnkové údaje 19). Tri z týchto CpG (všetky miesta UACR) boli spojené s viac ako dvoma znakmi, a to cg02711608 v SLC1A5 (s -glutamyltransferázou, -glutamyltreonínom, BMI, konzumáciou alkoholu), cg18181703 v SOCS3 (s diabetes mellitus 2. typu, fajčením, BMI , rozpustný receptor tumor nekrotizujúceho faktora 2) a cg24859433 blízko IER3 (s fajčením, dosiahnutým vzdelaním, 4-vinylfenol_sulfát). Doplnkový obrázok 5B znázorňuje príklad CpG, cg26099045, ktorý koreloval s eGFR a fibrózou vobličkové tkanivov našej analýze a navyše spojené so sexom a fajčením v predchádzajúcich EWAS. Nakoniec, cg17944885 na ZNF788 bol spojený aj s eGFR vo vzorke pacientov s DKD22.

Diskusia

V tomto EWAS zfunkcie obličiekidentifikovali sme a replikovali sme hladiny metylácie DNA v krvi 69 CpG spojených s eGFR. Z nich 60 miest nebolo predtým hlásených, rovnako ako všetkých sedem CpG identifikovaných v spojení s UACR. Väčšina CpG spojených s eGFR a UACR bola tiež významne spojená s ich klinickými výsledkami, tj CKD a mikroalbuminúriou, a preto môžu mať potenciál stratifikácie rizikových jedincov. Rozptyl eGFR pripisovaný týmto 69 CpG bol 2,4 percenta – dvojnásobok oproti predchádzajúcemu EWAS14 a je porovnateľný s rozptylom vysvetleným 29 SNP objavenými GWAS, ktoré zahŕňali trikrát väčšiu veľkosť vzorky na objavenie lokusov37,38. To naznačuje, že diferenciálna metylácia DNA pri jednotlivých CpG kvantifikovaných z krvi vysvetľuje viac rozptylu eGFR ako jednotlivé bežné SNP pri danej veľkosti vzorky. V prípade UACR sa zdá, že na odhalenie podobného počtu CpG spojených so znakmi sú potrebné väčšie veľkosti vzoriek v porovnaní s eGFR. Vzhľadom na to, že albumín a kreatinín na výpočet UACR sa merajú v moči na rozdiel od kvantifikácie kreatinínu zo séra na odhad GFR, tento rozdiel nie je neočakávaný a je v súlade s pozorovaniami týchto znakov z GWAS10,13. Okrem toho sa zdá, že genetická variácia ovplyvňujefunkcie obličiekvlastnosti inými cestami ako zmenami v metylácii DNA. Podporuje to malé prekrytie medzi replikovanými miestami EWAS a GWAS pre eGFR aj UACR.

Táto metaanalýza EWAS zahŕňala vzorky rôznych populácií a etník. Pozorovali sme vysokú koreláciu odhadov účinku získaných z veľkej podvzorky jedincov s EA s účinkami odhadnutými u jedincov s AA (obr. 2). Napriek zahrnutiu údajov od značného počtu jednotlivcov s pôvodom mimo EA môžu byť celkové výsledky transetnických EWAS založené na údajoch od jednotlivcov s pôvodom v EA, čo predstavovalo 70 percent (eGFR) / 65 percent (UACR) našej štúdie (doplnkové údaje 3 a 4). Na vyriešenie tohto obmedzenia sú potrebné budúce analýzy so zvýšeným podielom vzoriek bez EA na spoľahlivé a podrobné posúdenie heterogenity medzi predkami. Potenciál preniesť poznatky z EWAS o kvantitatívnych znakoch v prevažne populačných štúdiách na osoby s týmto ochorením ilustruje skutočnosť, že odhady účinku pri 65 zo 69 CpG spojených s eGFR boli pozorované rovnakým smerom v kohorte 551 pacientov s CKD, čo poukazuje na mechanizmy použiteľné v širokom rozsahu hladín eGFR (obr. 3). navyše

cg07242931 v MAN1C1 a cg18194850 v SUCLG2 boli spojené nielen s eGFR, ale aj s predpokladaným časom dozlyhanie obličiekalebo akútnepoškodenie obličiek(Doplnkové údaje 8). Ďalší dôkaz o účasti SUCLG2, ktorý kóduje -podjednotku sukcinyl-CoA syntetázy, pri ochorení obličiek navrhol GWAS na diabetickejochorenie obličieku amerických Indiánov (SNP=rs4453858, P-hodnota=2E−6)39. Genetická variácia v tomto géne bola tiež spojená s hladinami sukcinylkarnitínu v moči (C4DC, SNP=rs115560420, P-hodnota=7E-15)40. C4DC je metabolický produkt z cyklu trikarboxylových kyselín, ktorý je katalyzovaný za účasti sukcinyl-CoA syntetázy a vyšších hladín C4DC v krvi spojených s nižším eGFR41. Avšak vyhľadávanie vo výsledkoch metylačných kvantitatívnych lokusov (meQTL) GoDMC (http://www.godmc.org.uk)42 neodhalilo významnú asociáciu týchto dvoch SNP s cg18194850, čo naznačuje žiadne priame spojenie medzi týmito SNP. a stránka CpG.

