MikroRNA vo vývoji a chorobách obličiek Ⅱ

Vývoj obličiek

Theobličky cicavcov(alebo metanefros) je životne dôležitý orgán, ktorý hrá rozhodujúcu úlohu vvylučovanie splodín metabolizmu,regulácia objemu extracelulárnej tekutiny, audržiavanie elektrolytuaacidobázická homeostáza. Okrem toho obličky produkujú dôležité hormóny, ako naprerytropoetín, kalcitriol,renin, aprostaglandíny(48). Funkčná kapacita obličiek koreluje s počtom funkčných nefrónov, ktoré sa vytvoria počas vývoja obličiek pred narodením, tiež nazývané nefrónové vybavenie. Každá ľudská oblička obsahuje v priemere 1,000,000 nefrónov, hoci tento počet sa značne líši, pričom odhady sa pohybujú od 200,000 do 2,000,{{8 }} nefrónov (49, 50). sstarnutie,strata funkčnej rezervy nefrónudochádza v priebehu času (51, 52); preto je nízka zásoba nefrónov pri narodení spojená so zvýšeným rizikom rozvoja hypertenzie a chronického ochorenia obličiek (CKD) v neskoršom veku (53–55). Okrem toho CAKUT, ktorý vedie k zníženiu zásob nefrónov a funkcie nefrónov, je hlavnou príčinou zlyhania obličiek u detí, čo má za následok významnú morbiditu a mortalitu spojenú s transplantáciou a dialýzou (56, 57). Lepšie pochopenie bunkových a molekulárnych mechanizmov, ktoré sú základom stanovenia počtu nefrónov a normálnej tvorby nefrónov, teda poskytuje pohľad na nové spôsoby predpovedania, prevencie a liečby detského ochorenia obličiek.

AKO DLHO TRVÁ, KÝM CISTANCHE PRACUJE U PACIENTOV S OCHORENÍM OBLIČIEK?

Metanefrický vývoj obličiekzačína okolo embryonálneho dňa 10,5 (E10,5) u myší a okolo piateho týždňa gravidity u ľudí (58). V reakcii na indukčné signály z metanefrického mezenchýmu sa ureterický pupen rozprestiera od kaudálneho konca Wolffovho kanálika a invaduje do susedného mezenchýmu (obrázok 2). Súčasne morfogény vychádzajúce z ureterického pupenu vyvolávajú kondenzáciu metanefrického mezenchýmu za vzniku čiapočkového mezenchýmu (tiež nazývaného progenitory nefrónov) okolo špičiek ureterického pupene. Ako nefrogenéza postupuje, ureterický pupeň prechádza postupnými cyklami vetvenia, predlžovania a diferenciácie, aby sa vytvorili zberné kanáliky obličky. Subpopulácia progenitorov nefrónov prechádza mezenchymálno-epiteliálnym prechodom za vzniku obličkových vezikúl, ktoré sa po polarizácii a predĺžení stanú telesnými štruktúrami v tvare čiarky a S. Nakoniec sa distálna časť tela v tvare S spojí so zberným kanálom a vytvorí funkčný nefrón (59–61). Telo v tvare S prechádza ďalšou diferenciáciou, aby sa vytvorili zrelé bunkové typy nefrónu, okrem zberného kanálika. Foxd{13}} stromálne progenitorové bunky susedia s progenitormi nefrónov vo vonkajšej kortikálnej alebo nefrogénnej zóne vyvíjajúcej sa obličky (obrázok 2) (62). Predpokladá sa, že signály z kortikálnej strómy inhibujú expanziu progenitorových buniek nefrónu a stimulujú ich diferenciáciu, pretože ablácia renálnej strómy má za následok zhoršenú diferenciáciu progenitorov nefrónu (63). Foxd{17}} progenitorové bunky vedú k vzniku všetkých stromálnych buniek v metanefrickej obličke, vrátane renálnych kortikálnych a medulárnych intersticiálnych buniek, pericytov, perivaskulárnych fibroblastov, mezangiálnych buniek a buniek hladkého svalstva ciev (64, 65). Poruchy v ktoromkoľvek kroku tohto procesu môžu viesť k CAKUT, hlavnej príčine detského CKD (66, 67).

