MiR{0}}p zlepšuje regeneráciu svalov a zmierňuje starnúce svaly a svalovú dystrofiu

Ak chcete získať ďalšie informácie, kontaktujte oscar.xiao@wecistanche.com

Experimenty s parabiózou naznačujú, že v krvi cirkulujú molekulárne faktory súvisiace s omladzovaním a starnutím. Tu ukazujeme, že miR-199-3p, ktorý cirkuluje v krvi ako bezbunková miRNA, je v krvi starých myší výrazne znížený v porovnaní s mladými myšami; a miR{2}}p má schopnosť na zlepšenie myogénnej diferenciácie a regenerácie svalov. Podávanie miR-199 napodobenín, ktoré dodávajú miR-199-3p, starým myšiam viedlo k hypertrofii svalových vlákien a oneskorenej strate svalovej sily. Systémové podávanie miR-199 napodobenín mdx myšiam, dobre známeho zvieracieho modelu Duchennovej svalovej dystrofie (DMD), výrazne zlepšilo svalovú silu myší. Celkovo vzaté, miR{8}}p bez buniek v krvi môže mať účinok proti starnutiu, ako je ahypertrofický účinok na staré svalové vlákna, a mohol by mať potenciál ako nové RNA terapeutikum pre DMD, ako aj choroby súvisiace s vekom. Zistenia nám poskytujú nový pohľad na miRNA cirkulujúce v krvi ako molekuly súvisiace s vekom.

Ak chcete vedieť viac, kliknite sem

Životné funkcie, ako je svalová sila, činnosť nervového systému, dýchacie funkcie, obrana proti infekciám a odolnosť proti chorobám, sa starnutím znižujú. Choroby a dysfunkcie spojené s takýmto funkčným poklesom narastajú a stávajú sa hlavnými problémami v starnúcich spoločnostiach. So starnutím dochádza v tele k rôznym zmenám, ako sú metabolické zmeny a zmeny génovej regulácie-3; a štúdium takýchto zmien môže pomôcť pochopiť starnutie a poskytnúť stratégie na riešenie problémov, ktorým čelia starnúce spoločnosti. Biomolekuly (vrátane génov) súvisiace so starnutím boli identifikované a môžu byť užitočné pri výskume starnutia; napr. expresia -galaktozidázy a plolnk4a je spojená s bunkovým starnutím4-6 a myšací model, ktorému chýba gén klotho, je známy ako model starnutia s množstvom fenotypov, ktoré sa podobajú predčasnému starnutiu človeka.

Parabióza je spojenie medzi dvoma jedincami, ktorí zdieľajú spoločný cievny systém, a možno ju vytvoriť experimentálne operáciou8. Experimenty s parabiózou, pri ktorých boli mladé a staré hlodavce spojené, aby zdieľali spoločný cievny systém, ukázali, že proces starnutia u mladých zvierat sa zrýchlil, zatiaľ čo staré zvieratá boli omladené9-12. Zistenia silne naznačujú, že určité faktory súvisiace s omladzovaním a starnutím sú prítomné a cirkulujú s krvou v cievnom systéme; takéto cirkulujúce faktory však ešte nie sú úplne pochopené3.

Cistanche môže proti starnutiu

MikroRNA (miRNA) sú 21-23-nukleotidové malé nekódujúce RNA, ktoré sú spracované z dlhších transkriptov (primárnych miRNA) štiepením, s mikroprocesorovým komplexom v jadre a Dicer v cytoplazme a začlenené do RNA-indukovaný silencing complex (RISC)14,15.MiRNA v RISC funguje ako mediátor pri umlčaní génov, kde je inhibovaná translácia messengerových RNA (mRNA), ktoré majú čiastočnú komplementaritu k miRNA, alebo sú mRNA nesúce takmer komplementárne sekvencie k miRNA digestedl4,15.Cistanche Extract Anti RadiationMiRNA teda hrajú dôležitú úlohu v génovej regulácii potlačením expresie ich cieľového génu. Tisíce miRNA génov boli nájdené u zvierat a rastlín [pozri databázu microRNA (miRBase): http://www.mirbase.org/index.shtml]. Expresný profil miRNA bol skúmaný a bola zistená expresia miRNA špecifická pre tkanivo a vývojové štádium a expresia miRNA spojená s ochorením6-21. Génová regulácia zahŕňajúca miRNA úzko súvisí s rôznymi vitálnymi funkciami a životnými javmi vrátane chorôb14,16,21-24