Keďže metylácia DNA je hlavným regulátorom génovej expresie, hodnotili sme koreláciu miest metylácie DNA spojených so znakom s hladinami mRNA génov v cis. Gény, ktorých hladiny mRNA významne korelovali sfunkcie obličiekasociované miesta metylácie DNA súviseli s interferónovými dráhami (pre eGFR aj UACR). Hoci tieto zistenia súhlasia s výsledkami obohatenia dráhy pre UACR (obr. 5B, doplnkové údaje 18), počet významných korelácií medzi CpG spojenými s UACR a hladinami transkriptov je pomerne nízky. To nie je prekvapujúce vzhľadom na relatívne malú veľkosť vzorky 1915 jednotlivcov dostupných pre túto analýzu a obmedzené pokrytie zdroja transkriptomiky. Je zaujímavé, že medzi významnými zisteniami pre UACR boli dva CpG v rodine nosičov rozpustených látok 1, člen 5 (SLC1A5), spojené s diferenciálnou génovou expresiou a tiež s krvným tlakom. Metylácia DNA na SLC1A5, ktorá kóduje transportér neutrálnych aminokyselín závislý od sodíka, by preto mohla byť ďalším prvkom, ktorý prispieva k známej korelácii medzi UACR a krvným tlakom.

Významné rozdielne exprimované transkripty neboli vždy kódované najbližším génom (cg17944885 blízko ZNF788), alebo CpG miesto korelovalo s viacerými génmi v cis (cg04864179 na IRF5). Pozoruhodná je najmä korelácia metylácie DNA na cg04864179 s hladinami transkriptu IRF5. Vzhľadom na významný výsledok MR tohto CpG s eGFR by metylácia DNA na IRF5 mohla kauzálne ovplyvniť eGFR sprostredkovaný jeho génovou expresiou. Berúc do úvahy transformáciu znakov základných genetických asociácií (pozri Metódy), pozorovali sme, že zvýšenie metylácie DNA o desať štandardných odchýlok malo za následok o 3,2 percent vyšší eGFR. Aj keď je tento odhadovaný účinok veľmi malý, kauzálny vplyv metylačných vzorcov v krvných bunkách na CKD podporila aj súhrnná MR s iným súborom údajov meQTL v nedávnej štúdii, kde bol kauzálny účinok priamo konzistentný s našimi výsledkami22. Použitím multi-traitovej kolokalizácie tiež ukázali, že genetické účinky tohto lokusu na eGFR boli sprostredkované metyláciou IRF5 a génovou expresiou v krvi. Okrem toho bola preukázaná kolokalizácia expresie génu IRF5 s eGFR v tubulárnych aj glomerulárnych kompartmentochobličkytkanivo43. Pri interpretácii kauzálneho účinku pozorovaného v našej štúdii je však potrebné mať na pamäti, že analýzy MR pre CpG cg04864179 ukázali významnú heterogenitu (p < 0,05)="" medzi="" nástrojmi="" (doplnkové="" údaje="" 11="" a="" doplnkový="" obrázok="" 7="">

IRF5 kóduje člena rodiny interferónových regulačných faktorov (IRF). Skupina členov rodiny IRF obsahuje transkripčné faktory s rôznymi úlohami, ako je modulácia aktivity imunitného systému, rast a diferenciácia, ako aj kontrola génovej expresie pre odpoveď interferónu na vírusové infekcie. IRF5 môže ovplyvniť odpoveď imunitných buniek. Viaceré štúdie podporujú, že zmeny v metylácii IRF5 môžu ovplyvniťfunkcie obličiekprostredníctvom imunitných dráh: SNP v IRF5 sú spojené so SLE prostredníctvom zmien expresie IRF5 v krvných monocytoch44–46. SLE je autoimunitné ochorenie charakterizované aktiváciou dráhy IFN, ktorá môže ovplyvniťobličkyako lupusová nefritída47. Inhibícia hyperaktivácie IRF5 v myšom modeli SLE chránená pred nástupom a závažnosťou lupusovej nefritídy a zlepšenáfunkcie obličieka patológie48,49. Aj keď sa náš EWAS nezameriaval na štúdiu pacientov so SLE, malé účinky metylácie IRF5 na výsledky súvisiace s obličkami, sprostredkované aspoň čiastočne jej expresiou a následnými dráhami IFN, možno zistiť ako účinky na eGFR vo všeobecnej populácii.