Zrelý nefrón sa skladá z glomerulu, ktorý funguje ako filtračná jednotka, a tubulárneho zadného sorpčného oddelenia, ktoré je rozdelené na proximálny stočený tubul, Henleho slučku, distálny stočený tubul a zberný kanál (obrázok 2). Filtračná bariéra glomerulu (ktorá zahŕňa fenestrovaný endotel, glomerulárnu bazálnu membránu, výbežky chodidiel a štrbinové diafragmy podocytov) umožňuje filtráciu plazmy a malých rozpustených látok, pričom selektívne zadržiava v krvi proteíny ako albumín a imunoglobulíny (68, 69). Medzitým je tubulárny reabsorpčný priestor zodpovedný za udržiavanie homeostázy vody, reabsorpciu rozpustených látok (vrátane sodíka, draslíka, vápnika, fosforu, horčíka, glukózy a mnohých ďalších) a vylučovanie kyselín a iných odpadov.

MiRNA vo vyvíjajúcej sa obličke

V štúdiách na podmienených transgénnych myšiach sa miRNA ukázali ako kritické regulátory morfogenézy obličiek vo viacerých bunkových líniách. Počiatočné štúdie hodnotiace funkčnú úlohu miRNA pri vývoji obličiek využívali podmienenú deléciu Dicera (70) v rôznych obličkových líniách. Je však tiež známe, že Dicer má úlohy nezávislé od miRNA (71), čo skomplikovalo interpretáciu týchto modelov. Podmienená delécia Dicera v ranom metanefrickom mezenchýme alebo progenitoroch nefrónov vedie k zvýšenej apoptóze progenitorov nefrónov, zvýšeným hladinám proapoptotického proteínu Bim a predčasnému zastaveniu nefrogenézy (72–75) (tabuľka 1). Je zaujímavé, že strata expresie Bim v progenitoroch nefrónu s deficitom Dicera znižuje apoptózu a čiastočne obnovuje tvorbu nefrónov. Dve miRNA exprimované v progenitoroch nefrónov, miR-17 a miR-106, boli identifikované ako supresory expresie BIM (76). Tieto zistenia spoločne naznačujú, že miRNA riadia rovnováhu medzi prežitím a apoptózou v progenitoroch nefrónov, aby sa zabezpečila tvorba správneho počtu nefrónov počas nefrogenézy.

Obrázok 2. Schematické znázornenie štádií vývoja metanefrickej obličky. Signály z ureterického pupenu spúšťajú kondenzáciu metanefrického mezenchýmu, aby sa vytvorila čiapočka progenitorov nefrónu (mezenchým čiapky) okolo špičiek ureterických pupenov. Mezenchým uzáveru prechádza mezenchymálno-epiteliálnym prechodom za vzniku obličkových vezikúl, ktoré sa postupne vyvíjajú do teliesok v tvare čiarky a S. Tieto štruktúry sa spájajú so stopkou ureterického púčika, z ktorej vzniká zberný kanál. Bunky v proximálnej doméne tela v tvare S sa diferencujú na špecializované epitelové bunky zrelého obličkového telieska (tj podocyty a bunky Bowmanovho puzdra), zatiaľ čo bunky v strednej a distálnej časti sa diferencujú na tubulárne segmenty nefrónu (proximálne tubuly , Henleove slučky a distálne tubuly). Vytvorené pomocou BioRender.com.

Podmienená delécia Dicera v línii ureterických pupenov vedie k spektru abnormalít, ktoré silne pripomínajú CAKUT, vrátane renálnej dysplázie a vývoja cýst zberných kanálikov (73, 77, 78). Predčasné ukončenie morfogenézy vetvenia (ako odpoveď na zníženú expresiu Wnt11 a c-Ret z ureterického pupene) je pravdepodobne hlavným faktorom, ktorý prispieva k dysplázii obličiek (73). Začiatok tvorby cýst sa vyskytuje okolo E15,5 a je spojený s defektmi v dĺžke primárnych mihalníc, zvýšenou apoptotickou bunkovou smrťou a nadmernou bunkovou proliferáciou (73). Keďže Dicer má v bunke dôležité úlohy nezávislé od miRNA, použila sa podmienená delécia Dgcr8 na potvrdenie, že fenotypy pozorované v podmienených modeloch Dicer-knockout sú skutočne výsledkom straty miRNA. U zvierat s deléciou Dgcr8 v distálnom nefrone a derivátmi zberného kanálika sa vyvinie hydronefróza a cysty zberného kanála (79), fenotyp podobný CAKUT, ktorý sa podobá strate aktivity Dicer v línii ureterických pupenov.

