Metformín zmierňuje neurokognitívne poškodenie pri starnutí prostredníctvom aktivácie dráhy AMK/BDNF/PI3K ČASŤ 1

Spomalenie neurokognitívneho poškodenia súvisiaceho s vekom bolo výzvou. Hodnotili sme terapeutické účinky metformínu pri starnutí vyvolanom d-galaktózou. Okrem toho sme študovali potenciálne molekulárne mechanizmy, ktoré by mohli byť zodpovedné za účinky metformínu proti starnutiu. Tridsať samcov potkanov bolo rovnomerne rozdelených do 1-kontrolnej skupiny, ktorá dostávala fyziologický roztok, 2-d-galaktózovej (D-gal) skupiny, ktorá dostávala d-galaktózu (100 mg/kg/deň) výplachom žalúdka počas ôsmich týždňov, a skupina liečená 3-d-galaktózou plus metformínom (D-gal plus Met), ktorá dostávala d-galaktózu plus metformín (200 mg/kg/deň) výplachom žalúdka počas ôsmich týždňov. Uskutočnilo sa neurokognitívne hodnotenie. Uskutočnilo sa meranie zápalového, oxidačného stresu a biomarkerov BDNF. Hodnotila sa expresia génov AMPK a PI3K. Hipokampálne tkanivá boli vypreparované na histopatologické a imunohistochemické štúdie. D-gal viedla k neurokognitívnym poruchám, zvýšeniu zápalových biomarkerov, zmeneným markerom oxidačného stresu, zníženiu BDNF a zníženej expresii synaptofyzínu a Bcl2 so zvýšenou expresiou kaspázy-3 a down-reguláciou génov AMPK a PI3K. V hipokampe boli prítomné neurodegeneratívne zmeny. Metformín významne obnovil neurodegeneratívne zmeny vyvolané D-gal. Dospeli sme k záveru, že metformín by mohol zmierniť neurokognitívny deficit spôsobený vekom prostredníctvom zlepšenia neurozápalu, zoslabenia oxidačného stresu, zníženia apoptózy, ako aj podpory synaptickej plasticity. Tieto mechanizmy by mohli byť sprostredkované aktiváciou dráhy AMPK/BDNF/PI3K.

Glykozid cistanche môže tiež zvýšiť aktivitu SOD v tkanivách srdca a pečene a výrazne znížiť obsah lipofuscínu a MDA v každom tkanive, účinne zachytáva rôzne reaktívne kyslíkové radikály (OH-, H₂O₂ atď.) a chráni pred poškodením DNA. OH-radikálmi. Cystanche fenyletanoidové glykozidy majú silnú schopnosť zachytávať voľné radikály, vyššiu redukčnú schopnosť ako vitamín C, zlepšujú aktivitu SOD v suspenzii spermií, znižujú obsah MDA a majú určitý ochranný účinok na funkciu membrány spermií. Polysacharidy Cistanche môžu zvýšiť aktivitu SOD a GSH-Px v erytrocytoch a pľúcnych tkanivách experimentálne starnúcich myší spôsobenú D-galaktózou, ako aj znížiť obsah MDA a kolagénu v pľúcach a plazme a zvýšiť obsah elastínu. dobrý čistiaci účinok na DPPH, predĺženie doby hypoxie u starnúcich myší, zlepšenie aktivity SOD v sére a oddialenie fyziologickej degenerácie pľúc u experimentálne starnúcich myší Experimenty ukázali, že pri bunkovej morfologickej degenerácii má Cistanche dobrú antioxidačnú schopnosť a má potenciál byť liekom na prevenciu a liečbu chorôb starnutia kože. Zároveň má echinakozid v Cistanche významnú schopnosť vychytávať voľné radikály DPPH a dokáže vychytávať reaktívne formy kyslíka, predchádzať voľným radikálom vyvolanej degradácii kolagénu a má tiež dobrý reparačný účinok na poškodenie aniónom voľných radikálov tymínu.