MiRNA sú prítomné vonku, ako aj vo vnútri buniek25. Napríklad miRNA sú prítomné v krvi ako bezbunkové nukleotidy a cirkulujú v cievnom systéme2627. Takéto bezbunkové miRNA (cf-miRNA) sú začlenené do malých vezikúl nazývaných extracelulárne vezikuly alebo spojené s proteínmi, čím získavajú ochranu pred extracelulárnymi nukleázami25,28. Prítomnosť niektorých cf-miRNA môže byť významná; boli napríklad zistené významné asociácie medzi cf-miRNA a určitými chorobami26,27,29-31. Cf-miRNA môžu odrážať zmeny vo fyzickom stave; teda takéto miRNA môžu byť potenciálnymi biomarkermi na monitorovanie systémov udržiavania života, ako aj chorôb.

Táto štúdia sa uskutočnila na preskúmanie asociácií medzi cf-miRNA a starnutím a skúmali sa cf-miRNA v krvi mladých a starých myší. Výsledky odhalili zmeny v cf-miRNA medzi krvou mladých a starých myší. Medzi takýmito miRNA bola miR-199-3p výrazne znížená v krvi staršej generácie v porovnaní s krvou mladej krvi. Je zaujímavé, že miR-19-3p má schopnosť zvýšiť svalovú diferenciáciu a regeneráciu a jeho podávanie starším myšiam viedlo k expanzii svalových vlákien. Keď bol miR-199-3p zavedený do mdx myší, zvieracieho modelu Duchennovej svalovej dystrofie (DMD), svalová sila myší sa výrazne zlepšila. Táto štúdia poskytuje nové poznatky o cf-miRNA cirkulujúcich v krvi, pokiaľ ide o starnutie, latentnú schopnosť a lekárske aplikácie.

Výsledky

Cell-free miRNAs in the blood of young and aged mice. We investigated cf-miRNAs in the blood of young (6-week-old) and aged (>23-mesačné) myši C57BL/6J pomocou DNA microarray na identifikáciu rozdielov súvisiacich s vekom. Profil cf-miRNA vykazoval výrazné rozdiely medzi mladými a starými myšami, tj boli detegované cf-miRNA, ktoré sú zaujaté voči krvi mladých a starých myší (tabuľka 1). Z takýchto miRNA boli myogénne miRNA (napr. miR-1 a miR-133)1833 prítomné v skupine miRNA, ktorá je hojná v mladej krvi; inými slovami, myogénne miRNA boli v staršej krvi výrazne menej (tabuľka 1).cistanche herbaRozdiel v miRNA medzi mladou a starou krvou bol potvrdený kvantitatívnou reverznou transkripčno-polymerázovou reťazovou reakciou (qRT-PCR; obr. la) a ďalej reprodukovaný pomocou zdrojov RNA extrahovaných z malých vezikúl, tzv. exozómov, izolovaných z plazmy ( Doplnkový obr. 1).

Experimenty s bunkovou kultúrou na druhej strane odhalili, že sérum mladých myší malo schopnosť vyvolať myogénnu diferenciáciu a táto schopnosť bola silnejšia ako u starých myší (obr. 1b). Skúmal sa inzulínu podobný rastový faktor I (IGF-I), ktorý je hlavným faktorom schopným vyvolať myogénnu diferenciáciu v krvi34,35; nebol však pozorovaný žiadny významný rozdiel medzi krvou mladej a staršej krvi (obr. lc). V myogénnej diferenciácii sa teda môžu podieľať aj iné faktory ako IGF-I v mladej krvi.

miR-199-3p je schopný silne indukovať myogénnu diferenciáciu. Skúmali sme účinky miRNA hojných v mladej krvi na myogénnu diferenciáciu. Syntetické mimetiká miRNA sa zaviedli do buniek C2C12, myoblastovej bunkovej línie myší, a skúmala sa expresia myogénnych diferenciačných markerov, génov myogenínu (Myog) a ťažkého reťazca myozínu 1 (Myh1). Výsledky boli neočakávané a zaujali nás: miR-199-3p, ktorý bol predpovedaný ako negatívna miRNA kvôli malým informáciám o myogénnej diferenciácii, výrazne indukoval expresiu Myog a Myh1 (obr. 2a, b). Okrem toho, indukcia miR-199-3p bola silnejšia ako indukcia konvenčných myogénnych miRNA: expresia ťažkého reťazca myozínu v prítomnosti miR-199-3p bola obzvlášť pozoruhodná (obr. 2b, c).