CISTANCHE ZLEPŠÍ BOLESŤ OBLIČIEK/OBLIVÍN

Niekoľko CpG spojených s eGFR, pre ktoré bola kvantifikovaná metylácia DNA z krvných buniek, bolo tiež spojených s eGFR aobličkyfibróza, keď bola kvantifikovaná metylácia DNAobličkytkaniva, hoci veľkosť vzorky bola podstatne menšia v porovnaní so súborom údajov EWAS. To naznačuje, že aspoň niektoré nálezy získané z krvi možno preniesť do ďalšieho cieľového tkaniva špecifického pre danú vlastnosť. Tu krv aobličkysú dve hlavné črtovo špecifické cieľové tkanivá, pretožefunkciuzobličkyje filtrácia krvi na odstránenie odpadu. Analýzy obohateniafunkcie obličieksúvisiace CpG indikovali ústrednú úlohu v regulácii transkripcie. Zistili sme rozsiahle obohatenie H3K4me1/3 a H3K36me3. H3K4me1/ 3 je spojený s primárnymi a aktívnymi zosilňovačmi, ako aj aktívnymi promótormi a H3K36me3 úzko koreluje s transkribovanými oblasťami genómu50. Úloha transkripčnej regulácie je ďalej podporovaná najsilnejším signálom obohatenia transkripčného faktora CpG spojených s UACR, čo je POLR2A, najväčšia podjednotka hlavného enzýmu syntetizujúceho mRNA v eukaryotoch.

Potenciálne obmedzenia súvisiace s analýzami MR zahŕňajú, že platné nástroje neboli dostupné pre všetky CpG pre doprednú MR. Vzhľadom na to, že všetky nástroje CpG boli vybrané z cis oblastí, tj z rovnakej genetickej oblasti, je pravdepodobné, že všetky nástroje CpG sú buď platné alebo neplatné, čím sa obmedzuje počet rôznych metód MR, ktoré možno použiť na testovanie robustnosť výsledkov51. Reverzná MR bola výkonovo obmedzená z dôvodu malej veľkosti vzorky dostupnej na odhad metylačných asociácií SNP-DNA. Väčšie štúdie meQTL, ako napríklad GoDMC, nemohli z technických dôvodov uložiť výsledky asociácie pre všetky SNP (tj nad určitú hranicu hodnoty P), a preto neboli použiteľné pre dvojvzorkovú reverznú MR. Nevýznamné zistenia sa preto musia interpretovať opatrne. Okrem toho je ťažká interpretácia veľkosti kauzálneho účinku, pretože základné genetické asociácie sa vypočítavajú na stupnici štandardnej odchýlky hladín metylácie DNA. Ďalším potenciálnym obmedzením štúdie je, že eGFR, CKD a UACR sú fenotypy odhadnuté z rôznych základných parametrov a majú multifaktoriálne vplyvy. Vykonali sme teda niekoľko analýz, aby sme zaistili, že naše výsledky EWAS neboli poháňané známymi mätúcimi faktormi, vrátane cukrovky 2. typu, potenciálneho mätúca vzťahu medzi DNAm afunkcie obličiek. Po prvé, asociácie EWAS v každej kohorte boli upravené o zmätočné faktory, aby sa odstránili ich účinky v rámci kohorty. Po druhé, EWAS sa vykonali v každej kohorte oddelene a potom sa meta-analyzovali, čo zodpovedá úprave napr. prevalencie diabetu v kohortách. Nakoniec sme skontrolovali asociácie našich replikovaných CpG v publikovaných štúdiách EWAS o diabete. Zo všetkých našich replikovaných asociácií CpG iba CpG cg18181703 spojená s UACR v SOCS3 vykazovala asociáciu s diabetom 2. Tento CpG bol tiež spojený so stavom fajčenia, BMI a hladinami rozpustného receptora 2 tumor nekrotizujúceho faktora v krvi. Ak vezmeme do úvahy, že náš EWAS bol upravený aj na stav fajčenia a BMI, predpokladáme, že účinky cg18181703 na UACR budú aspoň čiastočne nezávislé od diabetu 2. typu, BMI a fajčenia. Aj keď sme kontrolovali niekoľko z týchto známych faktorov, iné faktory, ako napríklad nemerané kovariáty, nebolo možné v analýzach explicitne upraviť a môžu ovplyvniť zistenia.

Na rozšírenie našich vedomostí o regulačných mechanizmoch sú potrebné ďalšie štúdie EWAS so zvýšenou veľkosťou vzoriek a s metyláciou DNA kvantifikovanou z ďalších tkanív, ako aj funkčné analýzy.funkcie obličieka v konečnom dôsledku zlepšiť predikciu a liečbuobličkychoroba. To platí konkrétne pre UACR vzhľadom na nižší počet pozorovaných významných asociácií CpG. Stručne povedané, táto rozsiahla metaanalýza EWAS podstatne rozšírila počet CpG reprodukovateľne spojených s eGFR a CKD a odhalila sedem asociácií pre UACR a mikroalbuminúriu. Metylácia DNA na týchto miestach vysvetlila veľkú časť variácie eGFR a diferenciálna metylácia na štyroch CpG preukázala potenciálny kauzálny vzťah k eGFR. Komplexná charakterizácia replikovaných CpG u pacientov s CKD, vobličkové tkanivo,pre diferenciálnu génovú expresiu a pre obohatené dráhy a epigenetické značky poskytujú pohľad nafunkcie obličiek-súvisiaca transkripčná regulácia.