Kliknite na Cistanche v Urdu o ANTI AGING

【Ďalšie informácie: david.deng@wecistanche.com / WhatApp:{0}}】

Skratky

D-gal d-galaktóza

ROS Reaktívne formy kyslíka

IL-1 interleukín-1

IL-1 interleukín-1

IL-6 interleukín-6

IL-10 interleukín-10

TNF - faktor nekrózy nádorov

BDNF Neurotrofický faktor odvodený z mozgu

AMPK AMP-aktivovaná proteínkináza

PI3K/Akt fosfatidylinozitol 3-kináza/proteínkináza B

RT-PCR Reverzná transkriptázová polymerázová reťazová reakcia

EPM Elevated plus bludisko

TL Prenosová latencia

MDA malondialdehyd

SOD Superoxiddismutáza

MPTP Mitochondriálna permeabilita prechodný pór

H&E hematoxylín a eozín

iNOS Indukovateľná syntáza oxidu dusnatého

NF-KB Jadrový faktor-KB

LTP Dlhodobá potenciácia

Trvalá strata fyziologických funkcií, mentálnej agilnosti a pamäti, ku ktorej dochádza so starnutím, je mnohostranný proces, ktorý môže byť spustený smrťou neurónových buniek1. Očakáva sa, že priemerná dĺžka života v mnohých krajinách do roku 2030 presiahne 85 rokov2. V dôsledku zníženej kvality života starších ľudí a súvisiacich ekonomických a osobných výdavkov sa kognitívne poruchy súvisiace so starnutím stali významným spoločenským problémom. Okrem toho je starnutie mozgu primárnou príčinou rozvoja neurodegeneratívnych ochorení, ktoré často postupujú nezvratne3. V súčasnosti je k dispozícii len málo účinných spôsobov liečby neurokognitívnych porúch súvisiacich so starnutím, alebo nie sú k dispozícii žiadne4.

d-galaktóza (D-gal), monosacharid hojne zastúpený v mliečnych výrobkoch, sa normálne premieňa na glukózu pomocou enzýmov. Dlhodobé systémové podávanie D-gal však môže predstavovať značné zdravotné riziká5. Predchádzajúci výskum naznačil, že pretrvávajúce systémové dodávanie D-gal potkanom by ich mohlo premeniť na modely starnutia a neurodegeneratívnych porúch súvisiacich s vekom6. Model starnutia D-gal má niekoľko výhod oproti modelu prirodzeného starnutia, vrátane schopnosti sústrediť sa výlučne na proces starnutia. V modeli prirodzeného starnutia komplikujú premenné komorbidity vrátane cukrovky a hypertenzie7.

Predpokladá sa, že D-gal vytvára biochemické anomálie podobné tým, ktoré sú pozorované v starnúcom ľudskom mozgu, ako je znížená aktivita antioxidačných enzýmov a oslabenie cholinergných neurónov. Konečné produkty pokročilej glykácie, ktoré sú spojené s normálnym starnutím a patofyziológiou mnohých chorôb, sú produkované interakciou D-gal s proteínovými aminoskupinami. Zvieratá poskytnuté D-gal spôsobili neurozápal, poškodenie mitochondrií a oxidačné poškodenie v dôsledku vývoja reaktívnych druhov kyslíka (ROS) spolu s problémami v privykaní na novosť, nedostatkami v priestorovom učení a kognitívnych funkciách8.

Zápal by mohol byť kľúčovým faktorom zhoršenia kognitívnych funkcií u starších ľudí. Vysoké hladiny interleukínu-6, IL-1, tumor nekrotizujúceho faktora- a C-reaktívneho proteínu sú spojené so zvýšeným rizikom morbidity a mortality u starších ľudí9. Chronická liečba d-galaktózou u potkanov vyvolala aktiváciu neuronálnych apoptotických signálnych dráh a neurozápal v mozgovej kôre a hipokampe1.

Starnutie vedie k poklesu neurotrofického faktora odvodeného od mozgu (BDNF), ktorý je kľúčovým proteínom zapojeným do plastických zmien spojených s učením a pamäťou, ako aj životne dôležitým mediátorom proliferácie a integrity neurónov10.

Objav nových zlúčenín, ktoré odďaľujú starnutie a podporujú kognitívnu výkonnosť, sa stal jednou z najväčších výziev. Metformín rýchlo preniká hematoencefalickou bariérou a hromadí sa v niekoľkých oblastiach mozgu, vrátane hypofýzy a hipokampu11. Ukázalo sa, že dlhodobé podávanie metformínu znižuje nástup patologických komplikácií súvisiacich s vekom a predlžuje dlhovekosť u ľudí12. Okrem toho sa ukázalo, že metformín zlepšuje kognitívne poruchy a poruchy správania, ako je úzkosť u diabetických aj nediabetických jedincov13,14 a pacientov s neurodegeneratívnymi ochoreniami15. Základné mechanizmy účinkov metformínu na zlepšenie neurokognitívneho poškodenia súvisiaceho s vekom sú však komplikované, a napriek tomu nie sú úplne pochopené.