Štúdie z dvoch nezávislých skupín preukázali, že ablácia Dicera z Foxd{0}} renálnej stromatickej línie a jej derivátov vedie k spektru renálnych anomálií s konzistentnými zisteniami týkajúcimi sa hypoplastických obličiek, zníženého počtu glomerulov, abnormálneho glomerulárneho dozrievania a defektných ciev vzorovanie (80, 81). Hoci obe skupiny opísali do značnej miery zhodné fenotypy pomocou podobných myších modelov, zaznamenali sa dva odlišné rozdiely. Nakagawa a kol. pozorovali nedostatok vnútornej drene a papily, ako aj pokles nefrogénnej zóny (80). Na rozdiel od toho Phua a kol. ukázali expanziu populácie progenitorov nefrónov a zachovali renálnu papilu (81). Nakagawa a kol. navrhol, že tieto defekty súvisia s narušením signalizácie Wnt dráhy, čo vedie k zmenám v migrácii a proliferácii stromálnych buniek v dôsledku zníženia regulácie miRNA stromálnych buniek, miR-214, miR-199a{{7 }}p a miR-199a-3p (80). Štúdia Phua a kol. naznačili, že zmeny v apoptotických programoch (vrátane zvýšenej expresie efektorových génov Bim a p53) prispievajú k fenotypovým defektom (81). Je možné, že rozdiely v genetickom pozadí a/alebo účinnosť rekombinácie sprostredkovanej Cre môžu byť zodpovedné za rozdiely, ktoré tieto štúdie opisujú. Opísané fenotypy sú však v súlade so známymi mnohostrannými úlohami renálnej strómy pri vývoji obličiek a mechanizmy, ktoré sú základom týchto fenotypov, sú pravdepodobne zložité vzhľadom na povahu delécie Dicer. Na lepšie definovanie regulačných mechanizmov v hre sú potrebné ďalšie štúdie skúmajúce špecifické miRNA v rôznych stromálnych subpopuláciách.

Novšia práca sa zaoberala otázkou funkcie špecifických miRNA vo vyvíjajúcich sa progenitoroch obličiek a nefrónov. Použitím modelu ľudských embryonálnych kmeňových buniek Bantounas et al. ukázali, že inhibícia klastra miR{0}}a~214 má za následok dysmorfné glomeruly, aberantné proximálne tubuly, zníženú expresiu WT1 a zvýšenie intersticiálnych kapilár v organoidoch podobných obličkám (82). Je zaujímavé, že globálna delécia miR-210 reagujúceho na hypoxiu vedie k deficitu nefrónu špecifického pre mužov (83). Napríklad podmienená delécia klastra miR-17~92 v progenitoroch nefrónov a ich derivátoch u myší zhoršuje proliferáciu progenitorových buniek a znižuje počet vyvíjajúcich sa nefrónov. V dôsledku toho sa u mutantných myší rozvinie proteinúria, renálna fibróza a zhoršená funkcia obličiek (84). Dysregulované hladiny cieľového génu miR-17~92, CFTR, sa podieľajú na defektnej proliferácii progenitorových buniek a zníženej výbave nefrónov v tomto myšacom modeli (85).

Malé sekvenovanie RNA (smRNA-Seq) sa čoraz viac používa na profilovanie vzorov expresie miRNA a na objavovanie nových druhov miRNA. smRNA-Seq nefrogénnych mezenchymálnych buniek E15.5 identifikovalo 162 anotovaných miRNA, ktoré sú odlišne exprimované v tejto bunkovej populácii v porovnaní s celými obličkami a 49 novými druhmi miRNA (86). Je zaujímavé, že hladiny miRNA rodiny miR-200 boli významne znížené v progenitoroch nefrónov. Vzhľadom na to, že členovia rodiny miR -200 sú kľúčovými regulátormi mezenchymálno-epiteliálneho prechodu v zbernom kanáli (87), predpokladáme, že ich expresia môže byť prísne regulovaná, aby sa zabezpečila normálna epiteliálna diferenciácia progenitorov nefrónov počas vývoja obličiek.

Funkcia miRNA v zrelom nefróne

Okrem svojej požiadavky počas vývoja obličiek regulujú miRNA početné biologické procesy v hlavných bunkových líniách, ktoré tvoria zrelý nefrón (69, 88–91). V súlade s tým bola opísaná segmentovo špecifická expresia miRNA pozdĺž nefrónu, vrátane miR-143 a miR{5}}a v glomerule, miR{6}} a miR{{7} }a v proximálnom tubule, miR-193 a miR{9}}a v hrubej vzostupnej končatine, miR-874 a miR-155 v distálnom stočenom tubule a miR{{ 12}c v zbernom potrubí (87). Okrem toho funkčné štúdie v kompartmentoch zrelého nefrónu podporujú odlišné úlohy miRNA.