Metódy

Prehľad.Vytvorili sme kolaboratívnu metaanalýzu založenú na distributívnom dátovom modeli a postupoch kontroly kvality. Aby sa maximalizovala štandardizácia fenotypu v rámci štúdií, bol vytvorený plán analýzy a skript príkazového riadka (https://github.com/generic-Freiburg/Skagen-pheno/tree/ckdgen-ewas-pheno) a poskytnuté všetkým zúčastneným štúdiám ( prevažne populačné štúdie; doplnkové údaje 1 a 2). Automaticky generované súhrnné súbory boli kontrolované centrálne. Po schválení fenotypu štúdie spustili svoje EWAS a nahrali výsledky a agregované informácie o metylácii DNA na centrálny server. Kontrola kvality EWAS bola vykonaná pomocou vlastných skriptov na posúdenie inflácie, pozitívnych kontrol, distribúcie CpG sond a porovnanie celkových distribúcií veľkostí účinkov, štandardných chýb a P-hodnôt v rámci štúdií. Všetky protokoly štúdie schválili príslušné miestne etické komisie. Všetci účastníci vo všetkých štúdiách poskytli písomný informovaný súhlas.

CISTANCHE ZLEPŠÍ DIALÝZU OBLIČIEK/RENÁL

Definícia fenotypu.Hodnoty kreatinínu získané Jaffého testom pred 2009 boli kalibrované vynásobením 0,9552. Štúdie odhadli GFR s chronickouOchorenie obličiekRovnica epidemiologickej kolaborácie (CKD-EPI)53. eGFR bola stanovená na 15 a 200 ml min-1 na 1,73 m2. CKD bolo definované ako eGFR pod 60 ml min−1 na 1,73 m2. Hodnoty UACR merané v mg/g boli pred všetkými analýzami transformované prirodzeným logaritmom. Mikroalbuminúria bola definovaná ako 1 pre UACR > 30 mg/g a ako 0 pre hodnoty UACR < 10="">

Kvantifikácia metylácie DNA a kontrola kvality.Na kvantifikáciu metylácie DNA sa genómová DNA extrahovala z periférnej krvi. Úrovne metylácie DNA sa kvantifikovali pomocou poľa BeadChip Infinium MethylationEPIC (EPIC), poľa Illumina Infinium HumanMethylation450K BeadChip (HM450K) alebo poľa Illumina Infinium HumanMethylation27 BeadChip (HM27K). Predspracovanie údajov o metylácii DNA sa uskutočňovalo podľa individuálnych protokolov štúdie vrátane korekcie pozadia, kvantilovej normalizácie, filtrovania sondy, filtrovania vzoriek, priraďovania SNP k umiestneniu kontrolnej sondy SNP, filtrovania odľahlých hodnôt a korekcie typu testu (doplnkové údaje 3). Úroveň metylácie na každom mieste bola reprezentovaná a analyzovaná ako hodnota. Boli označené CpG sondy prekrývajúce sa s SNP. Každá štúdia vypočítala priemer a štandardnú odchýlku každého miesta CpG a tieto súhrnné štatistiky sa porovnali medzi štúdiami na systematické rozdiely medzi CpG a sledovali sa s jednotlivými analytikmi štúdie.

Kovariátne hodnotenie.Metylácia DNA a kovariáty sa merali v rovnakom čase návštevy. Prevládajúci diabetes bol definovaný ako plazmatická glukóza nalačno vyššia alebo rovná 126 mg/dl, plazmatická glukóza bez nalačno vyššia alebo rovná 200 mg/dl, liečba cukrovky alebo samohlásenie diagnózy diabetu. Prevládajúca hypertenzia bola definovaná ako systolický krvný tlak vyšší alebo rovný 140 mm Hg, diastolický krvný tlak vyšší alebo rovný 90 mm Hg alebo liečba hypertenzie. Ak nameraný krvný tlak nebol k dispozícii, hypertenzia bola definovaná vlastným hlásením. Aktuálny stav fajčenia bol definovaný pomocou informácií, ktoré sami nahlásili. BMI (kg/m2) sa vypočítal pomocou meraní hmotnosti a výšky, ako bolo hodnotené v každej štúdii. Vek bol zahrnutý ako spojitá hodnota v asociačných modeloch. Štruktúra populácie v nerodinných štúdiách bola upravená podľa genetických hlavných komponentov (PC). Pomery typu bielych krviniek boli odhadnuté na základe metylácie DNA54. Ďalšie technické kovariáty zahŕňali kontrolnú sondu PC55, študijné centrum, spracovateľskú dávku, ID sentrix poľa a polohu sentrix.