Neuroprotektívne účinky metformínu možno primárne pripísať aktivácii signálnej dráhy AMP-aktivovanej proteínkinázy (AMPK)11. Aktivácia AMPK up-reguluje expresiu BDNF, ktorý má rozhodujúcu úlohu pri synaptickom prenose a konsolidácii pamäte10. Okrem tejto dobre zavedenej vlastnosti aktivácie AMPK predchádzajúce výsledky ukázali, že metformín môže zlepšiť pamäť obnovením oxidačného stresu, znížením neurozápalu a inhibíciou apoptózy, čo môže rozšíriť jeho klinické indikácie v oblasti neurodegeneratívnych porúch14. Metformín je silným aktivátorom dráhy fosfatidylinozitol 3-kinázy/proteínkinázy B (PI3K/Akt), ktorá je dôležitou kritickou signálnou dráhou pri inhibícii apoptózy a podpore prežitia buniek16.

Berúc do úvahy výhody metformínu, ktoré zahŕňajú jeho bezpečnosť, cenovú dostupnosť a použiteľnosť; študovali sme neuroprotektívne účinky podávania metformínu proti neurokognitívnemu poškodeniu spôsobenému starnutím vyvolaným d-galaktózou u potkanov. Okrem toho sa skúmali základné molekulárne mechanizmy týchto ochranných účinkov.

Materiály a metódy

Zvieratá.V experimente boli použité albínske samce potkanov Tirty Wister s hmotnosťou 200 – 250 gramov po získaní potrebných súhlasov Etickej komisie pre výskum na Lekárskej fakulte Menoufa University, Egypt (registračné č. 10/2022 PHYS 9). Experimentálne postupy sa riadili usmerneniami ARRIVE. Potkany boli umiestnené v klietkach z drôteného pletiva (80 x 40 x 30 cm). Všetkým zvieratám bol poskytnutý úplný prístup k potrave a vode počas obdobia štúdie po ich kondicionovaní počas 2 týždňov pri konštantných podmienkach prostredia a 12:{10}} hodinovom cykle svetlo/tma.

Experimentálny dizajn.Zvieratá boli náhodne rozdelené do troch skupín (10/skupina):

1. Kontrolná skupina: Dostala fyziologický roztok cez orálnu sondu.

2. Skupina d-galaktózy (D-gal): Prijatá d-galaktóza (Sigma-Aldrich St. Louis, USA) rozpustená vo fyziologickom roztoku v dávke 100 mg/kg telesnej hmotnosti prostredníctvom výplachu žalúdka počas ôsmich po sebe nasledujúcich týždňov17

3. Skupina liečená d-galaktózou plus metformínom (D-gal plus Met): Prijatá d-galaktóza (rovnakou dávkou v skupine D-gal) plus metformín (Sigma-Aldrich St. Louis, USA) rozpustený vo fyziologickom roztoku v dávke 200 mg/kg/deň prostredníctvom výplachu žalúdka počas ôsmich po sebe nasledujúcich týždňov16

Po ukončení ôsmich týždňov sa uskutočnilo neurobehaviorálne hodnotenie všetkých potkanov. Potom boli potkany anestetizované a usmrtené cervikálnym predĺžením a dislokáciou. Mozog sa extrahoval a premyl fosfátovým pufrom (pH 7,4). Ľavá hemisféra bola odvážená a rozdelená na dve polovice; jedna z nich sa použila na biochemickú analýzu a druhá polovica sa použila na štúdie RT-PCR. Pravá hemisféra bola fixovaná v 10-percentnom formalínovom fyziologickom roztoku na histopatologické a imunohistochemické hodnotenie hipokampálnych tkanív.

Neurobehaviorálne testy.Nové rozpoznávanie objektov. Nový test rozpoznávania objektov sa použil na posúdenie schopnosti potkanov rozpoznať nový objekt v známom prostredí. Každý potkan mal tri dni testovania, ktoré zahŕňalo tri fázy: návyk, tréning a testovanie. Potkany sa umiestnili do zariadenia na otvorenom poli (50 cm x 50 cm x 40 cm) počas fázy návyku a dostali desať minút na adaptáciu bez akýchkoľvek predmetov. Každý potkan bol počas tréningovej fázy držaný v komore s dvoma rovnakými predmetmi počas piatich minút. Po dvadsiatich štyroch hodinách sa každý potkan umiestnil do komory na päť minút počas testovacej fázy, ktorá zahŕňala výmenu jedného zo starých predmetov za nový. Stopky sa používali na meranie času trvania prieskumu objektu. Diskriminačný index [=(čas skúmania nového objektu – čas skúmania rodinného objektu)/celkový čas skúmania × 100 percent] sa používa na hodnotenie kognitívnej výkonnosti potkanov. Alkohol sa použil na čistenie otvoreného poľa a predmetov medzi potkanmi18.