Aby sme objasnili vzťah medzi miR-199-3p a myogénnou diferenciáciou, skúmali sme bunkové a extracelulárne (exozomálne) miR-199-3p počas myogénnej diferenciácie a tiež účinky inhibítorov miR{3}}p o diferenciácii. Expresia endogénneho (bunkového) miR-199-3p bola zvýšená po iniciácii diferenciácie. Exozomálny miR-19-3p sa zvýšil raz a potom sa znížil (doplnkový obrázok 2a). Liečba inhibítorom potlačila expresiu myogénnych diferenciačných markerov, Myog, Myh1 a kreatínkinázy (Ckm) (doplnkový obrázok 2b).rast penisu cistancheZistenia teda naznačujú, že miR-199-3p sa podieľa na myogénnej diferenciácii.

Navrhovanie miR-199 napodobenín. Napodobeniny miR-199 sme navrhli tak, aby tieto napodobeniny mohli účinne produkovať miR-199-3p ako funkčný mediátor (vodiace vlákno) pri umlčaní génov. Navrhnuté napodobeniny miRNA sa skrínovali a miR199#4 sa vybral ako kompetentný miR-199 napodobenina (doplnkový obrázok 3). Následne sa miR199#4 použil v experimentoch in vivo aj in vitro.

Cieľové gény miR{0}}p v myogénnej diferenciácii. Na identifikáciu cieľových génov pre miR-199-3p pod myogénnou diferenciáciou sme hľadali kandidátne gény z databázy TargetScan a zamerali sme sa na gény Lin28b a Suz12, z ktorých oba sú exprimované v myoblastoch C2C12. Lin28b a Suz12 majú predpokladané miR-199-3p väzbové sekvencie vo svojej 3'netranslatovanej oblasti (UTR; Obr. 3a). Ukázali sme, že predpokladané sekvencie sú autentickými väzbovými miestami pre miR-19-3p, pomocou luciferázových reportérových génov nesúcich väzbové sekvencie a zodpovedajúce nesprávne spárované sekvencie (obr. 3a, b). Luciferázové gény nesúce predpokladané väzbové sekvencie boli významne potlačené miR-199-3p [pLin28b-(81), pLin28-(983) a pSuz12-(973)], zatiaľ čo nesprávne spárované sekvencie, ktoré majú substitučné mutácie báz v oblasti semena [pLin28b-(81)mut, zrušili jeho supresívny účinok [pSuz12-(973)mut]. pLin28-(983)mut, a keď boli do buniek C2Cl2 zavedené mimikry miR{29}}, expresia Lin28b a Suz12 bola konzistentne potlačená (obr. 3c). Na posúdenie, či supresia Lin28b a/ alebo Suz12 priamo prispieva k myogénnej diferenciácii, špecifická inhibícia Lin28b a Suz12 sa uskutočnila génovým umlčaním pomocou RNA interferencie (RNAi; Obr. 3d, e). Ako sa očakávalo, expresia myo-génnych diferenciačných markerov, ako sú Ckm, Myh1 a Myog, bola upregulovaná pri umlčaní génov Lin28b a Suz12 (obr. 3f, g).

Keďže Lin28b je proteín viažuci RNA zapojený do spracovania miRNAs3637, skúmali sme účinky miR-19 napodobenín prostredníctvom Lin28b na myogénne spracovanie miRNA. Hladina miR-1, hlavnej myogénnej miRNA, bola skúmaná, pretože spracovanie jej prekurzora je regulované Lin28b37. Vyzretý miR-1 bol významne zvýšený miR-199 mimickou liečbou (obr. 3h), čo naznačuje, že miR{11}}p môže regulovať funkčnú expresiu miR-1 prostredníctvom supresie svojho cieľa Lin28b. Celkovo vzaté, zistenia naznačujú, že miR-199-3p sa podieľa na myogénnej diferenciácii prostredníctvom potlačenia svojich cieľových génov, Lin28b a Suz12.