Štatistické metódy a metaanalýza. Aby sa zabezpečila porovnateľná sila medzi analyzovanými miestami, do analýz boli zahrnuté iba autozomálne CpG merané oboma, EPIC a HM450K. Každá štúdia vykonala lineárne regresné analýzy oddelené podľa skupín predkov. Na posúdenie spoľahlivosti výsledkov EWAS sa analýzy obmedzili na štúdie a čiastkové vzorky jedincov európskeho pôvodu. Hodnoty metylácie DNA boli modelované ako závislé premenné, pričom znakom boli buď kontinuálne hodnoty eGFR alebo UACR alebo binárne premenné CKD alebo mikroalbuminúrie: metylácia DNA ~ znak plus pohlavie plus vek plus genetické PC plus proporcie bielych krviniek plus technické kovariáty plus diabetes plus hypertenzia plus BMI plus súčasné fajčenie Účastníci potrebovali úplné informácie o všetkých premenných a súhrnných štatistikách štúdie a boli zahrnuté iba vtedy, ak bolo k dispozícii minimálne 50 účastníkov pre eGFR/UACR a 50 prípadov/kontrol pre CKD/mikroalbuminúriu. Každý EWAS špecifický pre štúdiu bol upravený o infláciu pred metaanalýzou pomocou prístupu BACON, ak bol odhad inflácie väčší alebo rovný jednej (doplnkový obrázok 8)56. Štúdie boli rozdelené na objav a replikáciu podľa chronologického poradia príspevku k metaanalýze konzorcia CKDGen (doplnkové údaje 1 a 2). Metaanalýza s fixným efektom vážená inverzným rozptylom, ako je implementovaná v balíku R 'metafor' (verzia 2.{14}}) bola vykonaná pre štúdie objavov, štúdie replikácie a pre odhady výsledného účinku objavu a replikácie. CpG boli vylúčené, ak bola v rámci objavu alebo replikácie k dispozícii menej ako polovica príslušnej veľkosti vzorky alebo ak bol odhad heterogenity I2 vyšší o 95 percent. Úspešná replikácia pridruženého CpG bola definovaná ako konzistentný smer odhadov účinku medzi objavením (neGFR disk=22,347, nUACR disk=11,458) a replikáciou (neGFR replika=11,258 , nUACR repl=3610) metaanalýza, Bonferroniho upravený význam objavenia P-hodnoty (pdisc)<1.1e−7 (#cpgs="" egfr="441,870," #cpgs="" uacr="441,854)," nominal="" significance="" of="" the="" replication="" p-value="" (prepl)=""><0.05, and="" a="" combined="" discovery="" and="" replication="" p-value="" (pcomb)=""><>

Analýza génovej expresie.Účinkyfunkcie obličiekCpG spojené so znakom boli testované na asociácie s génovou expresiou v krvi pomocou dvoch súborov údajov: (1) hladiny mRNA monocytov od 1202 účastníkov štúdie MESA a (2) mRNA plnej krvi 713 jedincov KORA F4 štúdia 57,58. Ako počiatočný krok sa uskutočnilo vyhľadávanie hladín metylácie CpG s hladinami mRNA dostupnými vo výsledkoch asociácie zo štúdie MESA. Pre toto vyhľadávanie boli k dispozícii výsledky asociácie s P-hodnotou < 1e{{10}}.="" analýza="" bola="" podrobne="" opísaná="" v="" kennedy="" et="" al.59.="" stručne="" povedané,="" génová="" expresia="" bola="" hodnotená="" pomocou="" illumina="" humanht-12="" v3.{21}}="" a="" v4.0="" expression="" beadchips="" a="" metylácia="" dna="" pomocou="" poľa="" illumina="" hm450k.="" hodnoty="" expresie="" boli="" normalizované="" pomocou="" transformácie="" stabilizujúcej="" rozptyl.="" 13="" 933="" transkriptov="" z="" polí="" v3.0="" a="" v4.0,="" ktoré="" boli="" významne="" vyjadrené="" nad="" úrovňami="" pozadia="" (detekčná="" hodnota="" p="">< 0,01)="" aspoň="" u="" 5="" percent="" subjektov.="" asociačné="" analýzy="" v="" mesa="" sa="" uskutočňovali="" ako="" lineárny="" zmiešaný="" model="" s="" použitím="" log-transformovaných="" hodnôt="" génovej="" expresie="" ako="" závislej="" premennej,="" hodnôt="" beta="" metylácie="" dna="" ako="" nezávislej="" premennej="" s="" vekom,="" pohlavím,="" etnickým="" pôvodom="" a="" študijným="" centrom="" pridaným="" ako="" kovariáty="" do="" modelu.="" druhý="" asociačný="" test="" sa="" uskutočnil="" v="" súbore="" údajov="" kora="" f4.="" asociácia="" úrovne="" metylácie="" na="" replikovaných="" cpg="" s="" hladinami="" génovej="" expresie="" génov="" v="" okolí="" ±="" 500="" kb="" sa="" vypočítala="" pomocou="" log2-transformovaných="" hladín="" mrna="" získaných="" z="" illumina="" human="" ht-12v3="" génového="" expresného="" poľa.="" hodnoty="" génovej="" expresie="" boli="" regresované="" na="" hodnoty="" beta="" metylácie="" dna="" upravené="" pre="" pohlavie="" a="" vek.="" pred="" analýzou="" boli="" technické="" faktory,="" ako="" aj="" proporcie="" typu="" krvných="" buniek,="" regresované="" z="" hladín="" metylácie="" mrna="" a="" dna="" a="" jej="" zvyšky="" boli="" zahrnuté="" do="" konečného="" asociačného="" modelu.="" kontroly="" anotácie="" a="" kontroly="" kvality="" sond="" génovej="" expresie="" boli="" založené="" na="" tabuľke="" poskytnutej="" v="" schurmann="" et="" al.60.="" asociácie="" expresie="" cpg="" génu="" v="" krvi,="" ktoré="" boli="" dostupné="" vo="" výsledkoch="" mesa="" a="" mali="" asociačnú=""><0.05 in="" kora="" f4="" with="" consistent="" effect="" direction="" were="" considered="" as="" significant.="" all="" gene="" expression="" probes="" passed="" the="" annotation-based="" quality="" control="">