Morrisovo vodné bludisko. Morrisovo vodné bludisko sa použilo na skúmanie vplyvu metformínu na priestorové učenie a pamäť. Bazén bol vyrobený z nehrdzavejúcej ocele, mal priemer 210 cm a výšku 50 cm vrátane ponorenej únikovej plošiny 1 cm pod hladinou vody. Voda sa udržiavala na 24±1 stupňoch. Akvizičná úloha bola testovaná počas piatich dní testovania so štyrmi pokusmi každý deň. Čas potrebný na to, aby ste sa dostali na tajnú platformu počas každého pokusu, sa zaznamenal ako úniková latencia. Potkanom bolo poskytnutých maximálne 60 sekúnd na nájdenie skrytej plošiny. Bol stanovený maximálny časový limit 60 s a potkan bol manuálne vedený na skrytú plošinu. Jeden pokus so sondou sa uskutočnil 24 hodín po poslednom pokuse na piaty deň. Plošina sa odstránila a potkan sa umiestnil do bazéna z kvadrantu oproti tréningovému kvadrantu. Potom sa potkan nechal voľne plávať po dobu 60 sekúnd. Zaznamenal sa čas strávený v cieľovom kvadrante19.

Test zvýšeného plusového bludiska (EPM). EPM je zavedená technika na hodnotenie správania podobného úzkosti u potkanov. Bol vyrobený z dreva a pozostával z otvorených a uzavretých ramien (50 cm na dĺžku x 10 cm na šírku). Dve uzavreté ramená boli ohradené 40 cm vysokými stenami. Ramená boli pripevnené centrálnou štvorcovou plošinou (10 × 10 cm). Zariadenie bolo 50 cm nad podlahou. Každý potkan sa umiestnil do stredu prístroja čelom k uzavretému ramenu a nechal sa voľne pohybovať počas piatich minút. Zaznamenal sa čas strávený v otvorenom a zatvorenom náručí. V 20 boli zaznamenané aj vstupy s otvorenými ramenami. Meriame tiež prenosovú latenciu (TL), ktorá sa používa na hodnotenie pamäte a učenia. Prvý deň (akvizičná relácia) bol každý potkan vystavený EPM počas 90 s. Čas, ktorý potkan potreboval na dosiahnutie uzavretého ramena, sa zaznamenal ako TL. Potkany, ktoré nedokázali vstúpiť do uzavretých ramien do 90 s, boli zo štúdie vylúčené. Na druhý deň (retenčná relácia) sa každý potkan umiestnil do otvoreného ramena a TL sa zaznamenalo maximálne 90 s21.

Biochemická analýza.Mozgové tkanivo sa perfundovalo roztokom PBS a potom sa homogenizovalo v 5 ml studeného pufra na gram tkaniva. Centrifugácia mozgového tkaniva sa uskutočnila pri 4000 otáčkach za minútu počas 15 minút, potom sa supernatant odstránil a skladoval pri -80 stupňoch až do meraní malondialdehydu (MDA) a superoxiddismutázy (SOD) pomocou konvenčného kolorimetra (QuantiChrom™, BioAssay Systems, USA), sérový faktor nekrotizujúci nádory (TNF- ), interleukín 10 (IL-10) a mozgový neurotropný faktor (BDNF) pomocou súpravy ELISA (Quantikine, Abcam company, Cambridge, UK) podľa pokynov výrobcu inštrukcie.

Kvantitatívny test expresie AMPK a PI3K génov pomocou techniky reverznej transkriptázy polymerázovej reťazovej reakcie (RT‑PCR).Mozgové tkanivá boli pripravené na izoláciu celkovej RNA pomocou Qiagen RN Easy plus Universal Kit z USA. Potom bola zabezpečená kvalita a čistota RNA. RNA bola až do použitia skladovaná pri -8{10}} stupňoch. Potom bola prvým krokom syntéza cDNA pomocou súpravy QuantiTect Reverse Transscription Kit, Qiagen z USA, s použitím tepelného cyklovača Applied Biosystems 2720 (Singapur) iba na jeden cyklus. Priméry GAPDH sa použili v reakciách RT-PCR ako kontrola zavádzania RNA. Druhým krokom bola amplifikácia cDNA: cDNA sa použila v kvantitatívnej PCR v reálnom čase na báze SYBR zelenej na relatívnu kvantifikáciu (RQ) expresie génov AMPK a PI3K pomocou súpravy SensiFASTTMSYBR Lo-ROX Kit, USA, s použitím nasledujúcich navrhnutých primerov (Midland, Texas ): Te forward primer pre AMPK bol (TGCGTGTACGAAGGAAGAATCC). A reverzný primer bol (TGTGACTTCCAGGTCGGGAGTT). Dopredný primér pre PI3K bol (AGCTGGTCTTCGTTTCCTGA) a spätný primér bol (GAAACTTTTTCCCACCACGA). Nakoniec sa uskutočnila analýza údajov pomocou softvéru Applied Biosystems 7500 verzie 2.0.1. RQ expresie génov AMPK a PI3K sa uskutočnilo pomocou komparatívnej metódy ∆∆Ct, kde sa množstvo mRNA cieľových génov (AMPK a PI3K) normalizovalo na endogénny referenčný gén (GAPDH) a relatívne ku kontrole.