Myši, ktorým v podocytoch chýba Dicer alebo Drosha, vykazujú výraznú proteinúriu, glomerulosklerózu a rýchlu progresiu k zlyhaniu obličiek, sekundárne k porušeniu bariéry glomerulárnej filtrácie (90–93). In silico analýzy odhalili, že rôzne upregulované transkripty v mutantných glomeruloch obsahujú cieľové sekvencie pre členov miR-30 rodiny. Ako všetci štyria členovia rodiny miR-30 (miR-30c-1, miR-30b, miR-30d a miR-30c{ {9}}) sú normálne vysoko exprimované v podocytoch, tieto miRNA môžu byť zodpovedné za abnormality podocytov a narušenie glomerulárnej filtračnej bariéry u mutantných myší (91).

Trochu prekvapivo, delécia Dicera z postnatálnych cicavčích proximálnych tubulov neovplyvňuje vývoj obličiek, histológiu alebo funkciu, ale chráni pred renálnou ischémiou/reperfúznym poškodením. Mutantné myši vykazujú lepšiu funkciu obličiek, znížené poškodenie obličiek, nižšiu tubulárnu apoptózu a lepšie prežitie v porovnaní s ich súrodencami WT (94). To pravdepodobne odráža „súčet“ účinku delécie viacerých miRNA v proximálnom tubule, keďže iná práca odvtedy preukázala, že expresia špecifických miRNA je ochranná pri renálnej ischémii/reperfúznom poškodení (napr. miR-16 a miR -21; zatiaľ čo iné sú škodlivé (napr. miR-182; ref. 97).

Hoci sa miRNA zdajú byť pre funkciu proximálneho tubulu nepostrádateľné, sú nevyhnutné pre distálne nefróny a homeostázu zberných kanálikov (79, 88, 98). Zhromažďovanie kanálovo špecifickej inaktivácie Dicera a iných kritických génov spojených s biogenézou miRNA (vrátane Dgcr8, Ago1, 2, 3 a 4) spôsobuje zlyhanie obličiek u dospelých myší v dôsledku progresívnej tubulointersticiálnej fibrózy a intersticiálneho zápalu (88). Tomu predchádza čiastočný epiteliálno-mezenchymálny prechod (EMT) zberu buniek kanálikov a downregulácia členov rodiny miR-200, ktoré inhibujú EMT (88). Podobne ablácia Dicera alebo Dgcr8 z derivátov distálneho nefrónu a ureterických pupenov má za následok renálne abnormality a zlyhanie obličiek (78, 98), ktoré sú v konečnom dôsledku spojené s downreguláciou členov rodiny miR-200 (98). Zvýšená expresia miR-200 cieľového génu Pkd1 u týchto mutantných myší narúša tubulogenézu a vytvára cysty podobné štruktúry (98). Tieto rozdiely v požiadavke na funkčné miRNA v proximálnych tubuloch a distálnom nefróne/zbernom kanáliku možno vysvetliť segmentálnou distribúciou miRNA pozdĺž dĺžky nefrónu a zberného kanála v obličkách WT (88).

Delécia Dicera v bunkách vylučujúcich renín v juxtaglomerulárnom aparáte má za následok deficit juxtaglomerulárnych buniek, znížené hladiny cirkulujúceho renínu s následným znížením arteriálneho krvného tlaku, zníženú funkciu obličiek, pruhovaný vzor intersticiálnej fibrózy a vaskulárne abnormality (89). Zníženie počtu juxtaglomerulárnych buniek naznačuje potrebu zrelých miRNA pri udržiavaní ich fenotypu. Neskôr boli miR-330 a miR{3}}b{4}}p identifikované ako potenciálni kandidáti, ktorí buď inhibujú alebo podporujú fenotyp hladkého svalstva juxtaglomerulárnych buniek (99).

Ďalšie aktívne oblasti výskumu miRNA pri akútnom poškodení obličiek (8–10), polycystickom ochorení obličiek (11) a transplantácii obličky (10) boli komplexne riešené v iných nedávnych prehľadoch.