Metylácia DNA v tkanive obličiek.Analýzy využívajúce metyláciu DNA vobličkové tkanivos eGFR a fibrózou boli uskutočnené s použitím údajov z 506 mikrodisekciíobličkové tkanivovzorky pomocou Illumina EPIC BeadChip. Vzorky tkaniva obličiek sa odoberali oddelene a líšia sa od vzoriek krvi, ktoré sa analyzovali v metaanalýze EWAS. Tieto vzorky sa odobrali z neovplyvnených častí nádorových nefrektómií a pripravili sa tak, ako je opísané vyššie 61. Stručne povedané, softvér SeSAMe62 sa použil na vykonanie predbežného spracovania a kontroly kvality vrátane detekcie na základe nízkej intenzity, korekcie presakovania pri odčítaní pozadia, korekcie nelineárnej odchýlky farbiva, kontrola bisulfitovej konverzie, výpočet beta hodnôt a odhad frakcie leukocytov. Hodnoty beta CpG spojené s eGFR a UACR a klinické informácie boli extrahované na analýzu asociácie. Na testovanie asociácií beta metylácie DNA konečných CpG ako závislých premenných s hladinami eGFR a fibrózy sa použil regresný model, ako nezávislé premenné upravené pre pohlavie, vek, genetické PC (1–5), stav diabetu, stav hypertenzie. , BMI, pole sentrix ID, poloha sentrix a kontrola konverzie bisulfitu a odhadovaná frakcia leukocytov.

Cielené vyšetrenia sond eGFR u pacientov s CKD. Spojenie 69 eGFR asociovaných a overených CpG z bežnej populácie s eGFR v nemeckom chronickomOchorenie obličiek (GCKD) study was evaluated after correcting for the number of evaluated sites, and statistical significance was defined as Pvalue < 7.2E−4 (0.05/69). The GCKD study is a prospective observational study of patients with CKD63. Briefly, 5217 adult patients under nephrological care provided written informed consent and were enrolled from 2010 to 2012. Inclusion criteria were eGFR between 30 and 60 ml min−1 per 1.73 m2 or an eGFR of >60 ml min−1 per 1.73 m2 with UACR > 300 mg g−1 (or a urinary protein–creatinine ratio of >500 mg g-1). Sledovanie pacientov pre klinické koncové body stále prebieha. Koncové body štúdie sa nepretržite zaznamenávajú štandardizovaným spôsobom na základe prepúšťacích listov z nemocnice a úmrtných listov a zahŕňajú udalosti súvisiace s obličkami, ako aj smrť. Dizajn štúdie a získaná populácia štúdie sú podrobnejšie opísané v predchádzajúcich publikáciách63,64. Štúdia GCKD bola schválená miestnymi etickými komisiami a zaregistrovaná v národnom registri pre klinické štúdie (DRKS 00003971). Podskupina 559 pacientov s CKD pripisovaných systémovému lupus erythematosus, membránovej nefropatii, fokálnej segmentálnej glomeruloskleróze alebo autozomálne dominantnej polycystickejochorenie obličiekbol vybraný na kvantifikáciu metylácie DNA a meraný pomocou poľa Infinium MethylationEPIC BeadChip (EPIC). Asociácia s eGFR bola hodnotená analogicky k hlavnej analýze (pozri Štatistické metódy a metaanalýza), okrem úpravy pre fajčenie, ktorá bola kódovaná 0/1/2 pre nikdy/bývalých/súčasných fajčiarov. Na vyhodnotenie asociácie metylácie DNA s časom dozlyhanie obličiekzo vstupu do štúdie boli Coxove regresné modely prispôsobené pre každý CpG a analogicky pre kombinovaný koncový bodzlyhanie obličieka akútnapoškodenie obličiek.Okrem prediktora metylácie DNA boli modely upravené pre vek, pohlavie a podtyp CKD. Coxov regresný model poskytuje odhady pomeru rizika špecifického pre príčinu (HR) v prítomnosti konkurenčných udalostí, tj akejkoľvek inej smrti okrem smrti súvisiacej s obličkami. Dodatočne sa vykonali analýzy nebezpečenstva subdistribúcie, aby sa vyhodnotili potenciálne nepriame účinky prostredníctvom konkurenčnej udalosti. Predpoklad proporcionálneho nebezpečenstva bol hodnotený na základe škálovaných Schoenfeldových zvyškov. Grafické hodnotenie dvoch súvisiacich CpG neodhalilo žiadne dôkazy o závažných porušeniach (doplnkový obrázok 9).