Histopatologické vyšetrenie mozgového tkaniva.Histologické vyšetrenie. Mozgové tkanivo sa fixovalo v 10-percentnom roztoku formalínu, zalialo sa do parafínu a získali sa sériové koronálne rezy s hrúbkou 5 μm. Rezy mozgového hipokampu sa potom zafarbili hematoxylínom a eozínom (H&E) na vyšetrenie svetelným mikroskopom.

Imunohistochemické farbenie hipokampu. Imunohistochemické farbenie kaspázy-3 (číslo CAT: ab32351, spoločnosť Abcam 152 Grove Street Waltham, M02453, USA) a synaptofyzínu (číslo CAT: ab32127, spoločnosť Abcam 152 Grove Street Waltham, M02453, USA) sa uskutočnilo pomocou králika monoklonálne protilátky. V prípade Bcl-2 (číslo CAT: ab59348, spoločnosť Abcam 152 Grove Street Waltham, M02453, USA) sa to uskutočnilo s použitím králičích polyklonálnych protilátok. Boli prijaté v jednej liekovke obsahujúcej 1 ml protilátky. Anti-kaspáza{13}}, anti-synaptofyzín a anti-Bcl{16}} sa použili v zriedených množstvách 1:50, 1:400 a 1:100. Rezy boli narezané na 5 um a zafarbené automatickým imunofarbiacim zariadením LINK 48 (Dako, Agilent Technologies Inc, Santa Clara, USA). Na získanie tepla sa použil citrátový pufor pomocou imunofarbiva. Sklíčka boli zafarbené automaticky primárne zriedenými protilátkami. Pozitívna kontrola reakcie sa uskutočnila s použitím špecifických rezov normálnych ľudských mandlí zaliatych do parafínu, ľudského pankreasu a folikulárneho adenómu pre kaspázu{26}}, synaptofyzín a Bcl{27}}. Negatívne kontroly sa urobili nahradením primárnych protilátok neimunitným sérom.

Stanovenie histopatologických a imunohistochemických markerov (kaspáza{0}}, synaptofyzín a Bcl{1}}) sa uskutočnilo v rôznych oblastiach hipokampu vrátane CA1, CA2 a CA3.

Štatistická analýza.Výsledky sú vyjadrené ako priemer ± štandardná odchýlka (SD). Analýza rozptylov (ANOVA) sa použila na štatistickú analýzu rôznych skupín pomocou softvéru Origin® a pravdepodobnosti náhody (hodnoty p). P hodnoty<0.05 were considered significant.

Etický súhlas a súhlas s účasťou.Táto práca bola schválená a podľa smerníc Etického výboru Lekárskej fakulty Menoufa University, Egypt.

Výsledky

Neurobehaviorálne testy.Pokiaľ ide o test nového objektu, percento indexu diskriminácie bolo výrazne nižšie v skupine D-gal v porovnaní s kontrolnou skupinou (-37,16±3,31 percenta oproti 30,16±2,92 percenta, v tomto poradí, P<0.05). The percentage of discrimination index was significantly higher in the D-gal+Met group  (16.66±4.67%, P<0.05) when compared with the D-gal group. However, this percentage is still significantly lower when compared with the control group (Fig. 1).

Čo sa týka testu Morrisovho bludiska, priemerná hodnota trvania únikovej latencie bola významne vyššia v prvom, druhom, treťom, štvrtom a piatom dni v skupine D-gal v porovnaní s kontrolnou skupinou (58,16 ± 1,94, 4{ {19}} 0,62±1,33, 32,75±1,10, 24,37±1,58 a 15,29±0,98 s vs. 86 s, P<0.05). The means value of the duration of escape latency was significantly lower in the D-gal+Met group in the five training days (50±1.41, 34.08±1.15, 25.16±1.31, 16.04±1.75,   and 10.25±1.01 s, respectively, P<0.05) when compared with the D-gal group. However, the mean values of the durations of escape latency in the five training days in the D-gal+Met group were still significantly higher when compared with the control group. The means value of the duration that the rats spent in the target quadrant were significantly lower in the D-gal group when compared with the control group (12.50±1.87 vs. 23.50±1.87 s,   respectively, P < 0.05). However, the mean value of the duration that the rat spent in the target quadrant was significantly higher in the D-gal+Met group (19.66 ± 2.16 s, P < 0.05) when compared with the D-gal group.  However, its level is still significantly lower when compared with the control group (Fig. 2).