Zlepšenie regenerácie svalov pomocou miR199#4 u myší so svalovým poranením.výhody cistanche salsaSkúmali sme účinky miR{0}} mimika (miR199#4) in vivo pomocou modelov svalového poranenia (obr. 4a, b). Osemtýždňovým myšiam C57BL/6J sa injekčne podal BaClz do tibialis anterior (TA), aby sa vyvolalo svalové zranenie, a miR19#4 sa podal na poškodené miesta o 24 hodín neskôr. Dva dni po podaní miR199#4 sa skúmala expresia myogénnych markerových génov. Expresia myog bola významne zvýšená a myogénna diferenciácia 1 (Myod1) a myogénny faktor 5 (Myf5) boli tiež upregulované podávaním miR199#4 (obr. 4c). Údaje sú v súlade s výsledkami in vitro opísanými vyššie (obr. 2).

Imunohistochemická analýza regenerujúcich sa svalov sa uskutočnila 9 dní po podaní miR199#4. Boli skúmané oblasti prierezu regenerujúcich sa svalových vlákien (myofibers), charakterizované centrálnymi jadrami (obr. 4b). Priemerná plocha prierezu regenerujúcich sa svalových vláken ošetrených miR199#4 bola väčšia ako plocha kontrolných svalových vláken ošetrených neumlčujúcim kontrolným duplexom RNA (nsCont; Obr. 4d), pričom rozdiel sa blížil štatistickej významnosti. Okrem priemernej plochy prierezu, veľkostne rozdelený histogram plochy prierezu ukázal zvýšenie zväčšených svalových vlákien v prítomnosti miR199#4 (obr. 4e).

Hypertrofický účinok miR199#4 na staré svalové vlákna. Skúmali sme účinky miR199#4 na staré myši (~ 24 mesiacov staré). Staršie myši vykazovali významný pokles svalovej miR-199-3p (obr. 5a), ako u cf-miR{10}}p v krvnom obehu, v porovnaní s mladými myšami. Podali sme miR199#4 do svalov TA starých myší a o 2 dni neskôr boli svaly TA vyšetrené imunohistochemickou analýzou (obr. 5b). Priemerná plocha prierezu svalových vláken ošetrených miR199#4 bola významne väčšia ako plocha kontrolných svalových vláken ošetrených nsCont (obr. 5c). V súlade s tým analýza histogramu s deleným veľkosťou odhalila výrazné zvýšenie zväčšených svalových vlákien v prítomnosti miR199#4 (obr. 5d).

Keďže krv cirkulujúca cf-miR-199-3p je u starých myší znížená, zaviedli sme miR199#4 do cirkulujúcej krvi starých myší cez chvost. Po intravenóznom podaní miR19#4 sa skúmala a analyzovala plocha prierezu svalových vlákien, ako je opísané vyššie. Výsledky, ako je znázornené na obr. 5e, sú v súlade s výsledkami lokálneho podávania miR199#4 do starých svalov (obr. 5c, d).

Treba poznamenať, že medzi modelom svalového poranenia a starými myšami je rozdiel v zväčšených svalových vláknach. Centrálne jadrá sú viditeľné v regenerujúcich sa svalových vláknach (obr. 4b), ale takéto svalové vlákna boli sotva detegované u starých myší liečených miR199#4 (obr. 5b). To naznačuje, že už existujúce svalové vlákna sa môžu po liečbe miR199#4 zväčšiť u starých myší. Predpokladali sme, že ďalší mechanizmus odlišný od regenerácie svalov by sa mohol podieľať na zväčšení svalových vlákien u starých myší a navrhli sme zapojenie dráhy svalovej atrofie.cistanche tubulosa dávkovanie redditGény Atroginl a MuRFI úzko súvisia so svalovou atrofiou38 a hladiny ich expresie sú výrazne zvýšené vo starých svaloch v porovnaní s mladými svalmi (obr. 6a). Skúmali sme hladinu Atroginlu a MuRFI vo svaloch starých myší po systémovom podaní miR199#4. Atroginl a MuRFI boli výrazne znížené v rôznych svaloch podávaním miR19#4 (obr. 6b), čo naznačuje, že potlačenie dráhy svalovej atrofie pomocou miR199#4 môže spôsobiť expanziu svalových vlákien u starých myší.