Zákresy a anotácia regionálneho združenia. Grafy pre doplnkový obrázok 5 boli vytvorené pomocou balíkov 'Gviz' 65 a 'rtracklayer' 66 R. Do grafu bolo zahrnutých maximálne 40 miest v rámci 50,{5}} bp pred alebo za CpG miestom záujmu. Ak interval obsahoval viac ako 40 miest, vynesená oblasť sa zmenšila na vzdialenosť najvzdialenejšieho miesta plus 10,000 bp. Sekcia RefSeq Genes je založená na stope UCSC NCBI RefSeq s génovými symbolmi z balíka 'org.Hs.eg.db' R, sekcia CpG Islands je založená na stope UCSC CpG Islands, sekcia Roadmap chromHMM bola založená na Plány 15- uvádzajú chromHMM model ploduobličkyepigenóm (Roadmap Epigenome ID: E086)67 a sekcia Common SNPs je založená na UCSC Common SNPs(151) track68. Nakoniec, graf korelácie CpG v spodnej časti obrázku je založený na údajoch vzoriek metylácie DNA štúdie KORA F4 s použitím poľa Illumina HumanMethylation450 BeadChip, pričom chýbajúce miesta sú zafarbené svetlo sivou farbou.

Rozptyl sa vysvetľuje metyláciou DNA.Percento fenotypovej variácie vysvetlenej 69 replikovanými CpG spojenými s eGFR sa odhadlo pomocou údajov 1 888 účastníkov zo štúdie KORA FF4, sedemročného sledovania štúdie KORA F457,58. KORA FF4 nebol súčasťou metaanalýzy EWAS. Avšak 988 jedincov zahrnutých do analýzy vysvetleného rozptylu sa prekrývalo s účastníkmi KORA F4 EWAS. V tomto súbore údajov sa rozptyl vysvetlený všetkými CpG nezávisle od kovariátov odhadol ako rozdiel v R2 základného modelu vrátane CpG a modelu bez. Základný model bol definovaný akoobličkyvlastnosť ~pohlavie plus vek plus proporcie bielych krviniek plus cukrovka plus hypertenzia plus BMI plus súčasné fajčenie sobličkyznak reprezentujúci eGFR a UACR. Pre dva CpG spojené s eGFR (cg06008406, cg20004659) neboli v súbore údajov KORA FF4 dostupné žiadne údaje.