V teste vo zvýšenom plus-bludisku bola priemerná hodnota doby, ktorú potkany strávili v otvorených ramenách, významne nižšia v skupine D-gal v porovnaní s kontrolnou skupinou (60 ± 6,54 s vs. 90,83 ± 3,48 s, v tomto poradí , P<0.05). On the other hand, the mean value of the duration that the rats spent in the open arms was significantly higher in the D-gal+Met group (73.83±5.41 s, P < 0.05) when compared with the D-gal group. However, its level was still significantly lower when compared with the control group. On the contrary, the mean value of the duration that the rats spent in the closed arms was significantly higher in the D-gal group when compared with the control group (107.33±3.07 s vs. 57.66±5.12 s respectively, P<0.05). The means value of the duration that the rats spent in the closed arms were significantly lower in the D-gal+Met group (74.66±2.58 s, P<0.05)   when compared with the D-gal group. However, its level was still significantly higher when compared with the control group. The mean value of the number of open-arm entries was significantly lower in the D-gal group when compared with the control group (12.50±1.87 vs. 32.33±3.07, respectively, P<0.05). On the contrary, the mean value of the number of open-arm entries was significantly higher in the D-gal+Met group (21.66±2.16,  P<0.05) when compared with the D-gal group. However, its level is still significantly lower when compared with the control group. The mean value of the duration of the transfer latency was significantly higher in the D-gal group when compared with the control group (48.33 ±6.88 s vs. 25 ±1.87 s, respectively, P < 0.05). While the mean value of the duration of the transfer latency was significantly lower in the D-gal+Met group (34.66±3.77 s,  P<0.05) when compared with the D-gal group. However, its level was still significantly higher when compared with the control group (Fig. 3).

Biochemické testy.Priemerná hodnota hladiny MDA v mozgu bola signifikantne vyššia, zatiaľ čo priemerná hodnota hladiny SOD v mozgu bola významne nižšia v skupine D-gal v porovnaní s kontrolnou skupinou (70±3,23 nmol/mg proteínu a 13,05±1).{7 }} U/mg proteínu oproti 33,76±2,13 nmol/mg proteínu a 29,11±4,34 U/mg proteínu, P<0.05). The mean value of brain MDA level was significantly lower, while the mean value of brain SOD level was significantly higher in the D-gal+Met group (50.02±4.26 nmol/mg protein and  21.90±2.33 U/mg protein, respectively, P<0.05) when compared with the D-gal group. However, the mean value of MDA is still significantly higher, and the mean value of SOD is significantly lower when compared with the control group (Fig. 4a,b).

Priemerná hodnota hladiny mozgového TNF- bola významne vyššia, zatiaľ čo priemerná hodnota hladiny mozgového IL-10 bola významne nižšia v skupine D-gal v porovnaní s kontrolnou skupinou (67,50 ± 10,03 pg/mg proteínu a 72,91 ±8,45 pg/mg proteínu oproti 16,61 ±1,21 pg/mg proteínu a 157,23 ±12,46 pg/mg proteínu, v tomto poradí, P<0.05). The mean value of brain TNF-α level was significantly lower, while the mean value of brain IL-10 level was significantly higher in the D-gal+Met group (49.83±1.89 pg/mg protein and 131.67±4.54 pg/mg protein,   respectively, P<0.05) when compared with the D-gal group. But, the mean value of TNF-α was still significantly higher, and the mean value of IL-10 was significantly lower when compared with the control group (Fig. 4c,d).

Priemerná hodnota hladiny BDNF v mozgu bola významne nižšia v skupine D-gal v porovnaní s kontrolnou skupinou (125,72 ± 4,17 pg/mg proteínu vs. 225,20 ± 5,52 pg/mg proteínu, v tomto poradí, P<0.05). The mean value of brain BDNF level was significantly higher in the D-gal +Met group (215.03±3.65 pg/mg protein, P < 0.05)   when compared with the D-gal group. However, its level is still significantly lower when compared with the control group (Fig. 5).