MiR199#4 odďaľuje stratu svalovej sily u starých myší. Zaujímavý je účinok miR199#4 na svalovú funkciu u starých myší. Test sily zovretia sa uskutočnil na starých myšiach pred a po systémovom podaní miR199#4. Experiment sa uskutočnil dvojito zaslepeným spôsobom; injekcia RNA a test 100 percentného uchopenia boli vykonané rôznymi experimentátormi bez zdieľania informácií. Samce myší C57BL/6 (80-týždňových) samcov boli testované na úchop, potom o týždeň neskôr im boli intravenózne podané miR199#4 a nsCont a znova boli testované úchop. Zmena svalovej sily po injekcii miR199#4 bola MiR199#4 zlepšuje svalovú silu mdx myší. Keďže miR199#4 má pozitívny vplyv na svaly, uskutočnili sme experiment na posúdenie účinku podávania miR199#4 u mdx myší, dobre známeho zvieracieho modelu DMD32. 8-týždňovým mdx myšiam bola intravenózne podaná injekcia miR199#4 (1,6 mg/kg) dvakrát (1-týždňový interval) a test uchopenia bol vykonaný 1 týždeň po poslednom podaní. Experiment sa uskutočnil dvojito zaslepeným spôsobom, ako je znázornené na obr. Výsledky (obr. 8a) ukazujú významné zlepšenie svalovej sily u mdx myší liečených miR199#4 v porovnaní s mdx myšami liečených nsCont. Okrem toho sa v krvi mdx myší liečených miR199#4 (obr. 8b, c) pozoroval významný pokles aktivity kreatínkinázy (CK) a bezbunkovej miR-1, čo sú možné príznaky ochorenia zlepšenie.

Ako činidlo dodávajúce liečivo je atelokolagén viskózny a ťažko sa s ním manipuluje a myši liečené atelokolagénom zrejme trpia negatívnymi účinkami v dôsledku vehikula. Hľadali sme teda alternatívy k atelokolagénu na zlepšenie nášho systému dodávania liečiv (DDS) a našli sme katiónové lipozómy DC-CHOL/DOPE ako nové DDS činidlo, ktoré je rovnaké alebo lepšie ako atelokolagén (doplnkový obrázok 4). Distribúcia liečiva miR199#4 s katiónovými lipozómami ukázala, že podaný miR19#4 bol dodaný do svalu a konzistentne prijímaný vo veľkých množstvách v pečeni (doplnkový obrázok 5). Extracelulárny miR199#4 dodaný do svalu môže fungovať ako mediátor pri umlčaní génov a prispievať ku génovej regulácii podieľajúcej sa na zlepšení svalovej sily.

Pokúsili sme sa identifikovať biomolekuly súvisiace so zlepšením po podaní miR199#4. Rôzne polypeptidy súvisiace s DMD sa skúmali westernovým prenosom; v tejto štúdii sa však nezistili odlišné signály súvisiace so zlepšením (doplnkový obrázok 6). O tomto bode budeme ďalej diskutovať v nasledujúcej časti.

Diskusia

Biomolekuly sa so starnutím menia kvalitatívne aj kvantitatívne--3. Zachytenie takýchto zmien a ich štúdium sú životne dôležité pre pochopenie starnutia a môžu odhaliť stratégie na riešenie problémov v starnúcej spoločnosti. Štúdie parabiózy, v ktorých sú mladé a staré zvieratá spojené, aby zdieľali spoločný cievny systém, poskytli dôležité poznatky o starnutí a omladzovaní9-l2. Zistenia silne naznačujú, že existujú omladzujúce faktory a faktory starnutia v cirkulujúcej krvi mladých a starších ľudí. Predchádzajúce štúdie uvádzali rôzne molekuly ako kandidátov súvisiacich s omladzovaním a starnutím, ale výsledky sú kontroverzné3.