Obojsmerná mendelovská randomizačná analýza.Pri doprednej MR sme pomocou balíka „TwoSampleMR“ R69 skúmali potenciálne kauzálne účinky metylácie DNA na replikovaných CpG na eGFR a UACR. MR využíva genetické nástroje na minimalizáciu skreslenia spôsobeného mätúcimi a obrátenými príčinnými súvislosťami70. Genetické nástroje na metyláciu DNA (meQTL) boli dostupné pre 47 a päť CpG pre eGFR a UACR, ako predtým identifikovala GoDMC až u 27,750 jedincov42. Súhrn európskych predkov GWAS údaje o eGFR10 a UACR13 sa použili ako príslušné výsledné údaje. Na inklúziu meQTL sa použili filtre (pSNP < 1e-5="" s="" metyláciou="" dna="" v="" cis="" oblasti="" ±="" 500="" kb,="" väzbová="" nerovnováha="" r2="">< 0,2="" v="" oblasti="" 1="" mb,="" steigerova="" filtrácia,="" maf=""> 0,05). Vykonali sme inverzne vážené analýzy MR, ako aj MR citlivosti (jednoduchý režim, vážený režim, vážený medián a MR Egger) alebo trianguláciu pomocou odhadu Waldovho pomeru v prípade, že bol k dispozícii iba jeden nástroj na CpG miesto71–73. Odhady účinku získané z MR závisia od jednotiek základných súborov údajov a v tomto prípade zodpovedajú zmene na jednotku v jednej štandardnej odchýlke hladín metylácie na prirodzenom log-transformovanom eGFR a štandardnej odchýlke prirodzeného log-transformovaného UACR, resp. Pri reverznej MR sme skúmali potenciálne kauzálne účinkyfunkcie obličiekvlastnosti na metyláciu DNA s použitím celogenómových významných SNP z trans-etnických GWAS na eGFR10 a UACR13 ako genetických nástrojov pre eGFR a UACR. Aby sme maximalizovali výkon na výsledných údajoch, vykonali sme metaanalýzu z-skóre asociácií SNP-CpG zo štúdií KORA F4 (n=1662) ​​a FHS (n=3868). Odhady kombinovaného účinku a ich štandardné chyby meQTL zahrnuté v MR boli odhadnuté z veľkosti vzorky, frekvencie alel a z-skóre74. Na zahrnutie SNP sa použili filtre (hodnota P < 5e-8="">obličkyvlastnosť, jednostranná P-hodnota < 0.05="" s="" dusíkom="" močoviny="" v="" krvi="" pre="" prístroje="" egfr,="" heterogenita="" predkov="" p-hodnota="" väčšia="" alebo="" rovná="" 0.0="" 1,="" steigerovo="" filtrovanie,="" maf=""> 0.05). Vykonali sme MR váženú inverzným rozptylom s multiplikatívnymi náhodnými efektmi (pretože na danú vlastnosť bol k dispozícii dostatočne vysoký počet nástrojov z rôznych lokusov)51 a analýzy citlivosti MR (jednoduchý režim, vážený režim, vážený medián a MR Egger)71–73. Ako dodatočnú analýzu citlivosti zameranú na pleiotropné varianty sme vylúčili celkovo 35 nástrojov, ktoré boli spojené s diabetes mellitus 2. typu v nedávnom GWAS75 vrátane 898 130 jedincov: jedenásť SNP, ktoré mali asociačnú hodnotu P < 5e-8="" s="" diabetom,="" a="" 24="" ďalších="" prístroje,="" ktoré="" boli="" vo="" väzbovej="" nerovnováhe="" (r2=""> 0,2 v rámci 1 Mb, referenčný panel 1 000 G EUR) s takýmto SNP spojeným s diabetom. Väzbová nerovnováha bola hodnotená prostredníctvom LDlink76. Pre reverznú MR odhady účinku poskytujú zmenu na jednotku prirodzeného log-transformovaného eGFR a štandardnú odchýlku prirodzeného log-transformovaného UACR na štandardnú odchýlku hladín metylácie DNA. Úprava P-hodnoty viacnásobného testovania podľa Benjaminiho-Hochberga FDR < 0,05="" bola="" aplikovaná="" na="" vlastnosť="" obličiek="" a="" pre="" doprednú="" a="" spätnú="" mr="" oddelene77.="" heterogenita="" p-hodnoty="" sa="" získali="" z="">

Analýzy obohatenia.Aby sme informovali o potenciálnych funkčných účinkoch súvisiacich CpG, hodnotili sme obohatenie týchto CpG v miestach modifikácie DNázy I alebo histónu (H3K4me1, H3K4me3, H3K9me3, H3K27me3), génových súborov založených na termínoch GO a dráhach v databázach KEGG a Reactome32 –35. Analýzy obohatenia TFBS sa uskutočnili tak, ako bolo podrobne opísané vyššie14. Stručne povedané, testovanie obohatenia bolo hodnotené pomocou eForge78 pomocou permutácie so zhodou s lokalizáciou génovej a CpG ostrovnej oblasti pri odbere vzoriek. Údaje pochádzali z projektov ENCODE (125 vzoriek) alebo Roadmap Epigenomics (299 vzoriek) generovaných metódou Hotspot67,79,80. CpG, ktoré boli spojené s eGFR a UACR, v tomto poradí, pri P-hodnote < 1e-{43}}5="" v="" metaanalýze="" sa="" použili="" ako="" vstup="" (doplnkové="" údaje="" 6="" a="" 7)="" a="" 10,000="" behy="" prevzorkovania,="" aktívny="" filter="" blízkosti="" a="" fdr="">< 0,05="" sa="" považujú="" za="" významné="" (doplnkové="" údaje="" 13="" a="" 14).="" analogicky="" sa="" uskutočnili="" analýzy="" obohatenia="" histónových="" značiek="" (doplnkové="" údaje="" 15="" a="" 16).="" obohatenie="" v="" génových="" súboroch="" alebo="" dráhach="" sa="" hodnotilo="" pomocou="" balíka="" metylgsa="" a="" verzie="" r="" 3.6.181.="" testovacia="" metóda="" obohatenia="" bola="" metylglm="" implementujúca="" logistickú="" regresiu="" upravujúcu="" počet="" sond="" na="" gén="" a="" autozomálne="" pozadie,="" ktoré="" prekrýva="" 450k="" a="" epic="" polia.="" boli="" testované="" génové="" sady="" alebo="" dráhy="" so="" 100–500="" génmi="" (predvolené="" nastavenie).="" zvažovali="" sme,="" že="" súbor="" génov="" alebo="" dráha="" je="" významne="" obohatená="" pri="" fdr="">< 0,05="" s="" korekciou="" na="" viacnásobné="" testovanie="" v="" rámci="" každej="" databázy="" pomocou="" metódy="" benjaminiho="" a="" hochberga="" (doplnkové="" údaje="" 17="" a="">