Kvantitatívna RT-PCR (qRT-PCR). Expresia génov AMPK a PI3k (0.52±0.11 a 0.37±0.03, v tomto poradí, P<0.05) was significantly down-regulated in the D-gal group when compared with the control group (1). However, the expression of AMPK and PI3k genes was significantly up-regulated in the  D-gal+Met group (0.95±0.08 and 0.98±0.04, respectively, P<0.05), when compared with the D-gal group, but it was insignificantly changed (P>0.05) v porovnaní s kontrolnou skupinou (obr. 6).

Histopatológia.H&E farbenie hipokampálneho tkaniva v kontrolnej skupine odhalilo nepozoruhodné patologické zmeny. Skupina D-gal vykazovala veľa neuronálnej degenerácie a apoptotických teliesok s masívnym edémom a gliózou. Avšak rezy skupiny D-gal plus Met vykazovali málo neuronálnych degenerácií a málo apoptotických teliesok s miernym edémom a miernou fokálnou gliózou (obr. 7).

Imunohistochémia. Imunohistochemické výsledky ukázali, že hodnota H skóre expresie synaptofyzínu v hipokampálnom tkanive bola výrazne nižšia (P<0.05) in the D-gal group when compared with the control group (100±5.78 vs. 260±4.03). However, the expression of synaptophysin (180±5.26) in hippocampal tissue in the D-gal+Met group was significantly higher when compared with the D-gal group. However, it was still significantly lower when compared with the control group (Fig. 8).

Hodnota H skóre expresie kaspázy-3 v hipokampálnom tkanive bola významne vyššia (P<0.05) in the  D-gal group when compared with the control group (279±5.35 vs. 89±3.54). On the other hand, the H score value of the caspase-3 expression in hippocampal tissue in the D-gal+Met group (151±4.73) was significantly lower when compared with the D-gal group, but still significantly higher when compared with the control group  (Fig. 9). 

Hodnota H skóre expresie Bcl{0}} v hipokampálnom tkanive bola významne nižšia (P<0.05) in the D-gal group when compared with the control group (161±4.36 vs. 301±6.11). While the H score value of Bcl-2 expression in hippocampal tissue in the D-gal+Met group (179±7.48) was significantly higher when compared with the D-gal group, it was still significantly lower when compared with the control group (Fig. 10).

Diskusia

Predĺženie priemernej dĺžky života zvyšuje riziko ochorenia u starších ľudí, najmä v kognitívnej oblasti, ktoré môže byť, aspoň čiastočne, spôsobené stratou neurónov v mozgu. Je dobre známe, že dlhodobá injekcia d-galaktózy prispieva k pokroku starnutia a miernemu poškodeniu neurónov a poruchám pamäti. Keďže starnutie vyvolané D-galom je sprevádzané neurodegeneráciou, mohol by byť ideálnym modelom na štúdium molekulárnych mechanizmov spojených s neurodegeneráciou spojenou s vekom a na testovanie nových terapeutických prístupov22.

Naša štúdia ukázala, že chronické podávanie D-gal narušilo nové objavné správanie a pracovnú pamäť u potkanov. Bolo to zrejmé z výsledkov testov nového objektu, Morrisovho vodného bludiska a vyvýšeného plus bludiska. Tieto výsledky boli v súlade s inými hlásenými štúdiami23. Na druhej strane; liečba metformínom zlepšila pracovnú pamäť a preferenciu novosti v porovnaní so skupinou D-gal. Na podporu našich výsledkov predchádzajúca štúdia uviedla, že metformín zlepšil krátkodobú pamäť u diabetických myší vyvolaných streptozotocínom24. Je dobre zdokumentované, že starnutie je spojené nielen s poklesom kognitívnych funkcií, ale aj s emocionálnymi zmenami vrátane správania podobného úzkosti, ktoré má za následok funkčné poškodenie25. V tejto štúdii výsledky testu EPM ukázali zvýšené správanie podobné úzkosti v skupine D-gal v porovnaní s kontrolnou skupinou. Zatiaľ čo liečba metformínom zmiernila správanie podobné úzkosti.