Naše in vitro experimenty s bunkovou kultúrou s použitím mladých a starých sér sú podobné experimentom s parabiózou (obr. lb) a našli sme miR-199-3p, ktorý sa mení s vekom, v cirkulujúcej krvi; zistilo sa, že miRNA významne klesá v staršej krvi (tabuľka 1 a obr. la). Okrem toho expresia svalového (bunkového) miR-199-3p výrazne klesá vo starších svaloch v porovnaní s mladými svalmi (obr. 5a); teda cf-miR-199-3p v krvi môže korelovať so svalovým miR-199-3p. Zníženie expresie miR-199-3p so starnutím sa pozoruje aj v mezenchymálnych kmeňových bunkách odvodených z kostnej drene makaka rhesus39. Preto môže byť expresia bunkového miR{10}}p pod kontrolou súvisiacou s vekom. Na rozdiel od miR-19-3p, expresia bunkových myogénnych miRNA, ako sú miR-1 a miR-133, zostáva nezmenená v mladých a starších svaloch (obr. 5a), ale úroveň ich extracelulárnych miRNA v krvi je výrazne znížená u starých myší (obr. la). Rozdiel medzi miR-199-3p a myogénnymi miRNA (miR-1 a-133) môže odrážať rozdiel v spracovaní cf-miRNA a/alebo vo vekovej kontrole cf-miRNA medzi nimi . Na objasnenie tohto rozdielu je potrebné v budúcnosti vykonať ďalšie štúdie.

Predchádzajúce štúdie naznačili, že miR-199-3p sa podieľa na rôznych bunkových funkciách a životne dôležitých javoch prostredníctvom supresie svojich cieľových génov; napríklad miRNA môže podporovať proliferáciu a migráciu endotelových buniek a modulovať nástup puberty prostredníctvom downregulácie cieleného semaforínového-3A génu40 a prostredníctvom supresie cieľových génov (Cdc42, Map3k2, Map3k4 a Taok1) zapojený do dráhy p38MAPK41. Táto štúdia zistila, že miR-19-3p sa podieľa na myogénnej diferenciácii prostredníctvom potlačenia cieľových génov Lin28b a Suz12 (obr. 3). Lin28b je proteín viažuci RNA a inhibuje dozrievanie miRNA vrátane miR-1, čo je miRNA špecifická pre svaly a podporuje myogenézu37. Potlačenie Lin28b pomocou miR-19-3p spôsobuje zvýšenie zrelého miR-1 (obr. 3), čo môže umožniť pokračovanie myogénnej diferenciácie.

Suzl2 je jadrová podjednotka polykombového represívneho komplexu 2 (PRC2), ktorý sa podieľa na represii chromatínu42. Génová regulácia PRC2 sa podieľa na udržiavaní kmeňových buniek, embryonálnom vývoji, bunkovej proliferácii a diferenciácii vrátane myogénnej diferenciácie42. PRC2 je prítomný v tichých svalovo špecifických lokusoch, ako je Myog a svalová kreatínkináza (MCK) v nediferencovaných myoblastoch, ale je disociovaný z takýchto lokusov v diferencovaných myotrubiciach43. Umlčanie génu proti Suz12 pomocou RNAi spôsobuje zvýšenie expresie myogénneho génu (obr. 3). Potlačenie zosilňovača proteínu zeste homológ 2 (Ezh2), ďalšej základnej podjednotky PRC2, tiež spôsobuje myogénnu diferenciáciu44. Tieto zistenia naznačujú, že inhibícia tvorby PRC2 v dôsledku potlačenia jej základných podjednotiek môže spustiť vytvorenie genómového stavu pre svalovú diferenciáciu. Potlačenie Suz12 pomocou miR-199-3p teda môže vyvolať myogénnu diferenciáciu. Celkovo možno povedať, že miR-19-3p môže hrať dôležitú úlohu v myogénnej diferenciácii prostredníctvom inhibície dvoch nezávislých dráh zahŕňajúcich Lin28b a Suzl2, z ktorých každá sa podieľa na udržiavaní nediferencovaného stavu myoblastov.