MiRNA pri ochoreniach obličiek u detí V tejto časti poskytujeme prehľad o úlohe miRNA pri vývojových ochoreniach obličiek, vrátane CAKUT a Wilmsových nádorov. CAKUT patrí medzi najčastejšie formy malformácií pri narodení, postihuje približne 3–7 z 1000 živonarodených detí (100). Narušenie vývoja obličiek a dolných močových ciest vedie k širokému spektru klinických prejavov pozorovaných pri CAKUT, vrátane anomálií obličiek (tj renálnej agenézy, renálnej hypoplázie a dysplázie a multicystických dysplastických obličiek), ureteropelvických anomálií (tj obštrukcie ureteropelvického spojenia), duplexný zberný systém a anomálie močového mechúra a močovej trubice (101–103). Táto fenotypová heterogenita je pravdepodobne spôsobená komplexnými interakciami medzi genetickými, epigenetickými a / alebo prenatálnymi faktormi prostredia, ktoré ovplyvňujú vývoj obličiek a dolných močových ciest, čo vedie k CAKUT (101). Väčšina našich súčasných poznatkov o patogenéze CAKUT pochádza z myších modelov a syndrómových foriem CAKUT. Tieto štúdie viedli k identifikácii niekoľkých génov CAKUT, z ktorých mnohé sa podieľajú na ranom vývoji obličiek, vrátane PAX2, SALL1, HNF1B, EYA1, GATA3, RET, WNT4, GDNF, SIX1, SIX2 a ďalších (101, 104, 105). Jednotlivé mutácie alebo varianty počtu kópií v génoch kódujúcich proteín však nevysvetľujú väčšinu prípadov CAKUT (~ 80 %) (101, 106).

Ako je uvedené vyššie, deplécia zrelých miRNA z rôznych bunkových línií vyvíjajúcej sa obličky na myších modeloch vedie k renálnym abnormalitám, ktoré napodobňujú ľudský CAKUT (73, 74, 78, 79). Okrem toho zárodočné delécie MIR17HG, ktorý kóduje klaster miR-17~92, spôsobujú u ľudí Feingoldov syndróm typu 2 (107). Hoci renálny fenotyp u pacientov s Feingoldovým syndrómom typu 2 s mutáciami MIR17HG zostáva nedefinovaný, 18% výskyt CAKUT bol hlásený v prípadoch Feingoldovho syndrómu spojených s mutáciami MYCN (108, 109). Tieto pozorovania spoločne naznačujú, že mutácie v miRNA exprimované počas vývoja obličiek môžu spôsobiť CAKUT u ľudí, najmä preto, že veľa miRNA je medzi myšami a ľuďmi vysoko konzervovaných.

Na overenie tejto hypotézy jedna štúdia skúmala 1248 pacientov s nesyndromickým CAKUT z 980 rodín a hľadala mutácie v 96 oblastiach kmeňových slučiek 73 génov miRNA pre vývoj obličiek (106). V rámci tejto kohorty bolo identifikovaných 31 jedincov so 17 rôznymi jednonukleotidovými variantmi ovplyvňujúcimi 16 rôznych miRNA génov. Spomedzi nich sa zistilo, že dva nové varianty miRNA sú potenciálne patogénne. MIR19B1 (člen klastra miR-17~92) bol spojený s prítomnosťou agenézy pravej obličky a MIR99A bol spojený s ťažkým vezikoureterálnym refluxom a ptózou obličiek. Tento prekvapivo nízky počet kandidátskych patogénnych variantov je čiastočne spôsobený obmedzeniami tejto štúdie, pretože analýza zohľadňovala iba mutácie v génoch miRNA, ktoré boli zahrnuté v prístupe kandidátskych génov a nezistili variácie počtu kópií a veľké preskupenia DNA (106) .

V alternatívnom prístupe boli segmenty močovodu od pacientov s rôznymi CAKUT analyzované na rozdielnu expresiu transkriptov prostredníctvom mikročipu, na prítomnosť bioinformaticky predpovedaných cieľov miRNA a zrelých miRNA prostredníctvom qPCR (110). Pomocou tohto mnohostranného prístupu bolo identifikovaných sedem miRNA s potenciálnymi úlohami v CAKUT a medzi nimi sa u pacientov s CAKUT významne zvýšil has-miR-144. Analýza génovej ontológie ukázala, že predpokladané cieľové gény has-miR{4}} prispievajú k biologickým procesom zapojeným do vývoja CAKUT, vrátane vývoja trubice (22 cieľových génov), vývoja urogenitálneho systému (18 cieľových génov), vývoja obličiek (14 cieľových génov) a vývoj embryonálnych orgánov (18 cieľových génov) (110).

Na definovanie molekulárnych mechanizmov, ktoré sú základom patogénnych úloh miRNA v CAKUT, sú potrebné ďalšie štúdie. Zistenia z takýchto štúdií budú rozhodujúce pre zlepšenie starostlivosti o pacientov s CAKUT a prevenciu ich progresie do CKD, poskytovanie vhodného genetického poradenstva pre pacientov a ich rodiny a vývoj nových terapeutických stratégií.