Táto štúdia odhalila, že neurobehaviorálne zmeny spôsobené perorálnym podávaním D-gal boli sprevádzané poruchami markerov oxidačného stresu v mozgu. Priemerná hodnota hladiny MDA v homogenáte mozgového tkaniva bola signifikantne vyššia, zatiaľ čo aktivita antioxidačného enzýmu SOD bola signifikantne nižšia v skupine D-gal v porovnaní s kontrolnou skupinou. Podobné výsledky boli predtým hlásené23,26. D-gal interaguje s rôznymi voľnými amínmi v proteínovej architektúre prostredníctvom neenzymatickej glykácie, čo vedie k vytvoreniu pokročilých glykačných produktov. Výsledkom je tvorba ROS, ktorá zvyšuje starnutie mozgu prostredníctvom oxidačného poškodenia DNA, lipidov a proteínov. Strata pamäti a zhoršenie učenia vyvolané chronickým podávaním D-gal možno pripísať tvorbe voľných radikálov, čo vedie k narušeniu neurogenézy a v konečnom dôsledku k neurodegenerácii27. Okrem toho sú mozgové neuróny náchylnejšie na oxidačný stres v dôsledku vysokého obsahu lipidov a vyššej spotreby kyslíka26.

Naopak, podávanie metformínu výrazne obnovilo redoxnú rovnováhu. Dôkazy preukázali, že metformín by mohol inhibovať prechodný pór mitochondriálnej permeability (mPTP) a znížiť produkciu ROS a peroxidáciu lipidov28. Preto to naznačuje, že účinok metformínu proti starnutiu môže byť pravdepodobne sprostredkovaný jeho antioxidačnou obranou.

Okrem oxidačného stresu je zápal tiež dôležitým mechanizmom liečby D-gal, ktorý vyvoláva starnutie. D-gal podporuje tvorbu ROS, ktoré aktivujú zápalové dráhy3. Chronický neurozápal a sekrécia prozápalových cytokínov sú charakteristické znaky starnutia29. Existuje zhoda, že zápalové cytokíny sa podieľajú na oxidačnom strese. TNF-, IL-6 a IL-1 sú nevyhnutné pri rozvoji a progresii oxidačného stresu. Tieto cytokíny sú spojené s ROS a aktivujú nukleárny faktor-κB (NF-κB), aby sa premiestnili do jadra a regulovali expresiu prozápalových génov, ako sú iNOS a COX2, ktoré sa podieľajú na zápalových a imunitných odpovediach a následne vedú k fibróza, apoptóza a reakcie akútnej fázy, ktoré spôsobujú poškodenie orgánov30. Vyššie uvedené údaje boli v súlade s našimi výsledkami, pretože hladina TNF-alfa bola významne vyššia a IL-10 bol významne nižší v skupine D-gal v porovnaní s kontrolnou skupinou.

Na druhej strane liečba metformínom viedla k významnému zníženiu zápalových markerov v porovnaní so skupinou D-gal. Protizápalové účinky metformínu možno pripísať aktivácii signalizácie AMPK, ktorá potláča zápalové reakcie prostredníctvom inhibície NF-KB29. Tiež znížil produkciu prozápalových cytokínov a aktiváciu mikroglií v mozgu, čo následne znižuje oxidačný stres30

Aby sme ďalej pochopili molekulárne mechanizmy, ktoré sú základom účinkov metformínu, skúmali sme proteínové expresie AMPK a PI3k. Naša štúdia odhalila, že expresia AMPK bola významne znížená v skupine D-gal v porovnaní s kontrolnou skupinou, zatiaľ čo jej hladina bola významne zvýšená v skupine liečenej metformínom v porovnaní so skupinou D-gal. Predchádzajúce štúdie uviedli, že aktivácia AMPK a citlivosť AMPK sa s vekom znižujú, čo môže vysvetliť zmenenú metabolickú reguláciu, čo vedie k zníženej autofágii a zvýšeniu oxidačného stresu31. Zistilo sa, že metformín aktivuje AMPK zvýšením fosforylácie AMPK na Tr-17232. AMPK je primárnym cieľom metformínu pre jeho ochrannú funkciu proti narušeniu kognície. Ghadernezhad a kol. uviedli, že aktivácia AMPK vyvolaná metformínom viedla k aktivácii dráhy BDNF/P70S6K v hipokampálnych neurónoch, aby sa zvýšila tvorba pamäte pri úlohe pasívneho vyhýbania sa v modeli globálnej cerebrálnej ischémie/reperfúzie potkanov. Aktivácia BDNF má zásadnú úlohu pri regulácii neurokognitívnych funkcií, ako je učenie, pamäť, synaptický prenos a plasticita 33. Niekoľko štúdií preukázalo, že AMPK by mohol pôsobiť ako modulátor dlhodobej potenciácie (LTP) a je potrebný na tvorbu pamäte34 . Zlepšenie pamäte vyvolané metformínom v našej štúdii by preto mohlo byť sprostredkované aktiváciou signalizácie AMPK.

【Ďalšie informácie: david.deng@wecistanche.com / WhatApp:{0}}】