Vplyv miR{0}}p na myogénnu diferenciáciu bol tiež preukázaný in vivo (obr. 4). Poškodenie svalov spúšťa proliferáciu a diferenciáciu buniek v dôsledku regenerácie svalov. Zavedenie miR199#4, ktorý dodáva miR-199-3p, na poškodené miesta zlepšilo regeneráciu svalov a rozšírilo regeneračné svalové vlákna (obr. 4). Expresia myogénneho génu bola pri liečbe miR199#4 konzistentne zvýšená (obr. 4). Z praktického hľadiska môže byť miR199#4 účinný a užitočný pri chirurgickej liečbe.

Keď bol miR199#4 podaný starým myšiam bez miR-199-3p v krvnom obehu, myši vykazovali výrazne expandované svalové vlákna (obr. 5) a oneskorenú stratu svalovej sily starnutím (obr. 7). Expandované svalové vlákna u starých myší sa líšia od regenerujúcich sa svalových vlákien, ktoré sú zväčšené v prítomnosti miR199#4; prvý je odvodený od už existujúcich svalových vlákien a druhý je odvodený od neo-myvlákna (novorodené svalové vlákna). V zväčšovaní svalových vlákien teda existujú rôzne, nezávislé mechanizmy. Naša štúdia naznačuje, že (i) v prvom prípade inhibícia svalovej atrofie v dôsledku potlačenia Atroginlu a MuRFI liečbou miR199#4 spôsobuje zväčšenie starých svalových vlákien a (ii) v druhom prípade potlačenie cieľových génov, Lin28b a Suz12, spôsobuje zväčšenie regeneračných svalových vlákien. Celkovo sa na svalovej hypertrofii v rôznych situáciách môžu podieľať rôzne (viaceré) gény regulované miR-19-3p. Zistenia tiež naznačujú, že miR-199-3p môže mať prinajmenšom účinok proti starnutiu na svaly a že miR199#4 dodávajúci miR{17}}p môže mať potenciál ako nový RNA liek na svalové ochorenia súvisiace s vekom, ako je sarkopénia.

Na základe vysokej účinnosti miR199#4 na svaly sme podávali miR199#4 myšiam mdx, dobre známy model DMD, a získali sme pozoruhodné výsledky: systémové podávanie miR199#4 zlepšilo svalovú silu u myší o ~20 percent ( 8a). Aby sme pochopili mechanizmus obnovy svalovej sily, pokúsili sme sa identifikovať biomolekuly, ktoré boli vylepšené (alebo ovplyvnené) miR-199-3p. S výnimkou zlepšení CK v krvi a cf-miR-1 (obr. 8b, c) sme však takéto zlepšenia nedokázali zistiť na molekulárnej úrovni. Tento problém s detekciou môže byť spôsobený komplexnou bunkovou populáciou, ktorá pozostáva zo zmesi regenerujúcich sa a rozrušujúcich svalových buniek u mdx myší. Aj keď miR199#4 vedie k zlepšeniu, vysoký šum pozadia spôsobený komplexnou bunkovou populáciou by maskoval dôkaz o zlepšení. Na vyriešenie tohto problému je potrebné vykonať rozsiahlejšie štúdie využívajúce homogénnu populáciu svalových buniek odvodenú od mdx myší alebo zamerané na rôzne tkanivá vrátane svalov.

Hoci molekulárny mechanizmus obnovy svalovej sily pomocou miR199#4 zostáva neznámy, dávka miR19#4 na zlepšenie svalovej sily je pozoruhodná. Dvojnásobné podanie ~1,6 mg/kg miR199#4 zlepšilo svalovú silu u mdx myší. Zdá sa, že účinná dávka je nižšia ako pri antisense oligonukleotidoch na preskočenie exónu proti mutantným dystrofínovým génom in vivo45-47. Dôvod, prečo je miR199#4 schopný zlepšiť svalovú silu pri takýchto nižších dávkach, môže byť spôsobený jeho odlišným mechanizmom účinku v porovnaní s antisense oligonukleotidmi. Mechanizmus účinku miR19#4 je katalytické umlčanie génu. Na rozdiel od toho je mechanizmus antisense oligonukleotidov založený na fyzickej hybridizácii. Preto rozdiely vo vhodných dávkach na preukázanie účinnosti lieku možno pripísať rôznym mechanizmom účinku.

Mechanizmus, ktorým orgány, tkanivá alebo bunky uvoľňujú miRNA do cirkulujúcej krvi, ešte nie je úplne objasnený a regulácia uvoľňovania takýchto miRNA súvisiaca s vekom je tiež nejasná. Táto štúdia ukázala, že myogénne cf-miR-NA vrátane cf-miR-199-3p cirkulujú s krvou v cievnom systéme a starnutím sa znižujú. Takéto cf-miRNA môžu byť prítomné v exozómoch, tj sú to exozomálne miRNA.

Myogénne miRNA sa podieľajú na myogénnej diferenciácii, regenerácii svalov a udržiavaní svalovej homeostázy33. Predchádzajúce štúdie uvádzali, že myogénne miRNA, ako napríklad miR-1 a miR{2}}, sa pozorovali v krvi v reakcii na fyzické cvičenie4849. Na základe týchto správ môžu aktívne mladé myši uvoľňovať do krvi viac myogénnych miRNA ako staré pomaly sa pohybujúce myši a takéto extracelulárne miRNA, vrátane cf-miR-199-3p, môžu prispievať k udržaniu svalovej homeostázy u mladých myší prostredníctvom autokrinného pôsobenia . Hladina extracelulárnej (exozomálnej) miRNA však nie vždy koreluje s hladinou bunkovej miRNA a boli pozorované rozdiely v myogénnych miRNA a miR-199-3p medzi mladými a starými myšami (obr. la a 5a) a počas myogénna diferenciácia (doplnkový obrázok 2a). Ako ďalšia možnosť je teda možné, že regulácia tvorby exozómov súvisiaca s vekom a diferenciáciou môže ovplyvniť produkciu cf-miRNA; konkrétne môžu existovať rozdiely v tvorbe exozómov medzi mladými a starými myšami. V kontexte týchto hypotéz je potrebná ďalšia štúdia na objasnenie uvoľňovania myogénnych miRNA do krvi súvisiaceho s vekom.

Okrem mechanizmu uvoľňovania, keď mladé myogénne cf-miRNA obsahujúce cf-miR-199-3p prúdia do starého systému krvného obehu z mladého vaskulárneho systému parabiózou, cf-miRNA môžu spustiť svalovú aktiváciu a inhibíciu svalov atrofia na staršej strane; tento koncept je podporený dôkazmi od starých myší, ktorým bol v tejto štúdii intravenózne injikovaný miR19#4 (obr. 5-7). Cf-miRNA v krvi môžu súvisieť s homeostatickou funkciou súvisiacou s vekom a mohli by predstavovať zmenenú homeostázu. Keď sú takéto cf-miRNA ektopicky prítomné, napríklad keď sú cf-miRNA v mladej krvi prenesené do starnúceho systému krvného obehu, niektoré cf-miRNA môžu vykazovať omladzujúce účinky na starnúcej strane, tj môžu vyvolať účinky proti starnutiu. Na rozdiel od toho, cf-miRNA vo starnutej krvi môžu predstavovať zmenenú homeostázu starnutím. Keď sa takéto cf-miRNA prenesú do systému mladého krvného obehu, niektoré cf-miRNA môžu spustiť zhoršenie súvisiace so starnutím a môžu spôsobiť predčasné starnutie na strane mladých. Cf-miRNA, ktoré sú významne zvýšené v starnutej krvi, predstavujú kandidátov, ktorí budú vyžadovať podrobnú mechanickú analýzu na pochopenie a prevenciu starnutia.

Na záver, naša súčasná štúdia poskytla nový pohľad na cf-miRNA ako molekuly súvisiace s vekom a odhalila nový smer výskumu na objasnenie vzťahu medzi starnutím a funkčnými RNA bez buniek, vrátane cf-miRNA.

Tento článok je prevzatý z COMMUNICATIONS BIOLOGY|(2021) 4:427|https://doi.org/10.1038/s42003-021-01952-2|www.nature.com/commsbio